專利名稱：μ-芋螺毒素肽及其作為局部麻醉藥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的μ-芋螺毒素肽、該μ-芋螺毒素肽的生物活性片段、它們的鹽、它們的組合、和/或它們的變體。本發(fā)明還涉及它們在用于治療或預防疼痛的藥物組合物中的用途，和它們在制備麻醉藥中的用途。

背景技術(shù)：
芋螺屬(Conus)的海生芋螺(cone snail)的毒液是生物活性成分的豐富且極多樣的來源。世界范圍可得到的芋螺物種超過800個，芋螺毒液表現(xiàn)為顯示出類型廣泛的生物學活性的天然存在肽的最豐富來源之一。芋螺肽以高度的親和力及特異性靶向大量不同的分子實體，所述分子實體包括電壓敏感離子通道、配體門控離子通道和G蛋白偶聯(lián)受體(McIntosh等，1999；Olivera等，1985；Olivera等，1990)。在現(xiàn)存的所有芋螺肽中，僅一小部分已經(jīng)通過分離、至精確分子靶的一級結(jié)構(gòu)闡明而得到廣泛地表征。不過，這個研究領(lǐng)域已經(jīng)吸引了越來越多的關(guān)注，因為芋螺肽提供了用于剖析先前未表征的通道的新型而重要的工具。通過使用在初始生理靶上發(fā)揮作用的新藥物，這還為全新的生物醫(yī)療應用提供了機會。這可以舉例說明為發(fā)現(xiàn)并使用用于區(qū)分特定鈣亞型的ω-芋螺毒素和進一步使用它們中的一種作為控制疼痛的藥物

(Kerr和Yoshikami，1984；Olivera等，1984；Olivera等，1987)。
μ-芋螺肽家族首個代表的公布出現(xiàn)在1983年，表征了顯示肌毒活性的地紋芋螺毒素(geographutoxin)(Sato等，1983)。此后分離并鑒定出幾種其它的μ-芋螺肽。迄今為止，已經(jīng)表征了來自6個不同的芋螺物種(主要包括食魚物種和一個食貝物種)的總計9種μ-芋螺肽。
這些μ-芋螺肽全部展示出由序列中的半胱氨酸殘基的保守位置所顯示的共同一級結(jié)構(gòu)。二硫鍵位于Cys1-Cys4、Cys2-Cys5和Cys3-Cys6之間。這種折疊產(chǎn)生約束性的三級結(jié)構(gòu)，已經(jīng)對μ-芋螺肽家族的幾個代表進行了所述三級結(jié)構(gòu)的研究(Hill等，1996；Keizer等，2003；Nielsen等，2002；Ott等，1991；Wakamatsu等，1992)。已經(jīng)在眾多研究中證實μ-芋螺肽或多或少地特異性靶向多種電壓敏感性鈉通道(Becker等，1989；Bulaj等，2005；Cruz等，1985；Cruz等，1989；Fainzilber等，1995；French等，1996；Safo等，2000；Sato等，1991；West等，2002)。無論靶向哪一種鈉通道亞型，藥理作用往往包括阻斷通道傳導性，使電壓敏感性通道功能受到抑制。
電壓敏感性鈉通道(Voltage-sensitive sodium channel，VSSC)是對細胞通信非常重要的跨膜蛋白，因為它們產(chǎn)生動作電位并能夠使其在大多數(shù)脊椎動物和無脊椎動物的可興奮細胞中傳播。目前已經(jīng)鑒定了9種編碼哺乳動物VSSC的基因(Yu和Catterall，2003)。根據(jù)VSSC對河豚毒素(TTX)(特別從河豚中分離的一種毒素)的敏感性，對VSSC進行了分類。受TTX阻滯的VSSC稱作TTX-敏感性，而其它則是TTX-抗性通道。VSSC的每種亞型具有依賴于其細胞定位和組織定位的特異化的功能。
VSSC在肌肉和神經(jīng)的動作電位傳導中具有重要作用，因此在麻醉中提供關(guān)鍵靶。藥物如利多卡因或普魯卡因通過抑制存在于感覺纖維中的VSSC而發(fā)揮作用(Scholz，2002)。然而，在全部纖維中沒有出現(xiàn)相同的抑制作用，其原因是存在的眾多VSSC亞型受所述藥物的影響有差異。在這些亞型中，TTX-抗性VSSC亞型在疼痛傳導中具有優(yōu)勢地位并且目前未特異性地被任何已知藥物靶向。另外，利多卡因和普魯卡因的持續(xù)時間短并且已證實其應用引起副反應或過敏，使得利多卡因和普魯卡因難以在具體病例中用作麻醉藥(anaesthesics)。在這種情況下，能夠特異性地抑制TTX-抗性VSSC的化合物將表現(xiàn)出對疼痛進行控制的主要作用。作為實例，亞型Nav1.8有助于啟動并維持痛覺過敏。在神經(jīng)性疼痛的早期，在受損的初始傳入神經(jīng)元中，Nav1.8的表達降低，而在毗鄰的神經(jīng)元中，Nav1.8的表達水平得到維持(Decosterd等，2002；Gold等，2003)。然而，坐骨神經(jīng)損傷兩日后，在與C纖維相符的傳導速率下，Nav1.8的表達存在顯著上調(diào)，并且TTX-抗性復合動作電位成比例地增加(Gold等，2003)。這有力地支持了Nav1.8在神經(jīng)性疼痛中的重要地位。
VSSC因此代表其抑制或調(diào)節(jié)允許麻醉、止痛和疼痛控制的有用靶(Baker和Wood，2001；Julius和Basbaum，2001；Lee，1976)。
數(shù)目眾多的肽作為分離的μ-芋螺毒素從專利申請WO 02/07678(猶他大學研究基金會(University of Utah Research Foundation)和Cognetix，Inc.)中獲知。然而，該文獻提供的對所述肽的描述是模糊的并且有時容易誤解，以至于難以依賴該文獻的內(nèi)容。很大程度上，在該文獻中描述的大部分肽似乎已經(jīng)僅通過分子生物學技術(shù)、通過分離并克隆編碼μ-芋螺毒素肽的DNA、翻譯并測定毒素序列而鑒定。僅依賴于此類技術(shù)可能導致錯誤，因為自然界中可以因編碼的肽的翻譯后修飾而產(chǎn)生活性氨基酸殘基，其中某些所述的活性氨基酸殘基不能直接從核苷酸序列中找到。
最近，專利申請WO 2004/0099238(昆士蘭大學(The University ofQueensland))也公開了新的μ-芋螺毒素肽及其衍生物，它們在分析法和探針中作為神經(jīng)元活性鈉通道抑制劑(拮抗劑)的用途以及在治療疾病(包括疼痛、癌、癲癇和心血管病)中的用途。該申請也公開這些新的μ-芋螺毒素肽在放射配體結(jié)合測定(RLB)中的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些結(jié)果不表示μ-芋螺毒素的任何生物學活性，而僅表示結(jié)合作用，因為從文獻中已知一些化合物(包括芋螺毒素)與它們的通道/受體位點結(jié)合，但無任何生物學活性(Fainzilber等，1994；Shichor等，1996)。此外，在這些結(jié)合實驗中所顯示的效力與體外(in vitro)或體內(nèi)(in vivo)抑制效力不相關(guān)，因此使讀者不了解任何潛在的生物學抑制效力。另外，僅在所提及的表達的VSSC通道上的抑制活性(IC50)超過1-3μM，因而表明在離體(ex vivo)或體內(nèi)制劑中使用時的濃度甚至更高。
因此無論何時仍需要具有強效和長效生物學活性的新化合物用作麻醉藥，該新化合物具有優(yōu)異的安全性能，僅有少量副作用或沒有副作用，并且能夠退降。
