專利名稱：：一種中藥玉郎傘查耳酮類單體的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法及應(yīng)用，具體地說，涉及中藥玉朗傘查耳酮類單體的分離、純化方法；玉朗傘查耳酮類單體的抗氧化、耐缺氧、抗凝血及對心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。
背景技術(shù)：
：玉郎傘(YLS，也叫龍眼參)，原植物經(jīng)考證為蝶形花科植物疏葉崖豆必7"t"a/w7c力/a化mrar-Ja;n'or0"/^Z.Wei的塊根。本發(fā)明人對玉郎傘進(jìn)行了大量的藥學(xué)、藥效學(xué)研究，并申請了專利(名稱玉郎傘提取物的制備及應(yīng)用，專利申請?zhí)?00710034771.2)。本發(fā)明是玉郎傘提取物前期研究工作的補(bǔ)充，增加了玉郎傘査耳酮類的單體分離及對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用等內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是對中藥玉郎傘査耳酮進(jìn)行深度開發(fā)，目的是按照中藥現(xiàn)代化的思維模式，以藥理活性為靶點(diǎn)，運(yùn)用先進(jìn)的植化分離、純化技術(shù)，得到玉郎傘査耳酮的活性單體，進(jìn)一步明確玉郎傘査耳酮的作用機(jī)制，為治療過氧化損傷、血栓性疾病、缺氧、心肌缺血再灌注性損傷等提供化學(xué)成分明確、新型高效的制劑。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案本發(fā)明研究在國內(nèi)外首次從YLS中分離出一個(gè)苯并呋喃查耳酮單體成分(記為化合物I),其具有顯著的抗氧化、耐缺氧、抗凝血及保護(hù)心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷的作用。新單體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、一般黃酮類化合物的C3結(jié)構(gòu)和苯環(huán)形成環(huán)狀或近似環(huán)狀物以保持高強(qiáng)度聚合勢態(tài)，而此新單體的特點(diǎn)是C3部位與苯環(huán)的連接成線狀共平面結(jié)構(gòu)的高度共軛體系。2、分子結(jié)構(gòu)中含a、B雙鍵和烯醇結(jié)構(gòu)。本發(fā)明采取的玉朗傘查耳酮單體的分離、純化方法為(1)玉郎傘飲片以石油醚乙酸乙酯=1:l冷浸提取，提取液經(jīng)減壓濃縮、石油醚萃取除色素、酯類后得到浸膏；以薄層層析硅膠H為固定相，樣品硅膠H-1:30，用不同比例石油醚/乙酸乙酯洗脫進(jìn)行柱層析分離；(2)以體外抗氧化活性為靶點(diǎn)追蹤收集活性最高的石油醚/乙酸乙酯=9.8/0.2部位洗脫液，濃縮，所得浸膏同上法進(jìn)行二級硅膠柱分離；(3)收集石油醚/乙酸乙酯=8:2流份，常規(guī)方法減壓濃縮得到晶體；以適量氯仿于60°C加熱使晶體恰好全部溶解后，按氯仿溶液甲醇=1:68比例進(jìn)行多次重結(jié)晶、制備薄層色譜，得到桔色方晶；(4)以桔色方晶為原料，經(jīng)安馬西亞-100型制備純化液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化；色譜條件流動(dòng)相CH3CN:0.2%HAC=85:15;流速3ml/min;檢測波長入=238nm，依據(jù)峰收集，洗脫液經(jīng)氮?dú)鈸]干，得淡黃色粉末狀査耳酮單體。玉朗傘査耳酮單體的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用。玉朗傘査耳酮單體對心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷、心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。本發(fā)明通過分離、純化方法從中藥玉郎傘中分離出査耳酮單體成分，并證明了其具有的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用，對心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷、心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。為治療過氧化損傷、血栓性疾病、缺氧、心肌缺血再灌注性損傷等提供化學(xué)成分明確、新型高效的制劑。圖1為YLS査耳酮提取分離流程圖。圖2為浸膏B的分離流程圖。圖3為化合物I甲醇溶液紫外吸收光譜圖(UV)。圖4為MS光譜圖。圖5為'HNMR譜圖。圖6為"CNMR譜圖。圖7為IR光譜圖。圖8為化合物I的空間立體結(jié)構(gòu)圖。具體實(shí)施例方式1.