專利名稱：重組金黃色葡萄球菌腸毒素o的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程，涉及一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素O(Staphylococcal Enterotoxin O，SEO)的制備以及用于刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長。具體的說，就是利用來源于金黃色葡萄球菌的編碼SEO的基因與一種質(zhì)粒載體重組，并將其轉(zhuǎn)化至合適宿主進(jìn)行表達(dá)，通過親和純化獲得高純度的重組SEO蛋白，并利用其超抗原活性應(yīng)用于淋巴細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞抑制，并與作為目前臨床上使用的金葡菌濾液制劑主要有效成分的金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)進(jìn)行活性比較。
背景技術(shù)：
1989年，超抗原的概念由瑞典科學(xué)家White提出，它是一類由細(xì)菌、病毒、寄生蟲產(chǎn)生的對淋巴細(xì)胞有強(qiáng)大刺激功能的蛋白質(zhì)，由于其對T淋巴細(xì)胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故稱為超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)是目前全世界范圍內(nèi)廣泛研究的一種超抗原。其中研究最為深入的主要包括A型金黃色葡萄球菌腸毒素(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)、B型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal EnterotoxinB，SEB)、C2型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2，SEC2)等。
與普通抗原不同，腸毒素超抗原首先以完整分子結(jié)合于抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的抗原結(jié)合溝槽外側(cè)，而后與T細(xì)胞表面的抗原受體分子(TCR)的Vβ區(qū)結(jié)合，形成SE-MHC-TCR三分子復(fù)合物后大量激活T細(xì)胞。由此激活的T細(xì)胞可直接殺傷表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞，而對不表達(dá)MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞也可產(chǎn)生間接的殺傷效應(yīng)。同時，被SE激活的CD4+T細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，對腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用。IL-2等因子亦可激活自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，使其發(fā)揮自然殺傷作用，IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的MHC-II類分子的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞的識別。因此，經(jīng)SE激活的T細(xì)胞能對腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織產(chǎn)生高效的直接或者間接的殺傷作用。如Perabo等人證實經(jīng)SEB刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)能高效誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株RT112細(xì)胞和RT4細(xì)胞調(diào)亡。Hedlund等人進(jìn)行的體內(nèi)實驗表明，SEA激活T細(xì)胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，注射后1天出現(xiàn)最大效應(yīng)，增殖效應(yīng)維持4天。為提高在腫瘤治療中的靶向性和特異性，人們針對不同腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原，制備了多種相關(guān)抗原的單抗-超抗原融合蛋白或?qū)慰古c超抗原偶聯(lián)，大大增強(qiáng)了所激活的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織的靶向性，使其能特異地殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長。此外，人們還利用腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的受體的配體制備了配體-超抗原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T細(xì)胞對腫瘤組織的靶向性。另外，將超抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，將超抗原修飾的腫瘤細(xì)胞作為瘤苗繼而免疫動物，亦獲得了令人滿意的抵抗腫瘤細(xì)胞再次攻擊的效果。
在我國，以金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)為主要有效成分的金黃色葡萄球菌濾液制劑作為腫瘤防化療治療的輔助藥物應(yīng)用于臨床已有近十個年頭，大量的臨床數(shù)據(jù)證明使用后腫瘤患者的免疫能力獲得了顯著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身狀況均得到了明顯好轉(zhuǎn)。如羅鋒等對35例淺表轉(zhuǎn)移性腫瘤應(yīng)用金葡菌濾液制劑進(jìn)行局部治療，治療一個月后總有效率達(dá)82.9％。湯煒等通過對早期口腔癌采用局部金葡菌濾液制劑治療及對晚期口腔癌應(yīng)用金葡菌濾液制劑聯(lián)合化療，發(fā)現(xiàn)其可使大量淋巴細(xì)胞及纖維組織聚集在癌巢附近，并能觀察到腫瘤細(xì)胞顯著減少甚至部分病例腫瘤細(xì)胞消失。吳潔等將金葡菌濾液制劑作為化療的輔助藥物應(yīng)用于食管癌治療，結(jié)果顯示與對照組相比，可明顯升高白細(xì)胞，減輕胃腸道反應(yīng)。