該目標已經(jīng)通過提供新的μ-芋螺毒素肽、其生物活性片段、其鹽、其組合、和/或其變體而實現(xiàn)。本發(fā)明的作用持續(xù)時間長的肽可以用于制備麻醉藥及治療疼痛。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種μ-芋螺毒素肽，該μ-芋螺毒素肽基本上包括如下SEQID No 1所示的氨基酸序列、該氨基酸序列的生物活性片段、它們的組合、和/或它們的變體Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17。
另外，本發(fā)明提供了一種分離或純化的核酸序列，該核酸序列包括編碼本發(fā)明的肽的氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物以及該藥物組合物在制備用于治療或預防與電壓敏感性鈉通道相關(guān)的疾病的藥物中的用途，該藥物組合物含有藥物有效量的至少一種本發(fā)明的肽作為活性物質(zhì)。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的藥物組合物在制備麻醉藥中的用途以及該藥物組合物在用于在接受需要麻醉的手術(shù)操作的患者體內(nèi)提供骨骼肌松弛的方法中的用途。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于治療或預防疼痛的方法。



圖1代表天然μ-芋螺肽CnIIIA的電噴霧離子化質(zhì)譜(electrosprayionization mass spectrum)。質(zhì)量測量在QTOF I質(zhì)譜儀上在陽離子模式和TOF-MS配置下實施。所示的質(zhì)量為測得的單一同位素的分子質(zhì)量?？梢宰⒁獾紺nIIIA的鉀加合物； 圖2描述對合成的和天然的μ-芋螺肽CnIIIA的同一性的控制。圖2A通過合成肽、天然肽和兩種肽的50:50的混合物的反相高壓液相色譜(HPLC)而進行的共洗脫實驗。圖2B還原的合成CnIIIA(上部)以及還原的天然CnIIIA(下部)的MS/MS，顯示相同的片段化性質(zhì)； 圖3顯示μ-芋螺肽CnIIIA對小鼠半膈(hemidiaphragm)收縮的作用。圖3ACnIIIA對通過直接刺激小鼠半膈所激發(fā)的肌肉收縮的作用。在不存在CnIIIA和存在100-600nM CnIIIA的條件下記錄的收縮跡線。圖3BCnIII對收縮的作用的劑量-反應曲線。對于CnIIIA的每個濃度，基于對照值來表述收縮的最大幅度。理論曲線根據(jù)所示方程式建立，希爾數(shù)(Hill number)(nH)是1.78，并且收縮被抑制50％所需要的CnIIIA濃度(KD)是150nM。n次實驗的平均值±SEM； 圖4顯示在蛙皮胸肌(Cutaneous pectoris muscle)制備物上記錄的μ-芋螺肽CnIIIA對動作電位和突觸應答的作用。圖4A蛙皮胸肌上記錄的CnIIIA對肌動作電位的作用在1μM CnIIIA施加至浴液之前或在施加之后的不同時間點記錄的與運動神經(jīng)刺激相對應的動作電位跡線和EPP?？梢宰⒁獾郊幼麟娢坏倪M行性阻滯。圖4B在蛙皮胸肌上記錄的CnIIIA對突觸應答的作用在不存在CnIIIA和存在1μM及2μM CnIIIA的條件下記錄的MEPP平均跡線； 圖5代表μ-芋螺毒素CnIIIA對分離自小鼠的坐骨神經(jīng)的整體動作電位(GAP)的作用。圖5A在對照條件(不添加毒素)下和用芋螺毒素CnIIIA的多種濃度(0.1-50μM)處理神經(jīng)時強度在0.1-15V之間變化的0.05ms刺激響應的GAP記錄。圖5B對不同強度的0.05毫秒刺激的響應和對不同濃度的CnIIIA毒素(左側(cè))的響應的GAP幅度。圖5C該表匯總了多種強度(0.1-15V)的0.05ms刺激后所記錄的GAP的不同參數(shù)。(1)在存在或不存在μ-芋螺毒素的條件下進行15V刺激后所記錄的最大幅度之間的比值。(2)與15V刺激后最大幅度的50％相對應的刺激強度。n條坐骨神經(jīng)的平均值±SEM； 圖6代表在芋螺毒素以多種濃度(0.1-50μM)存在的條件下記錄的μ-芋螺毒素CnIIIA對小鼠坐骨神經(jīng)的GAP的作用。在毒素的多種濃度(0.1-100μM)下所記錄的GAP的最大幅度根據(jù)對照值進行表述。理論曲線根據(jù)以下等式計算ACnIIIA/AC＝1/[1+([μ-芋螺毒素CnIIIA]/KD)nH]。Hill數(shù)(nH)是1.02，并且阻滯50％ GAP所需要的毒素濃度(KD)是1.53μM。n條坐骨神經(jīng)的平均值±SEM； 圖7描述研究μ-芋螺毒素CnIIIA對分離自小鼠的坐骨神經(jīng)的GAP的作用的可逆性。0.05毫秒刺激在對照條件下以多種強度(0.1-15V)作用于神經(jīng)后記錄GAP，0.05毫秒刺激以多種強度(0.1-15V)作用于用2、10或50μMCnIIIA毒素處理的神經(jīng)或在新鮮哺乳動物林格氏溶液(Ringer’s solution)中洗滌16小時或24小時的神經(jīng)后記錄GAP。n條坐骨神經(jīng)的平均值±SEM； 圖8表示μ-芋螺毒素CnIIIA對分離自歐洲狗魚(白斑狗魚(Esox lucius))的嗅神經(jīng)的整體動作電位(GAP)的作用。圖8A在對照條件(不添加毒素)下和用多種濃度(0.02-1μM)的芋螺毒素CnIIIA處理神經(jīng)時，對強度在1-15V之間變化的8ms刺激的響應的GAP記錄。圖8B對不同強度的8ms刺激的響應和對不同濃度的CnIIIA毒素持續(xù)不同接觸時間(左側(cè))的響應的GAP幅度。圖8C該表匯總了多種強度(1-15V)的8毫秒刺激后所記錄的GAP的不同參數(shù)。(1)在存在或不存在μ-芋螺毒素的條件下進行15V刺激后所記錄的最大幅度之間的比值。(2)與15V刺激后最大幅度的50％相對應的刺激強度。n條嗅神經(jīng)的平均值±SEM； 圖9顯示在芋螺毒素以多種濃度(0.01-10μM)存在的條件下記錄的μ-芋螺毒素CnIIIA對分離自歐洲狗魚(白斑狗魚)的嗅神經(jīng)的GAP的作用，并相對與對照值進行表述。在毒素的多種濃度(0.1-100μM)的條件下所記錄的GAP的最大幅度根據(jù)對照值進行表述。理論曲線根據(jù)以下等式計算ACnIIIA/AC＝1/[1+([μ-芋螺毒素CnIIIA]/KD)nH]。Hill數(shù)(nH)是1.09并且阻滯50％GAP所需要的毒素濃度(KD)是0.15μM。n條嗅神經(jīng)的平均值±SEM； 圖10顯示μ-芋螺毒素CnIIIA的表面麻醉作用及其與利多卡因的表面麻醉作用的比較。麻醉作用的強度表述為以所測試的每種濃度沒有誘導出眼-眼瞼反射的刺激的總數(shù)。數(shù)據(jù)代表6次不同測定的平均值±S.E.M； 圖11顯示在小鼠體內(nèi)得到的趾外展評分(Digit Abduction Score，DAS)； 圖12顯示在小鼠體內(nèi)得到的握力評估； 圖13顯示通過40分鐘溫育后，與CnIIIA(100nM)相比，對每種肽(100nM)所測量的肌肉的相對平均收縮抑制。為便于比較，CnIIIA已經(jīng)歸一化至100％。所有肽SmIIIA、PIIIA和T3.1顯示出的活性均比CnIIIA低； 圖14中，A顯示在500nM CnIIIA的存在下，作為時間的函數(shù)的Nav1.4電流跡線；BNav1.4電流/Nav1.4最大電流在500nM CnIIIA濃度下隨時間的圖表。電流已經(jīng)歸一化至1。維持電位是-90mV并且測試電位是-10mV； 圖15中，A顯示在作為對照的HEK細胞中記錄的鈉電流；B在50nMCnIIIA存在下；以及C由CnIIIA所致的鈉電流抑制與時間的函數(shù)關(guān)系。注意在穩(wěn)態(tài)水平后的洗滌步驟不足以抑制阻斷作用。