玉郎傘査耳酮類的單體分離、純化及鑒定1.1玉郎傘査耳酮類單體的提取、分離取玉郎傘飲片粉碎成2mm粒徑，以石油醚(PE):乙酸乙酯(ETOAC)=1:1冷浸提取10次，直至提取液顏色變淺。提取液經(jīng)減壓濃縮、石油醚萃取除色素、酯類后得到黃酮類提取物浸膏。以浸膏硅膠=1:2比例進(jìn)行硅膠拌樣后作柱層析分離，分離固定相為薄層層析硅膠H，按樣品硅膠H-1:30比例，以不同比例PE/ETOAC由低到高極性梯度洗脫，每500raL接取一流份，經(jīng)TLC檢査合并相同流份，共得到17個(gè)不同部位的浸膏及晶體，記為A-M。見圖1。按本發(fā)明方法，以體外抗氧化活性為靶點(diǎn)對以上17個(gè)部位進(jìn)行進(jìn)一步的追蹤篩選，最終確定對體外抗氧化活性最高的晶體B以不同比例PE/ET0AC作進(jìn)一步的多級分離，固定相比例4為1:200400薄層H，每100mL接取一流份。晶體B經(jīng)PE:ET0AC/8:2洗脫分離出一黃色條帶，洗脫液減壓濃縮得到易溶于氯仿的物質(zhì)，經(jīng)多次CHCl3/ME0H重結(jié)晶、制備薄層色譜，得到桔色方晶，記為桔晶。見圖2。1.2玉郎傘査耳酮類單體的純化以桔晶為原料，經(jīng)安馬西亞-100型制備純化液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化。色譜條件流動(dòng)相CH3CN:0.2%HAO85:15;流速3ml/min;檢測波長入=238nm，依據(jù)峰收集，洗脫液經(jīng)氮?dú)鈸]干，得淡黃色粉末狀査耳酮單體，記為化合物I。1.3定性實(shí)驗(yàn)對化合物I進(jìn)行鹽酸一鎂粉反應(yīng)、乙酸鎂反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)、Pb(AC)2水溶液顯色反應(yīng)、Gregg-Gisroly反應(yīng)、a-萘酚反應(yīng)(Molish反應(yīng))等定性試驗(yàn)。結(jié)果見表1:表1化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果部位鹽酸一鎂粉反應(yīng)乙酸鎂反應(yīng)三氯化鋁反應(yīng)Pb(AC)2顯色反應(yīng)Gregg-Gisroly反應(yīng)a-萘酚反應(yīng)化合物I+++-—一1.4性狀、熔點(diǎn)、分子量測定及TLC分析化合物I為淡桔色粉末，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑；熔點(diǎn)為120.0-121.0。C;以三種不同配比展開劑進(jìn)行TLC分析均只顯示一個(gè)斑點(diǎn)，結(jié)果見表2。表2化合物ITLC分析結(jié)果展開液PE:ETOAC=4:1PE:ACEt=l:1CH3C1:ETOAC=3:1化合物I(Rf)0.160.560.651.5紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁、X—射線單晶衍射分析1.5.1紫外圖譜將化合物I的甲醇溶液在200-500nm間掃描，結(jié)果顯示化合物I在260nm和300皿處分別有兩個(gè)吸收峰，均屬黃酮類特異吸收峰。1.5.2紅外圖譜化合物I少許經(jīng)KBr壓片，在紅外光譜儀上進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3500，2529，2831，1600，1562，3133cm—'為其特征吸收峰，其中，3500cm—1是-0H的伸縮振動(dòng)峰;2929，2831cm—1為-CH3的伸縮振動(dòng)峰；1562cm—'是OC共軛振動(dòng)峰；3133cm—1為苯環(huán)伸縮振動(dòng)峰；1600cnf1是c:o伸縮振動(dòng)峰，頻率較低，說明羰基與a、e-不飽和雙鍵共軛。1.5.3質(zhì)譜APCL-MS(m/z):293.22[M-l]+，277.44。分子量為294。1.5.4核磁圖譜從圖譜可知各峰歸屬為'HNMR(CDC13)S:3.95(3H，s,-線)，7.2(1H，d，5,-H),8.2(1H，d，2，—H),8.16、8.17(2H,s，2,6—H),7.77(1H，s，a-H)，7.56、7.57(5H，m,3，，4，，3，4，5-H)。l3CNMR(CDC13)S:60.2(C-9,)，104.2(C-a)，110.0(C-5，)，117.0(C-3')，119.8(C-8，)，122.0(C-1，)，128.4(C-2，)，128.6(C_2，4，6)，130.6(C-3，5)，141.8(C-l)，145.7(C-4，)，150.0(C-6，),154.8(C-7,)，158.2(C—8)，175.0(00)。1.5.2X—射線單晶衍射單晶衍射數(shù)據(jù)見附錄。結(jié)果表明化合物I的空間立體結(jié)構(gòu)如圖8。