盡管目前以SEC為主要有效成分的金葡菌濾液制劑已取得廣泛的應(yīng)用，但由于制劑中存在著大量的蛋白質(zhì)以及多肽類雜質(zhì)，而主要有效成分腸毒素相對含量極低，使得一部分腫瘤患者在該制劑臨床使用過程中出現(xiàn)了一定程度的相似副反應(yīng)。如，李洪等報道了分別有28％和24％的腫瘤患者在使用金葡菌濾液制劑并聯(lián)合卡鉑治療惡性胸腔積液過程中出現(xiàn)了發(fā)熱和局部疼痛等副反應(yīng)。劉秀英等在對鼻咽癌患者使用金葡菌濾液制劑聯(lián)合放療治療的過程中觀察到的主要副作用為中、低度發(fā)熱，約占治療組患者總數(shù)的5％。黎佳全等也報導(dǎo)了患者在應(yīng)用金葡菌濾液制劑聯(lián)合順鉑治療惡性胸水過程中出現(xiàn)的主要副作用為發(fā)熱，約占治療組患者總數(shù)的65.5％。雖然這些副反應(yīng)基本是暫時性的，癥狀可以自行緩解或者通過對癥治療進(jìn)行消除，但仍然對腫瘤患者的治療和康復(fù)造成了不良的影響。因此，對于目前金葡菌濾液制劑在臨床應(yīng)用中遇到的問題，需要制備高純度的腸毒素并建立嚴(yán)格可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐步克服解決，以求減少在使用過程中產(chǎn)生的毒副作用并增強(qiáng)其腫瘤抑制療效。目前，已經(jīng)有人利用基因工程手段制備金黃色葡萄球菌腸毒素超抗原，如姜永強(qiáng)等將SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220，在大腸桿菌中經(jīng)熱激誘導(dǎo)獲得表達(dá)，但這些方法中純化步驟均采用了離子交換的方法，存在吸附選擇特異性差等弱點。徐明愷等將SEC2基因克隆至pET-28a中表達(dá)，但表達(dá)的重組產(chǎn)物比天然蛋白增加36個氨基酸，因此抗原決定簇及產(chǎn)物活性改變的可能性均較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素O(Staphylococcal Enterotoxin O，SEO)的制備方法，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
本發(fā)明提供的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O(SEO)的制備方法是通過構(gòu)建一種可用于表達(dá)金黃色葡萄球菌腸毒素O的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.1的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成，質(zhì)粒見說明書附圖4。
本發(fā)明方法具體通過以下步驟實現(xiàn)(1)設(shè)計一對分別帶有BamH I和Xho I酶切位點的上下游引物SEQ IDNO.35’-gga tccaat gaa gaa gat c-3′(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點)，SEQ ID NO.45’-ctc gagttt cag att gtt atg-3’(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點)，以金黃色葡萄球菌(FRI 100)基因組為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得編碼SEO蛋白的基因片段，利用T-A克隆將其連入至pGEM-T質(zhì)粒載體上的多克隆位點，成功構(gòu)建pGEM-T-SEO重組質(zhì)粒。通過測序證實獲得的編碼SEO蛋白的基因片段序列(見SEQ ID NO.1)與SignalP 3.0 Server預(yù)測的蛋白質(zhì)的基因序列(見SEQ ID NO.2)相比，僅在N端多出2個氨基酸殘基。
(2)將上述步驟中得到的含內(nèi)切酶位點的編碼SEO蛋白成熟肽的基因片段用相應(yīng)內(nèi)切酶切割后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-1質(zhì)粒相連接，成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEO。
(3)將pGEX-4T-1-SEO表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的GST-SEO融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心并收集上清。將菌體上清液與能特異結(jié)合GST的親和填料充分混合，用洗脫液洗脫GST-SEO融合蛋白并收集，將收集到的融合蛋白與凝血酶在合適條件下充分反應(yīng)，反應(yīng)后的混合物再次與能特異結(jié)合GST的親和填料充分混合，分離并收集經(jīng)過純化的SEO蛋白，取樣電泳檢測。能特征性地結(jié)合GST的親和填料，優(yōu)選偶聯(lián)有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow。經(jīng)檢測獲得電泳純的純化產(chǎn)物后，將該純化產(chǎn)物經(jīng)過脫鹽、冷凍干燥即得重組SEO凍干粉。
初始獲得的蛋白為帶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的融合蛋白GST-SEO，先利用親和填料純化該融合蛋白，進(jìn)一步去除該標(biāo)簽后再次利用親和填料純化重組SEO蛋白。
初始獲得的GST-SEO融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15-25％。