具體實施例方式 如本文中所用，“一種(a)”或“一種(an)”意指“至少一個”或“一個或多個”。
如本文中所用，術(shù)語“肽”、“蛋白質(zhì)”、“多肽”、“多肽的”和“肽的”可互換使用以表示通過相鄰殘基的α-氨基和羧基間的肽鍵而相互連接的一系列氨基酸殘基。
如本文中所用，術(shù)語“含有”通常用作包括的意思，也即允許存在一個或多個特征或成分。
芋螺肽是可以與芋螺毒素及芋螺毒素肽互換的另一個術(shù)語。芋螺毒素是一些效力最強和最多樣的已知神經(jīng)毒素，具有難以置信的廣泛的作用范圍。有趣的是，不僅在食貝種類和食魚種類之間存在明顯區(qū)別，而且組內(nèi)的種類之間甚至相同種類的個體之間也存在明顯區(qū)別。來自食魚芋螺的毒素對人類系統(tǒng)的生物活性也比食貝類芋螺強，而且已經(jīng)出現(xiàn)死亡。
三個主要類別的麻痹性毒素已經(jīng)成為透徹研究的焦點，其中這三類麻痹性毒素均干擾神經(jīng)元通信，但干擾不同的靶α-芋螺毒素結(jié)合并抑制煙堿乙酰膽堿受體；μ-芋螺毒素通過與突觸后鈉通道結(jié)合而直接消除肌動作電位；和ω-芋螺毒素通過防止鈣以電壓激活方式進入神經(jīng)末梢而減少乙酰膽堿的釋放。
μ-芋螺肽分離自芋螺屬海生芋螺的毒液。μ-芋螺肽的一級結(jié)構(gòu)由通過3個二硫橋(disulfide bridge)折疊的15-30個氨基酸組成。這些肽靶向可以在肌肉或神經(jīng)系統(tǒng)中存在的多種電壓敏感性鈉通道。已經(jīng)鑒定了μ-芋螺肽類的多個成員并公布了它們的序列。來自地紋芋螺(C.geographus)毒液的GIIIA、GIIIB和GIIIC是骨骼肌VSSC而不是神經(jīng)元VSSC的有效阻斷劑(Cruz等，1985)。發(fā)現(xiàn)來自紫金芋螺(C.purpurescens)的PIIIA抑制肌肉的TTX-敏感性VSSC并且以較弱的程度抑制神經(jīng)元TTX-敏感性VSSC(Shon等，1998)。
不幸的是，這些芋螺毒素對神經(jīng)元VSSC不是特別有效并且對骨骼肌VSSC沒有選擇性(GIIIA，GIIIB和GIIIC)、或不能夠區(qū)分骨骼肌VSSC與神經(jīng)元VSSC的亞型(PIIIA)。另外，已經(jīng)證實這些肽缺少立體(3D)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并且其構(gòu)象易于在溶液中互變(Nielsen等，2002)。
在鑒定和表征新的芋螺肽的過程中，申請人已經(jīng)證實μ-芋螺肽家族顯示出作為運動神經(jīng)元以及感覺神經(jīng)元中哺乳動物神經(jīng)肌接頭阻滯劑以及動作電位的有力抑制劑的極強烈的特征。這種新μ-芋螺毒素肽基本上包括如下SEQ ID No 1所示的氨基酸序列、該氨基酸序列的生物活性片段、它們的鹽、它們的組合和/或它們的變體 Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17 SEQ ID No 1 其中Cys表示半胱氨酸。
通常，Xaa1是任何N-修飾的酸性氨基酸。優(yōu)選地，這種修飾選自包括乙?；⒓柞；⑷舛罐Ⅴ；?myristoylation)或吡咯烷酮的組中。甲酰化施用于甲硫氨酸(N-甲?；琢虬彼?。乙?；┯糜谠S多殘基，包括甲硫氨酸(N-乙?；琢虬彼?、蘇氨酸(N-乙?；K氨酸)、絲氨酸(N-乙?；z氨酸)、天冬氨酸(N-乙?；於彼?、谷氨酸(N-乙?；劝彼?、甘氨酸、纈氨酸和丙氨酸。肉豆蔻?；┯糜贜-肉豆蔻?；拾彼?。
最優(yōu)選地，修飾的酸性氨基酸為焦谷氨酸鹽(pyroglutamate)(pGlu或Z)。
Xaa2優(yōu)選為甘氨酸(Gly)。
Xaa3為任何酸性氨基酸或酸性氨基酸的任何酰胺形式。優(yōu)選地，Xaa3為天冬酰胺(Asn)。
Xaa4通常為甘氨酸(Gly)。
Xaa5通常為脯氨酸或羥基-脯氨酸。
Xaa6為任何堿性氨基酸。優(yōu)選地，Xaa6為賴氨酸(Lys)。
Xaa7通常為甘氨酸(Gly)。
Xaa8為任何非芳族羥基氨基酸。優(yōu)選地，Xaa8為絲氨酸(Ser)。
Xaa9為任何非芳族羥基氨基酸。優(yōu)選地，Xaa8為絲氨酸(Ser)。
Xaa10為任何堿性氨基酸。優(yōu)選地，Xaa10為賴氨酸(Lys)。
Xaa11為任何芳族氨基酸。優(yōu)選地，Xaa11為色氨酸(Trp)。
Xaa12為任何堿性氨基酸。優(yōu)選地，Xaa12為精氨酸(Arg)。
Xaa13為任何酸性氨基酸或酸性氨基酸的任何酰胺形式。優(yōu)選地，Xaa13為天冬氨酸(Asp)。
Xaa14為任何堿性氨基酸或任何含硫氨基酸。優(yōu)選地，Xaa14為甲硫氨酸(Met)或組氨酸(His)。
Xaa15為任何疏水性或非極性氨基酸，或任何非芳族羥基氨基酸。優(yōu)選地，Xaa15為丙氨酸(Ala)。
Xaa16為任何堿性氨基酸。優(yōu)選地，Xaa16為精氨酸(Arg)。
Xaa17為非極性氨基酸，或酰胺基。Xaa17也可以是缺失的。
任選地，在如上所述的μ-芋螺毒素中，成對的Cys殘基可以用等排性內(nèi)酰胺(isoteric lactam)或酯-硫醚替換物如Ser/(Glu或Asp)、Lys/(Glu或Asp)、Cys/(Glu或Asp)或Cys/Ala組合成對地替換。通過已知方法(Barnay等，2000；Hruby等，1994；Bitan等，1997)進行依次偶聯(lián)(sequential coupling)，可以使天然Cys橋被替換為內(nèi)酰胺橋?？梢允褂脧腞SP氨基酸類似物(RSP AmionAcid Analogues)商購得到的鹵代丙氨酸殘基，容易地合成硫醚類似物。
本發(fā)明還涉及μ-芋螺毒素，其中包括氨基酸Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6和Xaa7在內(nèi)的至少一種氨基酸、或它們的任意組合是缺失的(組1)。
還設(shè)想這樣的μ-芋螺毒素，其中包括氨基酸Xaa8、Xaa9、Xaa10和Xaa11在內(nèi)的至少一種氨基酸、或它們的任意組合是缺失的(組2)。
還完成了本發(fā)明的μ-芋螺毒素肽，其中包括氨基酸Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15和Xaa16在內(nèi)的至少一種氨基酸、或它們的任意組合是缺失的(組3)。
備選地，在本發(fā)明的同一個μ-芋螺毒素肽中，三個來自組1、2或3的上述氨基酸、或它們的組合可以是缺失的。
具有脂族R基團的示例性的疏水性氨基酸包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)。
具有非芳族羥基的示例性氨基酸包括絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)。
示例性的含硫氨基酸包括半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)。
