專利名稱：Vegf-d突變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對VEGF-D的修飾，所述修飾增加其對VEGF受體的活性；及其在治療中 的用途。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)不僅被認(rèn)為是在成年期維持脈管系統(tǒng)的關(guān)鍵生長因 子，還被認(rèn)為是在胚胎發(fā)生過程中誘導(dǎo)血管發(fā)生和淋巴管發(fā)生的關(guān)鍵生長因子。還在若干 病理狀態(tài)如癌癥和視網(wǎng)膜病中發(fā)現(xiàn)了它們的不正常表達(dá)。VEGF-A屬于較大的相關(guān)生長因子 家族，所述家族包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子PIGF，以及來源于口瘡病毒的 VEGF-E蛋白和蛇毒中的多種同源物。人類內(nèi)源性VEGF蛋白家族成員以若干異構(gòu)體形式存 在，這是mRNA的可變剪接的結(jié)果或是由于蛋白水解處理所致。這些變體的血管發(fā)生作用區(qū) 別很大，因?yàn)樗鼈儗θN主要的VEGF受體、共受體例如神經(jīng)菌毛素(neuopilin)、硫酸類肝 素蛋白多糖以及細(xì)胞外基質(zhì)的其他組分的特異性和親和性不同。 VEGFR-2是最重要的調(diào)控血管發(fā)生的受體，其主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動物 VEGFR-2配體包括VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D。除VEGFR-2以夕卜，VEGF-C和VEGF-D也是介導(dǎo) 淋巴管發(fā)生并因此參與到淋巴脈管系統(tǒng)形成的受體VEGFR-3的配體，。VEGF-A還與在胚胎 發(fā)生過程中主要作為非信號傳遞的誘騙受體VEGFR-1結(jié)合。已知這種受體在成年有機(jī)體中 調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移，但其在血管發(fā)生中的作用仍然存在爭議。
由于VEGF家族成為血管發(fā)生調(diào)節(jié)因子的重要性，它們已被建議作為可能的治療 劑以調(diào)節(jié)不同病理狀態(tài)的血管發(fā)生過程(Y投-Herttuala2003)。通過將VEGF直接作為重 組蛋白或使用基因治療載體而引入組織以誘導(dǎo)血管發(fā)生，從而進(jìn)行了體內(nèi)研究(Markkanen 2005)。若干研究的發(fā)現(xiàn)表明，VEGF家族成員在體內(nèi)具有強(qiáng)血管發(fā)生活性，并且它們可 用于治療疾病如下肢缺血和冠狀動脈疾病。除了這些因素以外，還已發(fā)現(xiàn)成熟形式的 VEGF-D (VEGF-DANAG，見下)和VEGF-A最有希望誘導(dǎo)治療性血管發(fā)生。
VEGF與血小板衍生生長因子(PDGF)結(jié)構(gòu)相似并同屬于VEGF/PDGF家族，后者屬于 更大的半胱氨酸結(jié)生長因子超家族。家族成員分都具有在許多細(xì)胞外蛋白中發(fā)現(xiàn)的并在許 多物種中保守的半胱氨酸結(jié)基序。半胱氨酸結(jié)蛋白的性質(zhì)是它們包含一個(gè)通過3個(gè)二硫鍵 連接的反平行P折疊的保守結(jié)構(gòu)。半胱氨酸結(jié)生長因子通常形成二聚體，其在VEGF/PDGF 家族中經(jīng)常通過亞基間二硫鍵連接。 VEGF受體屬于被二聚化激活的受體蛋白酪氨酸激酶。配體的二聚化對VEGFR的 激活是必需的。 一個(gè)VEGF-A二聚體從其兩端分別與兩個(gè)受體單體結(jié)合，從而誘導(dǎo)受體二聚 化，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性?；谌舾煞N通過實(shí)驗(yàn)得到的游離或與VEGF受體形成 復(fù)合體的VEGF家族成員的3D結(jié)構(gòu)，它們具有極其相似的三級結(jié)構(gòu)并因此很可能通過相似 的機(jī)制誘導(dǎo)受體激活。 在所述VEGF家族中，VEGF-C和VEGF-D可再被細(xì)分為其各自的子家族，這表現(xiàn)在 其與其它VEGF相比時(shí)具有更高的一級序列結(jié)構(gòu)相似性。存在若干特征性性質(zhì)，包括l)它們是結(jié)合VEGFR-3-淋巴管發(fā)生介導(dǎo)受體的唯一 VEGF ;2)與VEGF-A、 VEGF-B和PLGF相