(4)獲得電泳純的SEO蛋白后，采用單核細(xì)胞直接細(xì)胞毒性測定法(MTT法)，以有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)為陽性對照，建立合適的體外模型以觀察重組SEO蛋白對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以及受SEO刺激增殖的小鼠脾淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。應(yīng)用此模型同時觀察金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)的超抗原活性并與重組SEO蛋白的活性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示重組SEO蛋白具有典型的超抗原活性，并與SEC的作用相當(dāng)。
本發(fā)明的又一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素O在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法的特點是(1)提供了一種高純度的重組SEO蛋白，利用體外小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗和腫瘤細(xì)胞抑制實驗證實該重組蛋白具有典型的超抗原活性，且與SEC相當(dāng)。該重組蛋白在未被凝血酶切割前帶有GST標(biāo)簽，適合親和純化，經(jīng)凝血酶處理后的該蛋白質(zhì)氨基酸序列及相應(yīng)的核苷酸序列見SEQ ID NO.1，與相應(yīng)的天然蛋白相比，該重組蛋白在N端增加了2個氨基酸殘基；(2)提供了一種含有SEO基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEO，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.1所示核苷酸融合構(gòu)建而成，可轉(zhuǎn)化入合適的表達(dá)宿主，它含有強(qiáng)啟動子，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下可高效表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的GST-SEO融合蛋白；(3)使用含有由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.1的核苷酸構(gòu)建而成的表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，表達(dá)產(chǎn)物帶有GST標(biāo)簽，并使用含有能特異結(jié)合GST的親和填料來純化該產(chǎn)物；(4)提供了一種工程菌，該菌株含有表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEO，在合適的誘導(dǎo)劑作用下可高效表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的GST-SEO融合蛋白。(5)適用于高效制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開發(fā)。
本發(fā)明方法對重組SEO進(jìn)行了高效表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度占全菌蛋白的15-25％左右，且為可溶性表達(dá)，便于后續(xù)分離純化。融合蛋白經(jīng)凝血酶高效切割后，所得到的重組蛋白與相應(yīng)的天然蛋白相比，只在N端多出2個氨基酸。本發(fā)明方法采用親和層析對目的蛋白進(jìn)行純化，具有步驟簡單，純化速度快的特點，相比從金葡菌培養(yǎng)濾液中分離提取以及利用離子交換層析或分子篩層析等方法能獲得高純度的重組SEO蛋白。體外應(yīng)用該蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞生長，結(jié)果證明該目的蛋白具有典型的超抗原活性。鑒于在臨床獲得應(yīng)用的金葡菌濾液制劑的主要有效成分為SEC，本發(fā)明通過比較證實重組SEO蛋白的超抗原活性與SEC相當(dāng)，因此該重組SEO蛋白有望開發(fā)成為一種新的超抗原制劑用于腫瘤患者的臨床康復(fù)和治療。
在本說明書上下文中，除非特別指明，否則所引用的任何技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明的實驗方法是按照常規(guī)實驗方法進(jìn)行或按照供應(yīng)商所建議的操作說明進(jìn)行。


圖1為PCR擴(kuò)增所得含酶切位點的編碼SEO蛋白成熟肽基因瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2為PCR擴(kuò)增后所測編碼SEO基因序列測序結(jié)果圖。
圖3為重組pGEX-4T-1-SEO質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為重組SEO表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEO示意圖。
圖5為重組SEO在BL21(DE3)大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖。
圖6為重組SEO純化電泳圖。
圖7為重組SEO與SEC對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用。
圖8為重組SEO與SEC對耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的抑制作用。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步的說明。以下實施例提供了實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下面的實施例中所公開的技術(shù)表示由本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，這些技術(shù)能有效實施本發(fā)明。不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思的前提下，可以對這些具體實施方案進(jìn)行多種改變，仍然能獲得相似的結(jié)果。
