專利名稱：河豚魚(yú)皮活性膠原蛋白及其肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于魚(yú)的活性膠原蛋白及其肽的制備技術(shù)，特別是用微 生物處理的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
研究表明，活性膠原蛋白有著多種生理功能，其在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng) 域有著廣泛的應(yīng)用，其酶解產(chǎn)物膠原蛋白肽也具有多種生理功效，主耍表現(xiàn)在 抗氧化、降血壓、降血脂、抗腫瘤等。因此人們對(duì)膠原蛋白及其肽類的研究開(kāi) 發(fā)相當(dāng)關(guān)注。膠原蛋白的利用首先是從陸生動(dòng)物開(kāi)始的，但僅是陸生動(dòng)物的膠 原蛋白制品難以滿足人們的需求，岡此，近幾年，人們把目光轉(zhuǎn)向了膠原蛋白 資源更豐富的水產(chǎn)動(dòng)物，尤其是淡水以及海水魚(yú)類。秦玉青等研究了魷魚(yú)皮膠
原蛋白提取的最佳工藝條件(中醫(yī)研究，2002， 1: 20-21)，王靜鳳等(中國(guó)專 利申請(qǐng)?zhí)?00710013140.2)提供了一種魷魚(yú)皮膠原蛋白活性肽的制備方法，他 們都是單獨(dú)的制備膠原蛋白或膠原蛋白活性肽，沒(méi)有把二者制備的工藝結(jié)合起 來(lái)，以達(dá)到對(duì)原料更充分的利用。
河豚魚(yú)是瓊目、河豚科的水產(chǎn)動(dòng)物，它含有劇毒物質(zhì)河豚魚(yú)毒素，因此對(duì) 它的開(kāi)發(fā)利用存在一定的困難，目前對(duì)于河豚魚(yú)的研究大都停留在河豚魚(yú)毒素 上，而對(duì)河豚魚(yú)其它方面的研究涉獵的不多。陳丁丁等(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?03152847.3)采用常規(guī)的制取明膠的方法制備河豚膠，并對(duì)其醫(yī)藥保健用途進(jìn) 行了研究，但沒(méi)有進(jìn)行河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽的提取研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用無(wú)毒的河豚魚(yú)皮，提供一種將河豚魚(yú)皮活性膠原蛋白與其活性 肽的結(jié)合起來(lái)制備的方法，達(dá)到對(duì)河豚魚(yú)皮高的利用率，保持制備的膠原蛋白 的結(jié)構(gòu)及生理功能，制取高活性的河豚魚(yú)膠原蛋白肽，不僅解決了河豚魚(yú)下腳 料的環(huán)境污染問(wèn)題，而且提高了產(chǎn)品的附加值，拓寬河豚魚(yú)的利用領(lǐng)域。
本發(fā)明的技術(shù)方案按如下所述實(shí)現(xiàn)
(一) 活性膠原蛋白的制取
1. 原料處理
將河豚魚(yú)皮剪成小塊冷凍干燥，然后用粉碎機(jī)將其粉碎。
2. 非膠原蛋白的去除
將冷凍干燥粉碎后的魚(yú)皮放入5 100倍體積0. 5 15%的氯化鈉溶液中，在 0 4。C下攪拌12h，然后在10000r/min、 0 4。C條件下離心10 30min，棄去上 清液，以除去非膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。其中以粉碎魚(yú)皮放入 50 100倍體積5 15%的氯化鈉溶液中，在0 ^C下攪拌12h為好。
3. 活性膠原蛋白的提取
將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入5 100倍體積0. 05 1%醋酸溶液中，在0 l(TC的低溫條件下，按1000 10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解時(shí)間8 96h，然后在5000r/mimO 5。C下離心10 30min。將上清液通過(guò)5000 100000Da 的超濾膜，收集超濾的上面部分，在-20 -8(TC下冷凍干燥。其中以除去非膠 原蛋白的魚(yú)皮放入20 100倍體積0. 5 1. 0%醋酸溶液中，在0 1(TC的低溫條 件下，按3000 10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解時(shí)間50 100h為好。 得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白，無(wú)酸味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80% 以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀 用于制備膠原蛋白活性肽。
(二) 膠原蛋白肽的制備 1.原料處理
將(一)中制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH2.0 7.0，在4000r/min條件下離心10min，棄上清，沉淀用于膠原蛋白肽的制備。 2.膠原蛋白肽的制備
在20 85°C、 pH值2. 0 10. 0的條件下，按1000 12000U/g底物的比例 向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解0. 5 10. 0h后在80 12(TC下滅酶2 5min。 在4000r/min下離心10 20min，上清液分別通過(guò)10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥后 得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽。其 中以在40 85。C、 pH值6.0 10.0的條件下，按3000-10000U/g底物的比例向 沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解1.5-10. Oh為好。
本發(fā)明以無(wú)毒河豚魚(yú)皮為原料，以酶解物隊(duì)羥自由基清除率為指標(biāo)，從木 瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶中優(yōu)選出最高清除 率的一種酶為木瓜蛋白酶。
本發(fā)明制得的河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽有較好的抗氧化性，可用于食品、 藥品及化妝品的有效成分，發(fā)揮其清除自由基，降低衰老程度的作用。
下面對(duì)河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽的體外抗氧化性作進(jìn)一步的說(shuō)明。
① 清除H0 自由基的能力本實(shí)驗(yàn)以Fenton體系檢測(cè)了河豚魚(yú)皮膠原蛋白 太清除H0*自由基的能力，結(jié)果表明，采用木瓜蛋白酶制得的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白肽有顯著的清除HO"自由基的能力，其中分子量為3000-5000、 1000-3000、 1000以下分子量范圍的清除率最高，IC5。值分別為0.4425mg/ml、 0. 3761mg/ml、 0. 373mg/ml，均小于對(duì)照維生素C的I"值0. 9289mg/ml。說(shuō)明該肽的清除HO '自 由基的能力比維生素C要強(qiáng)。