比，VEGF-C和VEGF-D以長前體蛋白的形式表達(dá)。這些形式的受體結(jié)合親和性很弱，并且， 為轉(zhuǎn)變?yōu)楦谢钚缘纳L因子，VEGF-C和VEGF-D的N末端和C末端都?xì)v經(jīng)蛋白水解處理； 3)與所述家族的其他成員相比，歷經(jīng)蛋白水解處理的VEGF-D的成熟形式VEGF-DANAG已被 發(fā)現(xiàn)主要以非共價(jià)結(jié)合的二聚體或單體的形式存在，只有一小部分是以共價(jià)結(jié)合的二硫鍵 連接的二聚體的形式存在。這些研究還顯示VEGF-DAWAG的單體與其二聚體相比也只有非常 微弱的活性。所述二聚體主要為非共價(jià)的性質(zhì)有點(diǎn)令人驚訝，因?yàn)樵谄渌鸙EGF家族生長因 子中形成所述亞基間連接的半胱氨酸殘基在VEGF-D蛋白中是保守的。
以前的研究已經(jīng)誘變過半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)中包含的VEGF-A的半胱氨酸，以研究它 們對所述蛋白結(jié)構(gòu)和功能的重要性。研究發(fā)現(xiàn)亞基間二硫鍵對VEGF-A的生物學(xué)功能是必 需的，因?yàn)樵谶@些半胱氨酸被突變?yōu)楸彼釙r(shí)的VEGF-A喪失了其生物學(xué)活性。在其中保守 的半胱氨酸之一 (Cysl56)轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸時(shí)，VEGF-C突變體完全喪失了其對VEGFR-2的激 活能力，但仍能夠激活VEGFR-3。 VEGF-C和VEGF-D兩者的成熟形式也都包含一個(gè)不成對的 半胱氨酸殘基，其位置接近于預(yù)想的形成亞基間二硫鍵的半胱氨酸殘基。最近研究表明線 蟲(C. elegans)的pvf-1基因編碼一種可激活人類VEGFR-1和VEGFR-2且也是僅部分共價(jià) 結(jié)合的二聚體的VEGF/PDGF同源物。這種蛋白也像VEGF-C和VEGF-D —樣，在其二聚體界 面上具有一個(gè)不成對的半胱氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下研究將在其他VEGF中負(fù)責(zé)形成亞基間二硫鍵的半胱氨酸 和VEGF-D中不成對的半胱氨酸殘基每一個(gè)均分別誘變?yōu)楸彼?，作為成熟VEGF-D形式 VEGF-DANAC的蛋白支架(Achen 1998， Stacker1999)。對VEGF-D進(jìn)行蛋白水解處理從而使 其更具有活性，但這種蛋白水解處理形式主要以非共價(jià)結(jié)合的二聚體或單體的形式存在。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過誘變改變VEGF-D的二聚體形成界面可增加成熟VEGF-D即VEGF_DANAG的共 價(jià)二聚化。還發(fā)現(xiàn)，用多種不同氨基酸替換VEGF-DANAe蛋白的Cys25增加了共價(jià)二聚體的 形成，并且還顯著增加了所述蛋白對VEGF受體的活性。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)VEGF配體的 共價(jià)二聚化更有利于VEGF受體的激活。因此本發(fā)明是一種VEGF-D蛋白，所述蛋白通過一 個(gè)或多個(gè)氨基酸被其他氨基酸所替換而得以修飾，從而改變了其二聚體界面。


圖1示出了 VEGF-DAWAG氨基酸序列與哺乳動物VEGF家族成員的VEGF同源結(jié)構(gòu)域 序列的比對。VEGF-DAw"序列中的半胱氨酸殘基和突變的半胱氨酸殘基以高亮標(biāo)出。
圖2示出了VEGF-DAWAG的同源模型上突變半胱氨酸殘基的位置。所述突變的半胱 氨酸氨基酸殘基根據(jù)它們在VEGF-DANAe序列上的位置被命名。
具體實(shí)施例方式
因此本發(fā)明是一種VEGF-D蛋白，所述蛋白通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其他氨基酸 所替換而得以修飾，從而改變了其二聚體界面。這一限定包括任何影響VEGF-D蛋白的二聚 體界面的氨基酸突變，即所述氨基酸對VEGF-D 二聚體形成具有重要作用。所述二聚體界面是二聚化時(shí)VEGF-D蛋白上與另一個(gè)VEGF-D蛋白結(jié)合的區(qū)域。優(yōu)選地，所述二聚體界面的構(gòu)象被改變。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于所述突變影響了蛋白三維結(jié)構(gòu)。突變的氨基酸可以是當(dāng)所述蛋白二聚化時(shí)與另一個(gè)氨基酸結(jié)合的氨基酸?？筛淖兯龆垠w界面的一個(gè)氨基酸實(shí)例是VEGF-DANAG的Cys25。 本發(fā)明的VEGF-D蛋白包含突變從而所述蛋白的二聚化性質(zhì)與野生型蛋白相比發(fā)生了改變。優(yōu)選地，本發(fā)明的VEGF-D突變體比野生型VEGF-D具有更高的二聚體對單體的比例。因此，在本發(fā)明中，所述VEGF-D蛋白可以單體、二聚體或其混合物的形式存在。