示例性的酸性氨基酸及其酰胺形式包括天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和焦谷氨酸(pGlu)。
示例性的堿性氨基酸包括精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)。
示例性的芳族氨基酸包括苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)。
示例性的亞氨基酸例如包括脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp或Hpro或O)。
本發(fā)明還考慮μ-芋螺毒素肽的“生物活性片段”，“生物活性片段”是指氨基酸長度比所述肽的序列少的序列。這種序列可以使用，只要它顯示與從中衍生出該序列的天然序列基本上相同的特性或生物學活性即可。優(yōu)選地，該序列含有的氨基酸長度小于本發(fā)明的肽的相應序列的99％、優(yōu)選小于本發(fā)明的肽的相應序列的90％、特別地小于本發(fā)明的肽的相應序列的60％并且更特別地小于本發(fā)明的肽的相應序列的30％。
還設(shè)想了本發(fā)明的μ-芋螺毒素肽的鹽，如酸加成鹽或金屬絡(luò)合物，例如與鋅、鐵等的金屬絡(luò)合物(為本申請的目的而被視為鹽)。此類酸加成鹽的示例是鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽、酒石酸鹽等。
“藥物前體”也包括在本發(fā)明中，所述藥物前體是代表本發(fā)明的活性μ-芋螺毒素肽的非活性形式的實體。換句話說，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的可溶性的肽折疊前體(組合物)，該肽折疊前體具有對細胞產(chǎn)生所需生理作用的潛力，但初始時是惰性的(即不產(chǎn)生所述作用)，只有在經(jīng)過一些修飾后才變得有生理活性并且對細胞產(chǎn)生所述的生理作用，即在生物轉(zhuǎn)化后變得有藥理活性。
μ-芋螺毒素肽的生物轉(zhuǎn)化可以在生理條件(體外和體內(nèi))下進行并且是與酶或體液如胃酸、血液等進行反應而經(jīng)歷酶促氧化、還原、水解等或化學水解的結(jié)果，以通過酰基轉(zhuǎn)移反應轉(zhuǎn)化成活性化合物。
本發(fā)明還包括本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的變體。術(shù)語“變體”是其氨基酸序列與肽的天然序列具有一定程度的差異的肽，也即因保守性氨基酸替換(conservative amino acid substitution)而不同于天然序列的氨基酸序列，因而一個或多個氨基酸被其它具有相同特征和構(gòu)象作用的氨基酸所替換。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)的特定位置上具有替換、缺失、側(cè)鏈修飾、和/或插入。保守性氨基酸替換在本文中定義為在以下5組氨基酸中的一個組的范圍內(nèi)交換 I.小的脂族、非極性或輕微極性的殘基Ala、Ser、Thr、Pro、Gly II.極性、帶正電荷的殘基His、Arg、Lys III.極性、帶負電荷的殘基和它們的酰胺Asp、Asn、Glu、Gln IV.大的芳族殘基Phe、Tyr、Trp V.大的脂族非極性殘基Met、Leu、Ile、Val、Cys。
應當理解一些非常規(guī)氨基酸也可以用來替換天然存在的氨基酸。例如Lys殘基可以被鳥氨酸、高精氨酸、正賴氨酸(nor-Lys)、N-甲基-賴氨酸、N，N-二甲基-賴氨酸和N，N，N-三甲基-賴氨酸所替換。Lys殘基也可以被合成的堿性氨基酸所替換，所述合成的堿性氨基酸包括但不限于N-1-(2-吡唑啉基)-精氨酸、2-(4-胡椒基(piperinyl))-甘氨酸、2-(4-胡椒基)-丙氨酸、2-[3-(2S)吡咯烷基(pyrrolininyl)]-甘氨酸和2-[3-(2S)吡咯烷基]-丙氨酸。Tyr殘基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、間-Tyr、鄰-Tyr、正-Tyr、1251-Tyr、單鹵代-Tyr、二鹵代-Tyr、O-磺基-Tyr、O-磷酸(phospho)-Tyr和硝基-Tyr所替換。
Tyr殘基也可以被3-羥基或2-羥基異構(gòu)體(分別是間-Tyr或鄰-Tyr)和相應的O-磺基-和O-二氧磷基衍生物所替換。Tyr殘基也可以被含有羥基的合成氨基酸(包括但不限于4-羥甲基-Phe、4-羥苯基-Gly、2，6-二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr)所替換。脂族氨基酸可以被具有非天然的脂族支鏈或直鏈側(cè)鏈CnH2n+2的合成的衍生物所替換，其中n為1-8的數(shù)字。在WO2004/0099238中給出了用非常規(guī)氨基酸進行的合適的保守性替換的實例(見表1)。
表1


插入包括添加一個或多個天然存在的氨基酸殘基或非常規(guī)氨基酸殘基，不過優(yōu)選地不是半胱氨酸殘基。
缺失包括缺失一個或多個氨基酸殘基，不過優(yōu)選地不是半胱氨酸殘基。
如上所述，本發(fā)明包括其中除Cys之外的一個或多個氨基酸已經(jīng)發(fā)生側(cè)鏈修飾的肽。由本發(fā)明構(gòu)思的側(cè)鏈修飾的實例包括氨基的修飾，如與醛反應隨后用NaBH4進行還原的還原性烷基化；用亞氨逐乙酸甲酯(methylacetimidate)進行的酰胺化(amidination)；用乙酸酐進行的?；饔?；用氰酸鹽進行的氨基的氨甲?；?；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)進行的氨基的三硝基芐化(trinitrobenzylation)；用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐進行的氨基的酰化作用；和用5-磷酸吡哆醛并隨后用NaBH4還原而進行的賴氨酸的吡哆化(pyridoxylation)；和N-乙?；?。
精氨酸殘基的胍基可以通過與試劑如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物而被修飾。
羧基可以通過形成O-酰基異脲(acylisourea)而進行碳二亞胺活化并隨后衍生成為相應的酰胺而被修飾。
酸性氨基酸可以被甘氨酸和丙氨酸的四唑基衍生物所替換，如WO02/060923(COGNETIX INC；Univ.Utah Res Found.)中所述。
酪氨酸殘基可以例如通過4-位上的甲氧化而改變。酪氨酸也可以通過用四硝基甲烷進行硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物而改變。
組氨酸殘基的咪唑環(huán)修飾可以通過用碘乙酸衍生物進行烷基化或用焦碳酸二乙酯進行N-乙氧羰化而實現(xiàn)。
脯氨酸殘基可以通過例如4-位上的羥化而被修飾。