綜合以上各譜圖分析，得知化合物I的化學(xué)結(jié)構(gòu)及相關(guān)參數(shù)如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(Z)-3-hydroxy-1-(4-methoxybenzofuran-5-yl)-3-phenylprop-2-en-1-oneChemicalFormula:(^1^404ExactMass:294.09MolecularWeight:294.30m/z:294.09(100.0%)，295.09(19.6%)，296.10(1.9%)ElementalAnalysis:C，73.46;H，4.79;0,21.75經(jīng)檢索CA、Scifinder數(shù)據(jù)庫未見報(bào)道，因此化合物I為一新化合物。2.玉朗傘査耳酮類單體的體外抗氧化作用依據(jù)表3-4建立體外氧自由基(-(V)、羥自由基(*0H)發(fā)生體系，研究化合物1對*02'和-OH的清除和抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，終濃度分別為0.5、1.0、2.Omg.ml—1的化合物I均能清除*02—和OH、抑制*02—的生成(P<0.05)并呈濃度依賴性。其中，高濃度組效果最佳。結(jié)果表明化合物I有較強(qiáng)的抗氧化作用。結(jié)果見表5-7。表3抗氧自由基實(shí)驗(yàn)參比管(ml)_A(Vit.C)_A(受試藥)試劑A(空)VitC(ml)調(diào)零管(ml)受試藥(ral)調(diào)零管(ml)0.1MPB(pH8.34)2.252.252.252.252.250.4Mm連苯三酚2.252.25——2.2512mMVit.C——0.050.05蒸餾水————2.252.25受試藥25'C反應(yīng)10s后于X322處測A值，0.050.05氧自由基清除率％=(A空-A樣)+A空X100W，氧自由基抑制率％=(Vo空-v琳)+VX100%注*02—抑制率的測定用動(dòng)態(tài)方法測定，(V生成的反應(yīng)初速率V。(A.min—'),即反應(yīng)取得啟動(dòng)后每30s測一相應(yīng)A322nm值，至4.5min止，將所得A322nm值與時(shí)間進(jìn)行回歸分析，其斜率為V。。表4抗羥自由基實(shí)驗(yàn)A(Vit.C)A(受試藥)試劑A(損)A(未損)v.wfn調(diào)零管VitC(ml),，、(ml)受試藥調(diào)零管(ml)(ml)0.5MPB(pH7.30)1.21.21.2——1.2——<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>37'C保溫60min后于A536處測A值羥自由基清除率%="樣-A損)+(A未損一A損)X100%表5化合物I對'C^的清除作用(x±s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Vit.C2.112化合物I低濃度0.5化合物I中濃度1.0化合物I高濃度_^_注與損傷組比較，1X0.013.玉朗傘査耳酮類單體的體內(nèi)抗凝血及耐缺氧作用化合物l以適量3%吐溫_80生理鹽水溶液溶解，分為高劑量組(100mgkg—')、中劑量組(50mgkg—1)、低劑量組(25mgkg-1)進(jìn)行試驗(yàn)。將30只小鼠隨機(jī)分為正常對照、陽性對照、化合物I高、中、低劑量共5組，每組6只，均通過腹腔注射給藥(0.2ml/20g)。正常對照組注射生理鹽水，陽性對照組注射維生素C(70mg*kg—"。給藥20min后，用內(nèi)徑為lmm的毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)眥靜脈，至毛細(xì)管血柱達(dá)到約5cm時(shí)取出，平放于桌上。每隔30s折斷一小段毛細(xì)管(約5mra)，緩慢拉開，觀察有無血凝絲出現(xiàn)，從毛細(xì)管采血到出現(xiàn)血凝絲的時(shí)間為凝血時(shí)間。取血后立即將小鼠置于內(nèi)放15g鈉石灰，體積為150ml的廣口瓶中，用凡士林涂抹瓶口蓋嚴(yán)，使之不漏氣。立即計(jì)時(shí)，以小鼠呼吸停止為死亡指標(biāo)，觀察記錄小鼠因缺氧至死亡的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，化合物I低、中、高劑量組均能延長小鼠的凝血及缺氧存活時(shí)間，其中，中劑量組效果最好；化合物I中劑量對小鼠耐缺氧能力的提高與Vit.C相似(P〉0.05)。結(jié)果表明，化合物I具較強(qiáng)的抗凝血及耐缺氧作用并以中劑量組效應(yīng)最顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表8。表8化合物I抗凝血及耐缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x士s，n=6)組別凝血時(shí)間(min)死亡時(shí)間(min)正常(空白)對照1.94±0.5812.20±0.75Vit.C2.48±0.5017.55±0.92*化合物I低劑量3.56±0.3315.09±0.71*化合物I中劑量2.47±0.5917.24±0.51**化合物I高劑量2.69±0.3215.04±0.60*注與空白組比較，*P<0.01;與VitC對照，**P>0.054.