實施例1SEO的基因克隆和pGEM-T-SEO重組質(zhì)粒的構(gòu)建編碼含酶切位點的SEO蛋白的成熟肽基因序列的PCR擴(kuò)增設(shè)計如下一對引物序列SEQ ID NO.3(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點)5’-gga tcctcc aatgaa gaa gat c-3′SEQ ID NO.4(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點)5’-ctc gagttt cag attgtt atg-3’以金黃色葡萄球菌(FRI 100)基因組模板，按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得721bp的DNA片段，PCR結(jié)果凝膠電泳圖參見圖1，其中泳道1核酸Marker；泳道2含酶切位點的編碼SEO蛋白成熟肽基因PCR產(chǎn)物。。
PCR體系H2O 60μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L)8μLBSA(5mg/mL)10μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L) 4μLdNTP(20mmol/L) 2μLTemplate(Genome of FRI 100，10ng/μL) 1μLTaq Polymerase(5U/μL) 1μLPCR程序1、95℃預(yù)變性3min2、95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min3、依步驟2循環(huán)34次4、72℃延伸10min含編碼SEO蛋白的成熟肽基因序列的pGEM-T-SEO重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增所得的SEO成熟肽基因克隆入pGEM-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增。提取該重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后送樣測序，結(jié)果顯示獲得的編碼SEO蛋白的成熟肽基因序列與SignalP 3.0 Server預(yù)測的蛋白質(zhì)的基因序列相比，僅在N端增加了2個氨基酸。測序結(jié)果參見圖2。
含編碼SEO成熟肽基因的pGEX-4T-1-SEO重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHI和Xho I分別酶切上述步驟中得到的含內(nèi)切酶位點的編碼SEO蛋白成熟肽的基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒。分別回收酶切后的含酶切位點的編碼SEO成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的大片段，并將兩者連接，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEO。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，經(jīng)過BamH I和Xho I酶切鑒定，結(jié)果表明目的基因片段已插入載體質(zhì)粒，電泳結(jié)果參見圖3，其中泳道1核酸Marker；泳道2重組pGEX-4T-1-SEO質(zhì)粒；泳道3重組pGEX-4T-1-SEO質(zhì)粒BamH I與Xho I雙酶切產(chǎn)物。pGEX-4T-1-SEO質(zhì)粒示意圖參見圖4，圖中標(biāo)示的“SEO”即為編碼SEN蛋白基因序列插入位置。目的基因在pGEX-4T-1-SEO質(zhì)粒上的詳細(xì)序列見SEQ IDNO.1。
實施例2重組SEO的表達(dá)SEO表達(dá)菌株的構(gòu)建從含有pGEX-4T-1-SEO重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α中提取該質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，通過抗生素抗性篩選陽性克隆，獲得可以大量表達(dá)GST-SEO融合蛋白的工程菌菌株。
融合蛋白GST-SEO的表達(dá)將上述工程菌單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6h，作為種子液。將該種子液以1-5％的接種量接種于含氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h，按0.01％-0.1％的體積比加入0.1mol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)5h。
實施例3重組SEO的純化樣品的預(yù)處理經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液4℃10000rpm離心，棄上清收集沉淀。沉淀用原菌液體積的1/10量的PBS重懸，將混懸液置FRENCH細(xì)胞破碎儀中，于700psi下破碎，懸液呈粘稠狀。后用超聲破碎儀繼續(xù)超聲破碎2min使核酸降解，菌體裂解液粘度降低。超聲后向菌體裂解液中加入20％的Triton-100至終濃度為1％，充分混勻，冰浴靜置30min。靜置完畢后將菌體裂解液4℃12000rpm離心30min，取上清液低溫保存待用。上清液取樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，在分子量50kD處有較濃的條帶，此即為誘導(dǎo)表達(dá)的GST-SEO融合蛋白。Quantity One圖像分析軟件顯示該條帶濃度大約占總蛋白濃度的15-25％。經(jīng)誘導(dǎo)后菌體裂解液蛋白電泳結(jié)果參見圖5，其中泳道1蛋白質(zhì)Marker；泳道2經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；泳道3未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白。