優(yōu)選地，所述VEGF-D蛋白基本上以二聚體的形式存在。 經(jīng)蛋白水解處理的VEGF-D即VEGF-DANAC的序列作為SEQ ID NO :1給出。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一個(gè)VEGF-DAWAG(SEQ IDNO :1)蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)Cys殘基被其他氨基酸所替換。與野生型VEGF-DAWAG相比，這種突變可增加二聚體對單體的比例。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該序列的第25個(gè)氨基酸(Cys25)被另一個(gè)氨基酸所替代。優(yōu)選地，所述氨基酸選自Leu、 11e、Val、Ala、Ser、Phe、Trp和Asn。更優(yōu)選地，所述氨基酸選自Leu、 lie和Val。 本發(fā)明的VEGF-D蛋白，或包含編碼本發(fā)明VEGF蛋白的核苷酸序列的表達(dá)載體，可用于制備促進(jìn)血管發(fā)生的藥劑。所述促進(jìn)血管發(fā)生可用于治療或預(yù)防體組織的若干疾病。所述體組織可以是血管例如冠狀動脈或靜脈，或淋巴管。所述體組織也可為器官如眼睛、耳朵、肺、腎、肌肉、心肌、腦、卵巢、前列腺、子宮、胎盤和皮膚。所述器官和其他組織也可能已被移植到患者體內(nèi)；例如，所述患者可能已經(jīng)接受了移植的腎、動脈或靜脈。
本發(fā)明的VEGF-D蛋白，或如上面所定義的表達(dá)載體可用于治療創(chuàng)傷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們可用于治療或預(yù)防缺血或冠狀動脈疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們可用于治療神經(jīng)障礙。 為用于治療，本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法并使用各組分來制備和給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)待治療對象的身體狀況、所述化合物的效力、給藥途徑等常見因素來選擇所述肽的合適劑量。合適的給藥途徑包括口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥和皮下給藥。
以下研究舉例說明了本發(fā)明。
構(gòu)建體的克隆和病毒生成 本研究所用的VEGF-DANAG基因包括野生型VEGF-D序列上對應(yīng)第93-201位氨基酸的第277-603位核苷酸。本文所用編號基于圖1所示的VEGF-Dawag序列。將編碼N末端IL-3信號序列和Flag-tag的序列和編碼C末端6xHis的序列融合為所述VEGF-DANAG序列。以pEntry-VEGF-DAWAG質(zhì)粒為模板，用快速轉(zhuǎn)換定點(diǎn)突變產(chǎn)生編碼突變體VEGF-DAWAG蛋白的質(zhì)粒。用BP-反應(yīng)將人類VEGF-A121 cDNA克隆到pDonr201載體中(Invitrogen)。然后用LR反應(yīng)(Laitinen 2005)將所述Entry克隆的編碼序列克隆到pBVboostFG系統(tǒng)載體中。重組桿狀病毒的生成如前所述。
蛋白在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)及純化 重組蛋白在振蕩培養(yǎng)72小時(shí)的重組桿狀病毒(MOI 5)感染的HighFive細(xì)胞中表達(dá)。用BD Talon金屬親和樹脂(BD Biosciences Clontech)從澄清的培養(yǎng)基中純化蛋白。在室溫下將3ml樹脂在培養(yǎng)基中搖動2小時(shí)，然后收集所述樹脂并轉(zhuǎn)移到色譜柱中。用30ml的含300mM NaCl的50mM磷酸鈉(pH 7.0)進(jìn)行洗滌。用50mM HEPES、20mM NaCl、200mM咪唑(pH7. 4)洗脫重組蛋白。用50mM HEPES、20mMNaCl (pH7. 4)對蛋白進(jìn)行透析以除去咪唑。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品用DC蛋白檢測試劑盒(BioRad)測量蛋白濃度，并通過SDS-PAGE確認(rèn)所測得的蛋白濃度。重組人類VEGF-A165購自R&D System。
蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá) 使用Roche的FugeneHD轉(zhuǎn)染試劑，按照廠商說明書用pBVboostFG系統(tǒng)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后52-72小時(shí)收集條件培養(yǎng)基。用R&DSystems的人類VEGF-D免疫測定對所述培養(yǎng)基中VEGF-D蛋白的水平進(jìn)行定量。