由本發(fā)明構(gòu)思的其它變體包括一系列糖基化變體。改變的糖基化模式可以因重組分子在不同宿主細胞中的表達而產(chǎn)生。Ser、Thr和Hyp殘基可以被修飾以含有O-聚糖，而Asn和Gln殘基可以被修飾以形成N-聚糖。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語＂聚糖(glycan)＂是指N-、S-或O-連接的單糖、二糖、三糖、多糖或寡糖，其可以通過本領(lǐng)域已知的合成方法或酶方法而連接到天然氨基酸或修飾氨基酸的任何羥基、氨基或巰基。構(gòu)成聚糖的單糖可以包括D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔洛糖、D-半乳糖胺、D-葡糖胺、D-N-乙?；?葡萄糖胺(GIcNAc)、D-N-乙?；?半乳糖胺(GalNac)、D-巖藻糖或D-阿拉伯糖?？梢詫@些糖作結(jié)構(gòu)性修飾，即用一個或多個O-硫酸鹽、O-磷酸鹽、O-乙?；蛩嵝曰鶊F如唾液酸，包括它們的組合。聚糖還可以包括相似的多羥基團，如D-青霉胺2，5和其鹵化衍生物、或聚丙二醇衍生物。糖苷鍵是β和1-4或1-3，優(yōu)選是1-3。
聚糖與氨基酸之間的連接鍵可以是α或β，優(yōu)選α并且是1-。
另外，因為天然肽(處于L-形式)的內(nèi)在問題是被天然蛋白酶降解，因此可以制備本發(fā)明的肽以包括肽的D-形式和/或＂逆反式異構(gòu)體(retro-inversoisomer)＂。優(yōu)選地，制備本發(fā)明肽的短部分、變體或其組合的逆反式異構(gòu)體。
保護所述肽免受天然蛋白水解，因此應當增加特定異二價(heterobivalent)或異多價化合物的效力。與含有非逆反式的類似物比較時，預計含有逆反式的肽具有更高的生物學活性，原因是得到保護而免受天然蛋白酶的降解。此外，已經(jīng)證實它們顯示出增強的穩(wěn)定性和較低的免疫原性[Sela M.和Zisman E.，(1997)Different roles of D-amino acids in immunephenomena-FASEB J.11，449] 例如，如在Sela和Zisman，(1997)中所述，對序列已知的肽制備逆反式肽。
＂逆反式異構(gòu)體＂是指直鏈肽的異構(gòu)體，其中序列的方向逆轉(zhuǎn)并且每個氨基酸殘基的手性倒置；因此，可能不存在端基互補性。
本發(fā)明還包括其中一個或多個肽鍵已經(jīng)由其它類型的不易受肽酶裂解的共價鍵(肽模擬物)替換的類似物。盡管注射至受試者后，肽的蛋白水解性降解是個問題，然而用不可裂解的肽模擬物替換特別敏感的肽鍵將使生成的肽更穩(wěn)定，并且因此作為活性物質(zhì)更為有用。此類模擬物和將這些模擬物引入肽的方法是本領(lǐng)域公知的。
還可以使用氨基端封閉基團如叔丁氧羰基、乙?；⒍谆坠柰榛?theyl)、琥珀酰基、甲氧基琥珀?；h(huán)庚基、已二?；⑷啥；?azelayl)、丹?；⑵S氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基壬二?；?methoxyazelayl)、甲氧基已二?；?、甲氧基環(huán)庚基和2，4-二硝基苯基。
構(gòu)思并可以完成本發(fā)明的μ-芋螺毒素的組合或其特別的生物活性片段的組合以改進本發(fā)明現(xiàn)存的肽的效力、選擇性或穩(wěn)定性。
優(yōu)選地，μ-芋螺毒素肽選自包括SEQ ID No 2和SEQ ID No 3的組中 pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys SEQ ID No 2 pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-Met-Ala-Arg-Cys-Cys SEQ ID No 3。
通常，這些肽的羧基末端被酰胺化。
應當理解的是，術(shù)語μ-芋螺毒素肽或μ-芋螺毒素不限于從芋螺屬中得到的天然存在的毒性肽，而僅僅是表示所述肽的初始來源或從中衍生出所述肽的初始來源。本發(fā)明的μ-芋螺毒素肽以及其片段、組合和變體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法和技術(shù)進行制備，例如在Maniatis等1982，Molecularcloning，A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory和Amblard等2005中所述的化學合成技術(shù)或重組技術(shù)。
當使用重組技術(shù)來制備本發(fā)明的μ-芋螺毒素肽時，優(yōu)選使用編碼所述多肽的核酸分子或其生物活性片段。
因此，本發(fā)明還涉及分離或純化的核酸序列，該核酸序列包括編碼如上所述的氨基酸序列的核苷酸序列。
“分離或純化的核酸序列”是指其中編碼本發(fā)明的μ-芋螺毒素肽的核酸分子或編碼所述μ-芋螺毒素肽的核酸將是符合本發(fā)明的狀態(tài)。核酸將不含或基本上不含與該核酸天然結(jié)合的物質(zhì)，如在該核酸的天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其它多肽或核酸，或在通過在體外或體內(nèi)實施的重組核酸技術(shù)制備所述核酸的環(huán)境中(例如細胞培養(yǎng))發(fā)現(xiàn)的其它多肽或核酸。
術(shù)語“核酸”是指DNA或RNA。
在核酸是DNA的情況下，則在本文中可以使用的DNA是任何聚脫氧核苷酸序列，包括例如雙鏈DNA、單鏈DNA、其中一條或兩條鏈均由兩個或多個片段構(gòu)成的雙鏈DNA、其中一條或兩條鏈具有不間斷的磷酸二酯主鏈的雙鏈DNA、含有一個或多個單鏈部分和一個或多個雙鏈部分的DNA、其中DNA鏈充分互補的雙鏈DNA、其中DNA鏈僅部分互補的雙鏈DNA、環(huán)狀DNA、共價性閉合的DNA、線性DNA、共價交聯(lián)的DNA、cDNA、化學合成的DNA、半合成的DNA、生物合成的DNA、天然分離的DNA、酶消化的DNA、剪切的DNA、標記DNA如放射標記的DNA和熒光標記的DNA、含有一種或多種非天然存在種類的核酸的DNA。
編碼μ-芋螺毒素肽的DNA序列或其生物活性片段可以通過標準化學技術(shù)例如磷酸三酯法合成、或通過自動化合成法和PCR法合成。
編碼本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的純化和分離的DNA序列也可以通過酶技術(shù)制得。因此，可以使用在預定識別序列上切割核酸分子的限制酶以從含有核酸序列(如編碼μ-芋螺毒素肽或其片段的DNA(或RNA))的更大核酸分子中分離出該核酸序列。
本發(fā)明還包含處于聚核糖核苷酸形式(RNA)的核酸，所述聚核糖核苷酸包括例如單鏈RNA、雙鏈RNA、單鏈RNA、其中一條或兩條鏈均由兩個或多個片段構(gòu)成的雙鏈RNA、其中一條或兩條鏈具有不間斷的磷酸二酯主鏈的雙鏈RNA、含有一個或多個單鏈部分和一個或多個雙鏈部分的RNA、其中RNA鏈充分互補的雙鏈RNA、其中RNA鏈僅部分互補的雙鏈RNA、共價交聯(lián)的RNA、酶消化的RNA、剪切的RNA、mRNA、化學合成的RNA、半合成的RNA、生物合成的RNA、天然分離的RNA、標記RNA如放射標記的RNA和熒光標記的RNA、含有一種或多種非天然存在種類的核酸的RNA。
分離或純化的核酸序列、DNA或RNA也包括與編碼本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的核酸序列具有實質(zhì)序列同一性或同源性的分離或純化的核酸序列。優(yōu)選地，核酸將具有實質(zhì)序列同一性，例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的核酸同一性；更優(yōu)選90％的核酸同一性，并且最優(yōu)選的是至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