GST-SEO融合蛋白的純化取1mL經(jīng)過預(yù)處理的蛋白溶液，經(jīng)0.45μm膜過濾后加入至預(yù)平衡的1mL Glutathione Sepharose 4Fast Flow柱中，輕輕混勻，結(jié)合30min后流盡液體。用PBS沖洗柱子3次，每次10mL，流盡液體。向柱中加入0.5mL還原型谷胱甘肽洗脫液，輕輕混勻。反應(yīng)20min后收集溶液，用紫外分光光度計測蛋白濃度。重復(fù)上步的洗脫步驟直至蛋白濃度低于0.1mg/mL停止收集，結(jié)果顯示各洗脫液組分中蛋白濃度呈正態(tài)分布。將各收集組分用SDS-PAGE檢驗純度與濃度，結(jié)果顯示純化得到的GST-SEO融合蛋白為單一條帶，分子量約53kD，電泳結(jié)果參見圖6。
融合蛋白的切割將上述純化得到的GST-SEO融合蛋白收集組分合并，經(jīng)過脫鹽柱或者用10000截留分子量的透析帶透析，將溶液置換成含1.5mol/LNaCl、2.5mmol/LCaCl2的凝血酶緩沖溶液并同時去除溶液中的谷胱甘肽。每1mL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2μL，25℃反應(yīng)24h，取樣電泳，檢測酶切反應(yīng)程度。
重組SEO的純化將反應(yīng)后的蛋白溶液加入至預(yù)平衡的GlutathioneSepharose 4 Fast Flow柱子中，輕輕混勻，靜置20min后使液體流盡并收集。SDS-PAGE檢測溶液中蛋白純度與濃度。結(jié)果顯示融合蛋白的GST標(biāo)簽已去除，在26KD分子量附近有單一條帶，即為純化的SEO蛋白，將純化后的蛋白溶液脫鹽后凍干保存。SEO純化蛋白電泳結(jié)果參見圖6，其中泳道1蛋白質(zhì)Marker；泳道2純化后的GST-SEO融合蛋白；泳道3Thrombin切割后純化的重組SEO蛋白。
實施例4MTT法測定重組SEO對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用以ICR小鼠的脾淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，將其懸浮于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL，每孔100μL鋪于96孔板中，設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、空白孔(脾淋巴細(xì)胞+培養(yǎng)基)、陽性對照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+Con A)和實驗孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+三個不同濃度梯度的SEO)，每種設(shè)四個復(fù)孔。其中，Con A終濃度為10μg/mL，SEO終濃度分別為1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。于鋪板后44h在待測孔中加入10μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長法(570nm為測定波長，630nm為參考波長)測定各孔OD570nm-OD630nm值，計算淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(供試品組平均吸光度值/空白對照組平均吸光度值)(增殖指數(shù)≥1.5認(rèn)為結(jié)果呈陽性)，作圖分析作用腸毒素對淋巴細(xì)胞的增殖作用，并用student t檢驗做統(tǒng)計分析。
與陰性對照組相比，在陽性對照ConA、1μg·mL-1和0.1μg·mL-1SEO作用48h后，小鼠脾淋巴細(xì)胞均有極顯著增加(P＜0.001)；0.01μg·mL-1rSEO作用48h后，小鼠脾淋巴細(xì)胞有顯著增加(P＜0.05)，同時隨著作用蛋白濃度的增加作用效果也更加顯著，參見圖7圖7為重組SEO與SEC對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用(48h)，與空白對照組相比***P＜0.001；*P＜0.05。按相同實驗方案檢測SEC對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用，經(jīng)比較，在實驗濃度范圍內(nèi)，重組SEO對ICR小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用與SEC大體相當(dāng)。
實施例5MTT法測定重組腸毒素SEO的體外抑瘤活性設(shè)調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、腫瘤細(xì)胞對照孔(培養(yǎng)基+腫瘤細(xì)胞)、淋巴細(xì)胞本底釋放孔[含空白孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞)、陽性對照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+Con A)和實驗孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+四個不同濃度梯度的SEO)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞)、陽性對照孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+ConA)和實驗孔(培養(yǎng)基+脾淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞+四個不同濃度梯度的SEO)]，每種設(shè)三個復(fù)孔。其中，ConA終濃度為10μg/mL，SEO終濃度分別為1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL，本底釋放孔中5×106個/mL脾淋巴細(xì)胞以100μL/孔加入，腫瘤作用孔中5×106個/mL脾淋巴細(xì)胞和2.5×105個/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的混合懸液以100μL/孔加入到實驗孔中，最后按用10％胎牛血清(FCS)RPMI1640培養(yǎng)基稀釋藥物至要求濃度，50μL/孔加入各孔，并小心吹打混勻。