② 清除DPPH'自由基的能力二苯代苦味酰自由基(DPPH*)是一種很穩(wěn)定 的以氮為中心的自由基，若受試物能將其清除，則提示受試物具有降低羥自由 基，烷自由基或過(guò)氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的作用。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽有較強(qiáng)的清除DPPH*自由基的能力。其 中分子量為3000-5000、 1000-3000、 1000以下分子量范圍的清除率最高，IC5。 值分別為3. 0650mg/ml、 2. 9609mg/ml、 2.4651mg/ml，小于維生素E的1〔50值 4.7329mg/ml，說(shuō)明該肽的清除DPPH.自由基的能力比維生素E要強(qiáng)。
③ 實(shí)驗(yàn)還表明河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽具有一定的清除02— *自由基和還原能力。 本發(fā)明的創(chuàng)新性如下所述
(一)本發(fā)明的一大特點(diǎn)是注重提取的目的性與過(guò)程性的結(jié)合
1. 在原料處理的過(guò)程中，先把河豚魚(yú)皮剪成小塊然后冷凍干燥，這樣節(jié)省 了原料處理的時(shí)間，并且使干燥后的魚(yú)皮粉碎效果好。
2. 在制取活性膠原蛋白的過(guò)程中，整個(gè)過(guò)程都是在低溫條件下進(jìn)行，避免 了高溫對(duì)膠原蛋白的破壞作用，確保所提取膠原的結(jié)構(gòu)完整性和性能優(yōu)良性。
3. 制備膠原蛋白活性肽所用的原料是制備活性膠原蛋白的河豚魚(yú)皮殘?jiān)?br> 即將河豚魚(yú)膠原蛋白的提取與河豚魚(yú)膠原蛋白活性肽的制備結(jié)合在一起，不僅 節(jié)省了處理原料的時(shí)間和費(fèi)用，而且使原料得到了充分的利用。
4.經(jīng)優(yōu)選，采用木瓜蛋白酶制備膠原蛋白肽，使制取的活性肽具有更高的 抗氧化活性。
(二)首次用河豚魚(yú)魚(yú)皮制取膠原蛋白活性肽 下面是本發(fā)明實(shí)施例。 實(shí)施例一
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取10g放入50ml、 0. 5%的氯化鈉溶液中，在0 。C下攪拌12h，然后在10000r/min、 (TC條件下離心10min，棄上清液，以除去 非膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入50ml、 0.05%醋酸溶液中，在0。C的低溫條件下，加入100000U的胃蛋白酶，酶解時(shí)間 96h，然后在5000r/min (TC下離心30min。將上清液通過(guò)5000的超濾膜，收集 超濾的上面部分，在-2(TC下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白，無(wú) 酸味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化 工、食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。
2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH2.0，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 20°C、 pH2.0的條件下，按1000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解 10h后，在80。C條件下滅酶30min，在4000r/min下離心10min，上清液分別通 過(guò)10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。 經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白活性肽。
實(shí)施例二
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取10g放入1000ml 15%的氯化鈉溶液中，在4 。C下攪拌12h，然后在10000r/min、 4"C條件下離心30min，棄上清液，以除去
非膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入
1000mlW。的醋酸溶液中，在10。C的低溫條件下，加入ioooou的胃蛋白酶，酶解 時(shí)間96h,然后在5000r/min、 5。C下離心10min。將上清液通過(guò)5000的超濾膜， 收集超濾的上面部分，在-8(TC下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白， 無(wú)酸味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、 化工、食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。
2.膠原蛋白活性肽的制備 將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至PH7.0，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 85°C、 pH10.0的條件下，按1000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶 解O. 5h后，在90。C條件下滅酶20min，在4000r/min下離心20min，上清液分別 通過(guò)10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原 蛋白肽。經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú) 皮膠原蛋白活性肽。 實(shí)施例三
活性膠原蛋白的制備
l.活性膠原蛋白的制備 將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取10g放入500ml、 5%的氯化鈉溶液中，在2'C 下攪拌12h，然后在10000r/min、 2。C條件下離心20min，棄上清液，以除去非 膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入500ml、 0. 5%醋酸溶液中，在4。C的低溫條件下，加入60000U的胃蛋白酶，酶解時(shí)間48h， 然后在5000r/min 3。C下離心20min。將上清液通過(guò)10000的超濾膜，收集超濾 的上面部分，在-45'C下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白，無(wú)酸味， 略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化工、食 品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。 2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至PH3.0，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在