如本領(lǐng)域已知并在本文中所用，同一性是通過比較所述序列而確定的兩種或多種氨基酸序列或兩種或多種核酸序列之間的關(guān)系。根據(jù)具體情況，同一性還指通過所述序列串之間的匹配而確定的氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)性的程度。同一性和相似性是技術(shù)人員公知的術(shù)語并且它們可以通過常規(guī)方法計算(例如見Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.and Griffin，H.G.ed.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.Academic Press，1987和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.ed.M.Stockton Press，New York，1991，Carillo，H.and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.481073，1988)。
通常優(yōu)選設(shè)計旨在產(chǎn)生序列間最大匹配的方法。在公眾可獲得的計算機程序中編撰了用于確定同一性和相似性的方法，包括GCG程序包(DevereuxJ.等，Nucleic Acid Research 12(1)387，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等J.Molec.Biol.215403-410，1990)。BLAST X程序可公開地從NCBI和其它來源(BLAST Manual，Altschul，S.等NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.等J.Mol.Biol.215403-410，1990)得到。
本發(fā)明還包含與編碼本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的分離或純化的核酸序列互補的核酸序列。
簡并性(degenerated)核酸序列也在本發(fā)明范圍內(nèi)，由于遺傳密碼子的簡并性，所述簡并性核酸序列的核酸序列與編碼本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的核酸序列或其互補序列不同。這種核酸編碼具有等同功能的μ-芋螺毒素肽，但是在序列上因遺傳密碼子簡并性而與所述肽的序列不同。這可以產(chǎn)生不影響氨基酸序列的沉默突變。任何及全部的此類核酸變化都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，還考慮了能夠在嚴格條件、優(yōu)選高嚴格條件下與編碼本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的核酸序列、其互補的核酸序列或其簡并性核酸序列雜交的核酸序列。促進DNA雜交的合適嚴格性條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如可以使用約45℃的6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨后用50℃的2.0X SSC進行洗滌。嚴格性可以基于洗滌步驟中使用的條件進行選擇。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自約0.2X SSC在50℃下的高嚴格性。此外，洗滌步驟中的溫度可以在高嚴格條件下為約65℃。
本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的分離或純化的核酸，其包括編碼μ-芋螺毒素肽的截短物(truncation)或類似物的核酸序列。術(shù)語“截短物”指這樣的序列，其編碼的肽所含有的氨基酸比天然序列少，但顯示相同的特征。
本發(fā)明也包括所公開的分離和純化的核酸序列的等位基因變體；也即所述分離或純化的核酸的天然存在的可選擇的形式，其也編碼與由分離和純化的核酸序列所編碼的肽相同、同源或相關(guān)的肽?？蛇x擇地，非天然存在的變體可以通過誘變技術(shù)而產(chǎn)生或通過直接合成而產(chǎn)生。
也考慮了公開的分離和純化的核酸序列的生物活性片段并且是指這樣的序列，其含有的核苷酸長度比編碼μ-芋螺毒素肽的核酸序列、其互補的核酸序列或其簡并性核酸序列少?？梢允褂眠@種序列，只要該序列顯示如從中衍生出該序列的天然序列那樣相同的特性即可。優(yōu)選地，該序列的氨基酸長度小于μ-芋螺毒素肽的相應分離和純化的核酸序列的氨基酸長度的90％、優(yōu)選小于60％、特別優(yōu)選小于30％。
本發(fā)明還涉及提供一種表達載體，該表達載體包括編碼μ-芋螺毒素肽的分離或純化的核酸序列。如本領(lǐng)域公知，表達載體的選擇直接取決于所需的功能特征，例如μ-芋螺毒素肽表達、和待轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
鄰人驚訝地，申請人已經(jīng)證實如本文中所述的μ-芋螺毒素肽顯示出用于麻醉藥應用的有用且有效的生物學活性。這些肽清楚地顯示出的活性比目前所用的局部麻醉藥如普魯卡因或利多卡因更好，并且活性持續(xù)時間長很多。這些μ-芋螺毒素可以因此用于其中需要長時間和高效麻醉的特定病例。它們也可以作為備選物使用以防止與常見麻醉藥如普魯卡因或利多卡因相對應的不想要的副反應或過敏(Finucane B.T.，2005)。
通過與科學文獻中、以上提及的專利和所附實施例中可獲得的數(shù)據(jù)相比較，這些μ-芋螺毒素還在生物學活性方面顯示出更好的效力。
因此，本發(fā)明也涉及一種藥物組合物，該藥物組合物含有藥物有效量的所述的至少一種μ-芋螺毒素肽作為活性物質(zhì)，選擇性地，該活性物質(zhì)與制藥學上可接受的載體、稀釋劑、和/或輔藥組合。
“藥物有效量”指在施用至人或動物有機體時誘導可檢測的藥理學或生理學作用的化學材料或化合物。
相應的藥物有效量可能取決于待治療的具體患者、待治療的疾病和給藥方法。此外，藥物有效量取決于所用的具體肽，尤其當肽額外地含有或不含有如所述的藥物時。治療通常包括藥物組合物的多次給藥，通常間隔幾小時、幾日或幾周。藥物有效量的多肽劑量單位通常是待治療患者每千克體重0.001ng-100μg。優(yōu)選地，每千克體重0.1ng-10μg。
優(yōu)選地，除了如本文中所述的至少一種μ-芋螺毒素肽之外，藥物組合物還可以含有一種或多種制藥學上可接受的載體、稀釋劑和輔藥。
在所用的劑量和濃度上，有助于將活性化合物加工成可以藥用的制劑中的可接受的載體、稀釋劑和輔藥對賦形劑是無毒的，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；尼泊金烷基酯如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基的)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑如