鋪板后44h在待測孔中加入15μL/孔的甲基噻唑基四唑(MTT)溶液，小心吹打混勻后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的二甲基亞砜(DMSO)，吹打助溶后培養(yǎng)箱中放置10min，酶標(biāo)儀雙波長法(570nm為測定波長，630nm為參考波長)測定各孔OD570nm-OD630nm值，僅含培養(yǎng)基的調(diào)零孔調(diào)零。按下式計算抑瘤率抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴細(xì)胞本底釋放孔)/腫瘤細(xì)胞對照孔]×100，作圖分析腸毒素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，并用student t檢驗做統(tǒng)計分析。
MTT法測定SEO體外抑瘤活性實驗，SEO以K562-AD作靶細(xì)胞，與抑瘤陰性對照孔相比，在陽性對照Con A和0.01～1μg/mL的SEO作用48h后抑瘤率均有極顯著的增高(P＜0.001)；并且隨著SEO濃度的增加作用效果也更加顯著，參見圖8圖8為重組SEO與SEC對耐阿霉素慢性髓原性白血病細(xì)胞(K562-AD)的抑制作用(48h)，與空白對照組相比***P＜0.001。按相同實驗方案檢測SEC對K562-AD細(xì)胞的抑制作用，經(jīng)比較，在實驗濃度范圍內(nèi)，重組SEO對K562-AD細(xì)胞的抑制作用與SEC大體相當(dāng)。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>金黃色葡萄球菌腸毒素O的制備及應(yīng)用<160>4<210>1<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(702)<223>含部分凝血酶酶切位點序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O<440>1gga tcc aat gaa gaa gat cct aaa ata gag agt ttg tgt aag aag45Gly Ser Asn Glu Glu Asp Pro Lys Ile Glu Ser Leu Cys Lys Lys1 5 10 15tca agt gta gac cct att gct tta cat aat att aat gat gat tat90Ser Ser Val Asp Pro Ile Ala Leu His Asn Ile Asn Asp Asp Tyr16 20 25 30ata aat aat cga ttt acg aca gta aaa tca att gta tca act aca135Ile Asn Asn Arg Phe Thr Thr Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Thr31 35 40 45gaa aaa ttc tta gac ttc gat tta tta ttt aaa agt att aat tgg180Glu Lys Phe Leu Asp Phe Asp Leu Leu Phe Lys Ser Ile Asn Trp46 50 55 60tta gat gga ata tct gct gaa ttt aaa gat tta aaa gtg gaa ttt225Leu Asp Gly Ile Ser Ala Glu Phe Lys Asp Leu Lys Val Glu Phe61 65 70 75agc tca tca gcg att tct aaa gaa ttt cta gga aag act gtt gat270Ser Ser Ser Ala Ile Ser Lys Glu Phe Leu Gly Lys Thr Val Asp76 80 85 90
att tat ggt gtt tac tat aaa gca cat tgt cat ggt gag cat caa315Ile Tyr Gly Val Tyr Tyr Lys Ala His Cys His Gly Glu His Gln91 95 100 105gtg gat act gcc tgt aca tat ggt ggg gta aca cct cat gaa aat360Val Asp Thr Ala Cys Thr Tyr Gly Gly Val Thr Pro His Glu Asn106 110 115 120aat aaa tta agc gag cct aaa aat ata gga gta gct gtg tat aag405Asn Lys Leu Ser Glu Pro Lys Asn Ile Gly Val Ala Val Tyr Lys121 125 130 135gat aat gta aat gtt aat aca ttt atc gtt act aca gat aaa aag450Asp Asn Val Asn Val Asn Thr Phe Ile Val Thr Thr Asp Lys Lys136 140 145 150aaa gtt act gca caa gaa ctt gat att aaa gta aga aca aaa tta495Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Ile Lys Val Arg Thr Lys Leu151 155 160 165aat aat gca tat aaa ttg tat gac aga atg act agt gat gta caa540Asn Asn Ala Tyr Lys Leu Tyr Asp Arg Met Thr Ser Asp Val Gln166 170 175 180aaa ggt tat att aaa ttt cat tct cat tcg gag cat aaa gaa tca585Lys Gly Tyr Ile Lys Phe His Ser His Ser Glu His Lys Glu Ser181 185 190 195ttt tat tat gat tta ttt tat att aaa gga aat tta cca gat caa630Phe Tyr Tyr Asp Leu Phe Tyr Ile Lys Gly