SDS-PAGE和蛋白印跡 將純化蛋白在變性和非變性條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后用Silver SnapStain KitII (Pierce)或Page Blue Protein Staining Solution (Fermentas)將凝膠染色，以分析純化蛋白?；蛘?，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用VEGF-D單克隆抗體(廳286，R&D Systems)檢測。
體外研究 將細(xì)胞以每孔18000個(gè)細(xì)胞置于96孔板中，并加入連續(xù)稀釋的來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的重組蛋白或條件培養(yǎng)基，進(jìn)行Ba/F3-R2(Achen1998)和Ba/F3-R3 (Achen 2000)細(xì)胞存活測定。在48小時(shí)后對細(xì)胞存活率進(jìn)行定量。在每孔中加入20iU Cell Titer BlueReagent (Promega);在37。C下將96孔板培育2小時(shí)。用Wallac Victor2 1420 MultilabelCounter (Perkin Elmer Biosystems)讀取熒光。
結(jié)果 重組VEGF-DANAG蛋白的生產(chǎn)VEGF-D的成熟形式VEGF_DANAG上可能形成分子間二硫鍵的半胱氨酸(Cys44和Cys53)和不成對的半胱氨酸殘基(Cys25)中的每一個(gè)都分別被丙氨酸殘基替換。構(gòu)建體被命名為VEGF-Danag25A、VEGF-Danag44A和VEGF-DANAG53A。用BvboostFG桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在High Five昆蟲細(xì)胞系中生產(chǎn)所述重組蛋白，并用固定化金屬親和色譜從培養(yǎng)基中純化該蛋白。經(jīng)蛋白印跡檢測，所有構(gòu)建體都被成功表達(dá)和純化。然而，VEGF-DANAe44A蛋白在隨后的透析中反復(fù)丟失，很可能是由于降解或聚合以及與透析盒的非特異性結(jié)合。同時(shí)，這種蛋白的表達(dá)水平也比其他VEGF蛋白低，這可能是由于這種突變阻礙蛋白折疊或降低了穩(wěn)定性。以類似方式生產(chǎn)和純化人類VEGF-A121重組蛋白以作為對照。 共價(jià)二聚體的形成在非還原條件下用SDS-PAGE評估VEGF-DANAG、VEGF_DANAG25A和VEGF-Dawag53A形成共價(jià)二聚體的能力。VEGF-DAWAG被發(fā)現(xiàn)只有部分為共價(jià)二聚體，而VEGF-DAWAG25A形成的共價(jià)結(jié)合二聚體的量與其天然形式相比有所增加。如預(yù)測的，VEGF-DANAG53A的共價(jià)二聚體的形成被阻礙。 VEGF-D蛋白包含突變Gly51 —Cys或Cys25 —Leu ;VEGF-D包含突變Arg 22 —Leu和Cys25 — Leu ;并且VEGF-D包含突變Arg22 — lie和Cys25 — Leu，這些突變體的二聚體和單體的比例與VEGF-DAWAG相比都有所增加。如預(yù)測的，VEGF-D二聚體界面上的某些修飾可明顯地改變所述蛋白的多聚化狀態(tài)。 體外活性檢測用表達(dá)VEGFR-2/EpoR或VEGFR-3/EpoR嵌合受體的細(xì)胞，通過Ba/F3細(xì)胞存活測定法測測量純化的VEGF-DANAG、 VEGF_DANAG25A和VEGF_DANAG53A的生物學(xué)活性。兩個(gè)測定都顯示，VEGF-DAw"53A突變體完全喪失了其激活VEGF受體的能力，而 VEGF-DAWAG25A突變體的活性比天然VEGF-DAWAG高約10倍。從昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 的293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化的所述蛋白被發(fā)現(xiàn)具有相似的活性，表明VEGF-DANAe25A 突變體活性的增加不依賴其生產(chǎn)系統(tǒng)。 為研究哪個(gè)氨基酸最適合替換VEGF_DANAG的Cys25，用不同的氨基酸替換Cys25 得到若干突變體形式。選擇氨基酸以涵蓋不同的化學(xué)性質(zhì)。