或聚乙二醇(PEG)。
藥物組合物的給藥形式可以是系統(tǒng)給藥或局部給藥。例如，這種組合物的給藥可以是多種胃腸道外途徑，如皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮膚、口腔途徑或通過植入裝置，并且也可以通過蠕動方法送遞。
本發(fā)明還構(gòu)思了一種植入裝置，該植入裝置包括本發(fā)明的μ-芋螺毒素或藥物組合物。
含有如本文中所述的μ-芋螺毒素肽作為活性藥物的藥物組合物以及麻醉藥也可以加入或滲透至生物可吸收的基質(zhì)內(nèi)，該基質(zhì)以基質(zhì)混懸劑、凝膠或固體支持物的形式給藥。此外，基質(zhì)可以含有生物聚合物。
可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實例包括含有μ-芋螺毒素肽的固體疏水性聚合物的半滲透性基質(zhì)，其中所述基質(zhì)的形式為成形物品，例如膜、微球、植入物或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實例包括聚苯乙烯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸與[γ]乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT(TM)(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德構(gòu)成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這容易地通過經(jīng)無菌濾膜過濾而實現(xiàn)。
可理解的是，本發(fā)明μ-芋螺毒素肽的合適劑量將取決于接受者的年齡、性別、健康情況和體重、同時治療的類型(如果有的話)以及所需作用的性質(zhì)。
合適的劑型將取決于疾病、肽和給藥模式；可能的劑型包括片劑、膠囊、錠劑、牙科糊劑、栓劑、吸入劑、溶液劑、軟膏劑、乳膏劑和胃腸道外長效藥劑(parenteral depot)。
在吸入劑的情況下，劑型優(yōu)選地是噴霧劑形式。制得本發(fā)明μ-芋螺毒素的鼻制劑以提供例如高效的上皮細胞鈉通道抑制。通過鼻噴霧劑所注射的量取決于受試者特征，如年齡和體重。確定有效劑量范圍是本領(lǐng)域技術(shù)人員的例行工作。
作為具體制劑的實例，體積為約30-300μL的每日鼻噴霧制劑中的μ-芋螺毒素量可以送遞約1-10μg的μ-芋螺毒素每日劑量。需要理解的是，每日噴霧體積可以在一個、兩個或多個送遞中施用以實現(xiàn)所需要的每日總噴霧體積。還需要理解的是，可以分別地獨立調(diào)節(jié)鼻制劑中的噴霧劑體積和μ-芋螺毒素的量以實現(xiàn)所需的每日劑量。
因為對μ-芋螺毒素肽中的氨基酸的氨基酸修飾也被本發(fā)明所包括，因此，這可以用于將本發(fā)明μ-芋螺毒素肽交聯(lián)至不溶于水的基質(zhì)或其它大分子載體，或用于改善溶解度、吸收性和穿過血腦屏障的通透性。此類修飾是本領(lǐng)域公知的，并且可以選擇性地消除或減弱肽等的任何可能的不想要的副作用。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選的藥物組合物含有μ-芋螺毒素肽作為活性藥物，然而備選的藥物組合物可以含有如本文中所述的編碼μ-芋螺毒素肽的分離或純化的核酸序列作為活性藥物。這種藥物組合物可以包括單獨的分離和純化的DNA序列，包含所述分離和純化的DNA序列的表達載體，和先前轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化有在此所述的表達載體的宿主細胞。在后面的實施例中，宿主細胞優(yōu)選地自待治療的患者中分離出來以避免任何抗原性問題。這些基因和細胞治療法極適用于需要反復施用藥物組合物的患者，因為所述的純化和分離的DNA序列、表達載體或先前轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化有表達載體的宿主細胞可以并入患者的細胞，這種細胞隨后內(nèi)源性地產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
通常，如本文中所述的藥物組合物用于治療或預防疼痛。待治療或預防的疼痛將選自例如偏頭痛、急性疼痛、持續(xù)性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛或傷害性疼痛(nociceptive pain)。
備選地，如本文中所述的藥物組合物用于治療囊性纖維化或耳鼻喉病(oto-rhino-laryngological disease)。
由于本發(fā)明的μ-芋螺毒素是鈉通道抑制劑，因此它可以施加至呼吸道上皮和鼻膜以阻斷由上皮細胞鈉通道所致的鈉攝取增強。這具有降低粘膜粘度的作用并促進更好地清除外部生物流體如肺液體和鼻液體。在此方面，低濃度的μ-芋螺毒素抑制與囊性纖維化病和炎癥相關(guān)的存在于粘膜上的鈉通道，其中產(chǎn)生的粘液高于正常水平。上皮細胞鈉通道調(diào)節(jié)粘性肺液體和鼻液體的清除。施加不同濃度的藥物組合物將誘導更好地清除粘膜中生物性流體的聚集，所述藥物組合物含有毫摩爾和亞毫摩爾范圍的本發(fā)明的μ-芋螺毒素。因此在治療粘膜內(nèi)存在異常流體分泌的耳鼻喉炎癥中，μ-芋螺毒素具有治療效力。μ-芋螺毒素應用還專用于有效治療在囊性纖維化中出現(xiàn)的異常肺分泌物。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療或預防與電壓敏感性鈉通道相關(guān)的病癥的藥物中的用途。
本發(fā)明μ-芋螺毒素肽通常將以實現(xiàn)預期目的的量使用。為用于治療或預防疼痛，肽或其藥物組合物以治療有效量施用或施加?！爸委熡行Я俊笔怯行Ц纳苹蝾A防癥狀的量。確定治療有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是按照本文提供的詳細內(nèi)容。
對于系統(tǒng)給藥(systemic administration)，治療有效量或劑量可以從體外分析法中初步地估計。例如，劑量可以在動物模型中制訂以實現(xiàn)包括如在細胞培養(yǎng)中所確定的IC50在內(nèi)的循環(huán)濃度范圍。此類信息可以用來更精確地確定在人體中的有用劑量。
也可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，從體內(nèi)數(shù)據(jù)例如動物模型中估計初始劑量?；趧游飻?shù)據(jù)，并且當然將基于正在治療的受試者的體重、病癥嚴重性、給藥方式和處方醫(yī)生的判斷力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地使對人的給藥最優(yōu)化。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的藥物組合物在制備麻醉藥中的用途。
本申請公開的內(nèi)容還提供用于在接受需要麻醉的手術(shù)操作的患者中提供骨骼肌松弛的方法，該方法包括將本發(fā)明至少一種μ-芋螺毒素肽或其制藥學上可接受的鹽以藥物有效量給藥至需要的患者。