Asn Lea Pro Asp Gln196 200 205 210tat ttg caa att tat aat gat aat aaa aca ata gat tca tca gac675Tyr Leu Gln Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Ile Asp Ser Ser Asp211 215 220 225tat cat att gat gtt tat tta ttt aca702Tyr His Ile Asp Val Tyr Leu Phe Thr226 230 234<210>2<211>696<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(696)<223>克隆所得金黃色葡萄球菌腸毒素O<440>2aat gaa gaa gat cct aaa ata gag agt ttg tgt aag aag tca agt45Asn Glu Glu Asp Pro Lys Ile Glu Ser Leu Cys Lys Lys Ser Ser1 5 10 15gta gac cct att gct tta cat aat att aat gat gat tat ata aat90Val Asp Pro Ile Ala Leu His Asn Ile Asn Asp Asp Tyr Ile Asn16 20 25 30aat cga ttt acg aca gta aaa tca att gta tca act aca gaa aaa135Asn Arg Phe Thr Thr Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Thr Glu Lys31 35 40 45ttc tta gac ttc gat tta tta ttt aaa agt att aat tgg tta gat180Phe Leu Asp Phe Asp Leu Leu Phe Lys Ser Ile Asn Trp Leu Asp46 50 55 60gga ata tct gct gaa ttt aaa gat tta aaa gtg gaa ttt agc tca225Gly Ile Ser Ala Glu Phe Lys Asp Leu Lys Val Glu Phe Ser Ser61 65 70 75tca gcg att tct aaa gaa ttt cta gga aag act gtt gat att tat270Ser Ala Ile Ser Lys Glu Phe Leu Gly Lys Thr Val Asp Ile Tyr76 80 85 90ggt gtt tac tat aaa gca cat tgt cat ggt gag cat caa gtg gat315Gly Val Tyr Tyr Lys Ala His Cys His Gly Glu His Gln Val Asp91 95 100 105act gcc tgt aca tat ggt ggg gta aca cct cat gaa aat aat aaa360Thr Ala Cys Thr Tyr Gly Gly Val Thr Pro His Glu Asn Asn Lys106 110 115 120tta agc gag cct aaa aat ata gga gta gct gtg tat aag gat aat405Leu Ser Glu Pro Lys Asn Ile Gly Val Ala Val Tyr Lys Asp Asn121 125 130 135gta aat gtt aat aca ttt atc gtt act aca gat aaa aag aaa gtt450Val Asn Val Asn Thr Phe Ile Val Thr Thr Asp Lys Lys Lys Val136 140 145 150act gca caa gaa ctt gat att aaa gta aga aca aaa tta aat aat495
Thr Ala Gln Glu Leu Asp Ile Lys Val Arg Thr Lys Leu Asn Asn151 155 160 165gca tat aaa ttg tat gac aga atg act agt gat gta caa aaa ggt540Ala Tyr Lys Leu Tyr Asp Arg Met Thr Ser Asp Val Gln Lys Gly166 170 175 180tat att aaa ttt cat tct cat tcg gag cat aaa gaa tca ttt tat585Tyr Ile Lys Phe His Ser His Ser Glu His Lys Glu Ser Phe Tyr181 185 190 195tat gat tta ttt tat att aaa gga aat tta cca gat caa tat ttg630Tyr Asp Leu Phe Tyr Ile Lys Gly Asn Leu Pro Asp Gln Tyr Leu196 200 205 210caa att tat aat gat aat aaa aca ata gat tca tca gac tat cat675Gln Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Ile Asp Ser Ser Asp Tyr His211 215 220 225att gat gtt tat tta ttt aca696Ile Asp Val Tyr Leu Phe Thr226 230 232<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴(kuò)增含酶切位點的金黃色葡萄球菌腸毒素O基因所用的上游引物<440>3gga tcc aat gaa gaa gat c<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴(kuò)增含酶切位點的金黃色葡萄球菌腸毒素O基因所用的下游引物<440>4ctc gag ttt cag att gtt atg
權(quán)利要求