玉朗傘査耳酮類單體對心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷的保護(hù)作用心肌細(xì)胞培養(yǎng)取出生1-3天的乳鼠，按Harry方法加以改良進(jìn)行心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。含藥血清制備取2只SD大鼠進(jìn)行十二指腸給藥，各注射2ml(60mg/kg)的化合物I，2ml943.47±2.84'15.75±3.07*28.00±1.63438.66±3.11*生理鹽水，lh后腹主動(dòng)脈取血，4°C，3500rpm離心15min，取上清液，即得含藥血清和空白血清。取搏動(dòng)良好的細(xì)胞，隨機(jī)分為7組l.正常對照組(Control)2.陽性藥維拉帕米組(終濃度20uM)3.化合物I10%含藥血清(高劑量組)4.化合物I5%含藥血清(中劑量組)5.化合物I2.5%含藥血清(低劑量組)6.空白血清組(Blank)7.模型組(Model)。以上各組細(xì)胞除正常對照組外，均按本室方法建立心肌細(xì)胞缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷模型，缺氧2h，復(fù)氧4h后以MTT法進(jìn)行各組細(xì)胞活力的檢測；ELISA法測定各組心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和細(xì)胞培養(yǎng)上清夜LDH、N0S活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白血清相比，化合物l的高、中劑量含藥血清均能明顯增加心肌細(xì)胞的存活力，增強(qiáng)化+-1T-ATP酶、Ca2+-1%2+41酶活性，降低細(xì)胞培養(yǎng)上清夜LDH、N0S活性并呈劑量依賴性(P<0.05)。結(jié)果表明，化合物l對心肌細(xì)胞缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表9-11。表9化合物l缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞存活力的影響(x±s，n二8)組別細(xì)胞存活力0D值細(xì)胞存活率％正常對照組0.86±0.09'100*陽性藥組0.69±0.05'80.99±0.09*化合物I高劑量組0.67士0.05'79.08±0.08'化合物I中劑量組0.64±0.06'76.11±0.05*化合物I低劑量組0.53±0.0263.01±0.06模型組0.54±0.0363.31±0.07空白血清組0.55±0.0364.28±0.05與模型組比較*P<0.05表10化合物I對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞ATP酶活性的影響(x±s，n=8)組別Na+-K+-ATP酶(U/mgprot)Ca2+-Mg2+-ATP酶(U/mgprot)模型組1.28±0.01空白血清組1.29±0.01化合物I高劑量組2.04±0.011.31±0.011.30±0.011.37±0.01化合物I中劑量組2.01±0.04'#1.34±0.01"化合物I低劑量組1.29±0.04*1.31±0.00*#陽性藥組2.11±0.04'1.37±0.0r正常對照組2.21±0.15*1.42±0.04*與模型組比較fPO.05,與對照組比較*P<0.05表ll化合物I對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、NOS活性的影響(i±s，n=8)組別LDH(U/l)iN0S(U/ml)cNOS(U/ml)飾S,l)模型組2880.77±323.55#4.78±0.35#3.09±0.79#7.86±0.88#陽性藥組2134.62±604.40*4.04±0.42*#4.77±0.79*8.80±0.73*#化合物I高劑量組2408.35±217.55'4.01±0.49*#4.79±0.81*8.91土0.82*#化合物I中劑量組2467.17±198.05'4.06±0.27"4.55±0.6548.79±0.76*#化合物I低劑量組3008.89±209.21#4.41±0.33#3.88±1.07弁7.95±0.69#空白血清組2938.46±343.15#4.58±0.49#3.37±0.46#7.96±0.59#正常對照組2311.54±320.49'0.10±0.05*#5.06±0.74*5.17士0.72'與模型組比較*P〈0.05，與對照組比較*P〈0.05實(shí)施例1玉郎傘査耳酮類單體的提取、分離將玉郎傘飲片粉碎成2mm粒徑，取粗粉18kg，以石油醚(PE):乙酸乙酯(ETOAC)=1:1冷浸提取10次，直至提取液顏色變淺。