65°C、 pH7.0的條件下，按6000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解 2h后，在100。C條件下滅酶5min，在4000r/min下離心10min，上清液分別通過(guò) 10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。 經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白活性肽。
實(shí)施例四
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取20g放入1400ml、 10%的氯化鈉溶液中，在2 。C下攪拌12h，然后在10000r/min、 4。C條件下離心20min，棄上清液，以除去 非膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入 1000ml、 0.5%醋酸溶液中，在4。C的低溫條件下，加入80000U的胃蛋白酶，酶 解時(shí)間72h，然后在5000r/min 2。C下離心30min。將上清液通過(guò)30000的超濾膜， 收集超濾的上面部分，在-65。C下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白， 無(wú)酸味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、 化工、食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。
2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH4.0，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 70°C、 pH6.0的條件下，按7000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解 5h后，在IO(TC條件下滅酶2min，在4000r/min下離心25min，上清液分別通過(guò) 10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。 經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白活性肽。
實(shí)施例五
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取20g放入800ml 8%的氯化鈉溶液中，在TC 下攪拌12h，然后在10000r/min、 4。C條件下離心20min，棄上清液，以除去非
膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入1200mll% 醋酸溶液中，在4"C的低溫條件下，加入160000U的胃蛋白酶，酶解時(shí)間64h， 然后在5000r/min、 3'C下離心20min。將上清液通過(guò)50000的超濾膜，收集超 濾的上面部分，在-45'C下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白，無(wú)酸 味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化工、 食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。 2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH5.0，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 55°C、 pH7.5的條件下，按6000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解 1. 5h后，在80。C條件下滅酶25min，在4000r/min下離心15min，上清液分別通 過(guò)10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。 經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白活性肽。
實(shí)施例六
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取50g放入1000ml、 12%的氯化鈉溶液中，在2 。C下攪拌12h，然后在10000r/min、 2。C條件下離心30min，棄上清液，以除去 非膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入 1500ml、 0.2%醋酸溶液中，在4i:的低溫條件下，加入150000U的胃蛋白酶，酶 解時(shí)間90h，然后在5000r/min 3"C下離心10min。將上清液通過(guò)10000的超濾膜， 收集超濾的上面部分，在-75"C下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白， 無(wú)酸味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、 化工、食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。
2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH6.0，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 75°C、 p朋.O的條件下，按10000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶
解0. 5h后，在80。C條件下滅酶30min，在4000r/min下離心10min，上清液分別 通過(guò)10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原 蛋白肽。經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú) 皮膠原蛋白活性肽。
實(shí)施例七
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取10g放入600ml、 5%的氯化鈉溶液中，在4'C 下攪拌12h，然后在10000r/min、 (TC條件下離心20min，棄上清液，以除去非 膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入700ml、 0. 3%醋酸溶液中，在8X:的低溫條件下，加入90000U的胃蛋白酶，酶解時(shí)間24h， 然后在5000r/min 3。C下離心20min。將上清液通過(guò)100000的超濾膜，收集超 濾的上面部分，在-45。C下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白，無(wú)酸 味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化工、 食品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。