1.一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素O的制備方法，該蛋白為一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)(1)以金黃色葡萄球菌基因組作為模板，在目的基因兩端添加BamH I和Xho I酶切位點，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過基因測序證實獲得的目的基因片段序列與SignalP 3.0 Server預(yù)測的金黃色葡萄球菌腸毒素O成熟肽蛋白質(zhì)的基因序列相比，僅在N端多出了2個氨基酸，將獲得的目的基因片段序列連入pGEM-T載體；(2)利用亞克隆技術(shù)構(gòu)建pGEX-4T-1-SEO重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，采用常規(guī)方法IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；(3)利用能特異性地結(jié)合谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的親和純化填料純化重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白，電泳鑒定結(jié)果顯示獲得了高純度的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白；其中步驟(1)用于擴(kuò)增含BamH I和Xho I酶切位點的編碼腸毒素SEO成熟肽基因的上游引物是SEQ ID NO.35’-gga tccaat gaa gaa gat c-3′，劃線部分為BamH I酶切位點，下游引物是SEQ ID NO.45’-ctc gagttt cag att gttatg-3’，劃線部分為Xho I酶切位點，pGEX-4T-1-SEO重組質(zhì)粒是由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.1的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成；步驟(2)適合質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEO原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白的宿主，選用大腸桿菌BL21。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O的制備方法，其特征是原核表達(dá)系統(tǒng)由pGEX-4T-1質(zhì)粒和重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的基因序列重組構(gòu)建而成，用于帶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的制備方法，其特征是通過PCR擴(kuò)增從金黃色葡萄球菌菌株基因組中獲得添加了酶切位點的編碼金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的目的基因片段，將其克隆至pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)pGEX-4T-1-SEO，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至合適的大腸桿菌宿主用于表達(dá)重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的制備方法，其特征是初始獲得的蛋白為帶有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的融合蛋白GST-SEO，先利用親和填料純化該融合蛋白，進(jìn)一步去除該標(biāo)簽后再次利用親和填料純化重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的制備方法，其特征是能特征性地結(jié)合谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的親和填料，選用偶聯(lián)有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O蛋白的制備方法，其特征是初始獲得的GST-SEO融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15-25％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1獲得的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1獲得的重組金黃色葡萄球菌腸毒素O在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素O的制備方法，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本發(fā)明是通過構(gòu)建一種可用于表達(dá)金黃色葡萄球菌腸毒素O的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒由pGEX－4T－1和SEQ ID NO.1的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成，初始獲得的GST－SEO融合蛋白占細(xì)菌總蛋白含量的15－25％。本發(fā)明利用其超抗原活性應(yīng)用于體外促脾淋巴細(xì)胞增殖以及體外抑制腫瘤細(xì)胞生長，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C進(jìn)行超抗原活性比較，證實該重組蛋白具有典型的超抗原活性，且與SEC相當(dāng)。適用于高效制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開發(fā)，可在制備刺激淋巴細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/195GK101045924SQ20071006740
公開日2007年10月3日 申請日期2007年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日
發(fā)明者陳樞青, 潘映秋, 丁丁 申請人:浙江大學(xué)