過濾，取其濾液，經(jīng)減壓濃縮、石油醚萃取除色素、酯類后得到黃酮類提取物浸膏100g。以浸膏硅膠=1:2比例進(jìn)行硅膠拌樣后作柱層析分離(分離固定相為薄層層析硅膠H，按樣品硅膠H-l:30比例)，以不同比例PE/ETOAC由低到高極性梯度洗脫，每500mL接取一流份，經(jīng)TLC檢査合并相同流份，共得到17個(gè)不同部位的浸膏及晶體，記為A-M，艮卩浸膏A(Fr31-40)4.15g;浸膏B(Fr64-85)4.35g;白色C晶(Fr64-85)5.23g;白色D晶(Fr90-103)L97g;浸膏E(Frlll-120)3.12g;白色F晶(Fr131-147)2.66g;浸膏G(Ft148-170)6.83g;浸膏H(Fr178-191)5.5g;浸膏I(Fr196-210)3.05g;浸膏J(Fr215-221)2.1g;浸膏K(Fr225-269)2.93g;浸膏L(Fr241-252)114.09g;白色M晶(Fr255-269)1.38g。詳見圖l。按本發(fā)明方法，以體外抗氧化活性為靶點(diǎn)對以上17個(gè)部位進(jìn)行進(jìn)一步的追蹤篩選，最終確定對體外抗氧化活性最高的晶體B以不同比例PE/ETOAC作進(jìn)一步的多級分離，固定相比例為1:200400薄層H,每100mL接取一流份。晶體B經(jīng)PE:ETOAC/8:2洗脫分離出一黃色條帶，洗脫液減壓濃縮得到晶體，以適量氯仿于60。C加熱，按氯仿溶液甲醇=1:68比例，多次CHCVMEOH重結(jié)晶、制備薄層色譜，得到1.234g桔色方晶，記為桔晶。詳見圖2。實(shí)施例2玉郎傘査耳酮類單體的純化以1.234g桔晶為原料，經(jīng)安馬西亞-100型制備純化液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化。色譜條件-流動(dòng)相CH3CN:0.2%HAC=85:15;流速3ml/min;檢測波長X=238nm，依據(jù)峰收集，洗脫液經(jīng)氮?dú)鈸]干，得1.016g淡黃色粉末狀查耳酮單體。權(quán)利要求1、一種中藥玉郎傘查耳酮類單體的制備方法，其特征是玉朗傘查耳酮單體的分離、純化方法為(1)玉郎傘飲片以石油醚乙酸乙酯＝11冷浸提取，提取液經(jīng)減壓濃縮、石油醚萃取除色素、酯類后得到浸膏；以薄層層析硅膠H為固定相，樣品硅膠H＝130，用不同比例石油醚/乙酸乙酯洗脫進(jìn)行柱層析分離；(2)以體外抗氧化活性為靶點(diǎn)追蹤收集活性最高的石油醚/乙酸乙酯＝9.8/0.2部位洗脫液，濃縮，所得浸膏同上法進(jìn)行二級硅膠柱分離；(3)收集石油醚/乙酸乙酯＝/82流份，常規(guī)方法減壓濃縮得到晶體；以適量氯仿于60℃加熱使晶體恰好全部溶解后，按氯仿溶液甲醇＝16～8比例進(jìn)行多次重結(jié)晶、制備薄層色譜，得到桔色方晶；(4)以桔色方晶為原料，經(jīng)安馬西亞-100型制備純化液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行純化；色譜條件流動(dòng)相CH3CN:0.2％HAC＝8515；流速3ml/min；檢測波長λ＝238nm，依據(jù)峰收集，洗脫液經(jīng)氮?dú)鈸]干，得淡黃色粉末狀查耳酮單體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥玉郎傘査耳酮類單體，其特征是玉朗傘查耳酮單體的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥玉郎傘査耳酮類單體，其特征是玉朗傘査耳酮單體對心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷、心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。全文摘要本發(fā)明公開了一種中藥玉郎傘查耳酮類單體的制備及其應(yīng)用。運(yùn)用先進(jìn)的植化分離、純化技術(shù)，從中藥玉郎傘中分離出查耳酮單體成分，并證明了其具有的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用，對心肌缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷、心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。為治療過氧化損傷、血栓性疾病、缺氧、心肌缺血再灌注性損傷等提供化學(xué)成分明確、新型高效的制劑。文檔編號C07D307/78GK101463022SQ200810073949公開日2009年6月24日申請日期2008年12月1日優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日發(fā)明者付書婕,張士軍,張緒東,興林,楊焦,潔簡,蔣偉哲,蔡文娥,健陳,黃仁彬,黃媛恒,黃建春,黃忠仕申請人:黃仁彬