2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH6.5，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 45°C、 pH8.0的條件下，按3000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解 10h后，在90。C條件下滅酶20min，在4000r/min下離心10min，上清液分別通 過(guò)10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。 經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白活性肽。
實(shí)施例八
l.活性膠原蛋白的制備
將冷凍干燥的魚(yú)皮粉碎后稱取10g放入900ml 5%的氯化鈉溶液中，在2°C 下攪拌12h，然后在10000r/min2'C條件下離心20min，棄上清液，以除去非膠 原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白。將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入500ml、 0. 5%
醋酸溶液中，在4°。的低溫條件下，加入80000U的胃蛋白酶，酶解時(shí)間88h，然 后在5000r/min 4。C下離心20min。將上清液通過(guò)10000的超濾膜，收集超濾的 上面部分，在-45"C下冷凍干燥。得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白色澤潔白，無(wú)酸味， 略有輕微的腥味，純度可達(dá)80%以上。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化工、食 品等領(lǐng)域。離心所得到的沉淀用于制備膠原蛋白活性肽。 2.膠原蛋白活性肽的制備
將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀用去離子水洗至pH5.5，在 4000r/min條件下離心10min，棄上清液，沉淀用于膠原蛋白活性肽的制備。在 60°C、 pH7.0的條件下，按5000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解 3h后，在8(TC條件下滅酶30min，在4000r/min下離心10min，上清液分別通過(guò) 10000Da、 5000Da、 3000Da、 1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000 10000、 3000 5000、 1000 3000、 1000以下等不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽。 經(jīng)噴霧干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋 白活性肽。
權(quán)利要求
1.一種膠原蛋白、及其肽的制備方法，其特征在于河豚魚(yú)皮的活性膠原蛋白及其肽的制備方法，工藝操作步驟為一.活性膠原蛋白的制取(1)原料處理將河豚魚(yú)皮剪成小塊冷凍干燥，然后用粉碎機(jī)粉碎；(2)非膠原蛋白的去除將冷凍干燥粉碎后的魚(yú)皮放入5-100倍體積0.5～15％的氯化鈉溶液中，在0～4℃下攪拌12h，然后在10000r/min、0～4℃下離心10～30min，棄上清液，以除去非膠原蛋白，沉淀用于提取活性膠原蛋白；(3)活性膠原蛋白的提取將除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入5～100倍體積的0.05～1％醋酸溶液中，在0～10℃下，按1000～10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解8～96h，在5000r/min、0～5℃下離心10～30min，將上清液通過(guò)5000～100000Da的超濾膜，收集超濾的上面部分，在-20～-80℃下冷凍干燥，得到的河豚魚(yú)皮膠原蛋白；色澤潔白，無(wú)酸味，略有輕微的腥味，純度可達(dá)80％以上；二.膠原蛋白肽的制備(1).原料處理將(一)中制備活性膠原蛋白離心后所得到的沉淀用去離子水洗至pH2.0～7.0，4000r/min離心10min，沉淀用于膠原蛋白肽的制備；(2).膠原蛋白肽的制取在20～85℃、pH2.0～10.0下，按1000～12000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解0.5～10h，后80～120℃下滅酶2～5min，在4000r/min下離心10～20min，上清液分別通過(guò)10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超濾膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥后得到淡黃色或白色粉狀、復(fù)溶性好、略帶腥味的河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述膠原蛋白、及其肽的制備方法，其特征在于活性膠 原蛋白的制取的(2)非膠原蛋白的去除的步驟中，粉碎魚(yú)皮放入50 100倍體積 5 15%的氯化鈉溶液中，在0 4"C下攪拌12h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述膠原蛋白、及其肽的制備方法，其特征在于活性膠 原蛋白的制取的(3)活性膠原蛋白的提取步驟中，除去非膠原蛋白的魚(yú)皮放入 20 100倍體積0.5 1.0%醋酸溶液中，在0 10。C的低溫條件下，按3000 10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解時(shí)間50 100h。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述膠原蛋白、及其肽的制備方法，其特征在于膠原蛋 白肽的制備的(2).膠原蛋白肽的制取步驟中，在40 85。C、 pH值6.0 10.0的 條件下，按3000 10000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解1.5 10. Oh。
全文摘要
河豚魚(yú)皮的活性膠原蛋白及其肽的制備方法，是將河豚魚(yú)皮剪成小塊冷凍干燥粉碎，放入氯化鈉溶液中攪拌12h，然后離心，棄上清液除去非膠原蛋白，將沉淀放入醋酸溶液中，在0～10℃下，加入胃蛋白酶，酶解，離心，上清液通過(guò)的超濾膜，上面部分冷凍干燥得膠原蛋白。將制備活性膠原蛋白后離心所剩下的沉淀洗至pH2.0～7.0，向沉淀中加入木瓜蛋白酶酶解，滅酶后離心上清液分別通過(guò)超濾膜，得到不同分子量范圍的河豚魚(yú)皮膠原蛋白肽，經(jīng)冷凍干燥后得到淡黃色或白色粉狀的河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽。所制得的膠原蛋白可用于醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域，河豚魚(yú)皮膠原蛋白活性肽有較好的抗氧化性，發(fā)揮其清除自由基，降低衰老程度的作用。
文檔編號(hào)C07K14/78GK101182357SQ20071015852
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者任俊鳳, 呂永軍, 周大勇, 瑜 張, 朱蓓薇, 李冬梅, 董秀萍, 高全義 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué);大連富谷水產(chǎn)有限公司