通過293T細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染得 到條件培養(yǎng)基，并用表達(dá)VEGFR-2/EpoR或VEGFR-3/EpoR嵌合受體的Ba/F3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞 存活測定來測量蛋白活性。每種蛋白都在三種不同濃度下進(jìn)行分析10、100和1000ng/ml。 研究發(fā)現(xiàn)疏水氨基酸(Leu、Ile、Val)替換Cys25的突變體形式是VEGFR-2和VEGFR-3 二聚 化活性最高的突變體。用下列氨基酸替換Cys25也發(fā)現(xiàn)了比天然VEGF-DANAG更高的活性 Ala、 Ser、 Phe、 Trp和Asn。用Gly替換Cys25導(dǎo)致生長因子的失活。 結(jié)果顯示，在VEGF家族的其他成員中形成二硫鍵的保守的半胱氨酸對于 VEGF-DANAG的功能是必需的。更重要的，還發(fā)現(xiàn)從VEGF-DAWAG二聚體界面上除去不成對的 半胱氨酸(Cys25)有效地提高了 VEGF-DAWAG蛋白在激活血管內(nèi)皮生長因子受體2和受體3 層面上的活性。因此，這些新VEGF-DANAG的Cys25突變體可被證明，不管是作為重組蛋白還 是通過基因治療給藥，均是比以前使用的野生型蛋白更有效的治療性血管發(fā)生的介質(zhì)。例 如，包括編碼本發(fā)明VEGF-D蛋白的核苷酸序列的表達(dá)載體可用于基因治療。
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Stacker et al(1999)J. Biol. Chem. 274(45) :32127-3213權(quán)利要求
一種VEGF-D蛋白，所述蛋白通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其他氨基酸所替換而得以修飾，從而改變了其二聚體界面。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸包括Cys。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白，其是經(jīng)修飾的VEGF-DANAG(SEQ IDN0:1)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白，其中VEGF-DANAG的Cys25殘基被另一種氨基酸替換。
5 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的蛋白，其中所述其他氨基酸為Leu、 Ile、 Val、Ala、 Ser、 Phe、 Trp或Asn。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白，其中所述其他氨基酸為Leu、Ile或Val。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的VEGF-D蛋白，其基本以二聚體的形式存在。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的蛋白，用于治療。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的蛋白，用于促進(jìn)血管發(fā)生。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的蛋白，用于預(yù)防或治療缺血或冠狀動脈疾病。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的蛋白用于制備促進(jìn)血管發(fā)生的藥劑的用途。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的用途，用于預(yù)防或治療缺血或冠狀動脈疾病。
13. —種包含編碼權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)VEGF蛋白的核苷酸序列的表達(dá)載體，用于基因 治療。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的表達(dá)載體，用于促進(jìn)血管發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明是一種VEGF-D蛋白，其包含在二聚體界面上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變；以及其在治療中尤其是在促進(jìn)血管發(fā)生中的用途。
文檔編號C07K14/52GK101730710SQ200880018138
公開日2010年6月9日 申請日期2008年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者K·J·埃潤尼, P·圖埃瓦恩, S·埃拉-赫圖阿拉 申請人:Ark治療學(xué)有限公司