如在本發(fā)明中使用，“給藥的(administered)”或“給藥(administering)”意指“給予”或“使接觸”并且是指藥物組合物、治療組合物或麻醉組合物與受試者接觸，所述受試者優(yōu)選為人。
通常，在以上所述的方法中，至少一種μ-芋螺毒素肽作為局部麻醉藥進行給藥。優(yōu)選地，至少一種μ-芋螺毒素肽用于例如眼科學、肌張力失常治療、耳鼻喉科學、肛裂治療、皮膚病學、創(chuàng)傷學、整容手術(shù)、纖維肌痛和慢性肌筋膜疼痛的治療以及所有疼痛的治療中。
優(yōu)選地，至少一種μ-芋螺毒素肽作為眼科麻醉藥進行給藥。
本發(fā)明還包括一種用于局部麻醉的方法，該方法包括以藥物有效量給藥本發(fā)明的至少一種μ-芋螺毒素肽或其制藥學上可接受的鹽。優(yōu)選地，本發(fā)明的至少一種μ-芋螺毒素肽或藥物組合物的所述藥物有效量提供如實施例中公開的長效且持久的作用。
優(yōu)選地，長的作用持續(xù)時間是約30分鐘至48小時，取決于待治療的受試者和/或本發(fā)明所用的μ-芋螺毒素的濃度。然而，在任何情況下，所述的持續(xù)時間比迄今對常用麻醉藥如利多卡因或普魯卡因所述的任何持續(xù)時間都長。優(yōu)選地，持續(xù)時間是30分鐘至12小時。
本發(fā)明還包括一種麻醉藥，該麻醉藥含有在申請中所述的藥物組合物或μ-芋螺毒素肽。
優(yōu)選地，所述麻醉藥適用于皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮膚、口腔途徑或植入裝置。
通常，麻醉藥的形式是片劑、膠囊、錠劑、牙科糊劑、栓劑、吸入劑、溶液劑、軟膏劑、乳膏劑和胃腸道外長效藥劑。優(yōu)選地，所述吸入劑是噴霧劑。
實施例 實施例1 材料和方法 材料 在切斯特菲爾德島(chesterfield Island)(New Caledonia)收集聳肩芋螺(Conus consors)的標本并立即在-80℃冷凍。從新鮮剖取的毒液導管器中得到毒液，并用0.08％的三氟乙酸(TFA)水溶液提取。把從幾個毒液導管中得到的提取物離心以除去不溶性顆粒。將來自所有提取的上清液合并、凍干、稱重并貯藏在-80℃直至需要使用時。
色譜法 使用配備有TSP-150 UV檢測儀的熱分離產(chǎn)物(Thermo SeparationProduct，TSP)高壓液相色譜系統(tǒng)對粗制凍干毒液進行分餾。以下是用于反相色譜的洗脫緩沖液緩沖液A，H2O/0.1％ TFA；緩沖液B，H2O/CH3CN 40/600.1％TFA。使用如下梯度的C18 Vydac 218TP510柱實施粗制毒液的半制備性運行。程序是0-8％ B/5分鐘，8-80％ B/70分鐘，80-100％ B/10分鐘，隨后是100％ B/10分鐘(流速，2ml/分鐘)。使用分析用C18 Vydac 218TP54柱的深度純化步驟以如下梯度實施，如0-10％ B/5分鐘，10-20％ B/10分鐘，20-40％B/40分鐘。在220nm上檢測分餾物。
氨基酸組成和埃德曼(Edman)測序 通過在管形瓶的底部添加200ml 6M HCl以對肽樣品進行水解，其中所述管形瓶被抽真空、密封并在120℃下加熱16小時。水解產(chǎn)物在配備有在線衍化器(型號420A)的自動分析儀(Applied Biosystems，型號130A)上進行分析，其中所述在線衍化器將游離氨基酸轉(zhuǎn)化成它們的苯基硫代氨甲?；苌?。通過Edman降解法在自動的Applied Biosystems 477A微量測序儀上進行測序試驗。在測序前，同質(zhì)的肽用二硫蘇糖醇在6M鹽酸胍，0.5MTris/HCl，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 7.5)中還原1小時并隨后用4-乙烯基吡啶(1.5μM)在室溫處理3小時。肽衍生物通過使用C18 Vydac柱(4.6mm×25cm，粒度為5μm)的反相高效液相色譜(HPLC)進行純化。
質(zhì)譜法 在配備有電噴霧離子源的QTOF I儀(Micromass/Waters，USA)上進行分子量測量。樣品分析在陽性模式上使用載體輸入溶劑H2O/CH3CN/HCOOH(49.9/49.9/0.2)而實施。具有TOF-MS配置的單MS實驗用于簡單的分子量測定。實施串聯(lián)質(zhì)譜法以進行結(jié)構(gòu)性研究。在這種配置中，母質(zhì)量(parent mass)首先使用四極桿(quadrupole)加以選擇，并且通過手工調(diào)節(jié)碰撞能而實施由碰撞所誘導的解離作用。在這種情況下，天然樣品事先使用在碳酸氫銨緩沖液(pH 7.8)中的100mM二硫蘇糖醇(DTT)于56℃還原3小時。還原的肽隨后使用ZipTip(Millipore，USA)根據(jù)制造商的方案進行脫鹽。借助軟件MassLynx(Micromass/Waters，USA)，使用MaxEnt3選項將所得的多電荷譜(multiply-charged spectra)轉(zhuǎn)化成單電荷數(shù)據(jù)。隨后運行手工和半自動數(shù)據(jù)處理以進行序列表征。
肽合成 使用用于逐步Boc化學鏈延伸的原位中和/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)活化方案，在來自AppliedBiosystems的定制改良型433A肽合成儀上實施固相合成。在鏈裝配完成后，使肽脫保護并在0℃通過用無水HF處理1小時，用5％對甲酚作為清除劑而從樹脂上切下。在切割后，肽用冰冷二乙醚沉淀，溶解在含水的乙腈中并進行凍干。使用在緩沖液A(H2O/0.1％三氟乙酸)中的緩沖液B(乙腈/10％H2O/0.1％三氟乙酸)的線性梯度，用Vydac C18柱通過RP-HPLC對肽進行純化，并在214nm進行紫外線檢測。樣品通過電噴霧質(zhì)譜法以Platform II儀器(Micromass，Manchester，England)進行分析。
為使肽氧化折疊，將材料(約0.5-1mg/mL)溶解在含有0.5mM還原型谷胱甘肽和0.1mM氧化型谷胱甘肽的0.5M GuHCl，100mM Tris(pH 7.8)中。在室溫下溫和攪拌過夜后，通過如上所述的RP-HPLC對蛋白質(zhì)溶液進行純化。折疊步驟的整體產(chǎn)率大約是35％。
蛙和小鼠神經(jīng)肌肉制備物 從重20-25g的雙髓斑(double pithed)雄蛙(食用蛙(Rana esculenta))中取出皮胸肌和伴隨神經(jīng)并釘在2ml組織浴槽的基部，該浴槽中灌注有含有(單位mM)NaCl，115.0；KCl，2.0；CaCl2，1.8和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液，5.0(pH7.25)的標準溶液。在一些實驗中，刺激-收縮通過用2M甲酰胺處理皮胸肌神經(jīng)肌肉制備物(cutaneous pectoris neuromuscularpreparations)而解偶聯(lián)。從通過頸椎脫位處死并隨后立即放血的瑞士韋伯斯特(Swiss-Webster)小鼠(20-25g)中分離左偏側(cè)膈肌和右偏側(cè)膈肌及伴隨的膈神經(jīng)。將這兩個偏側(cè)膈分開并且把每個偏側(cè)膈架在Rhodorsil(

-Poulenc，St.Fons，F(xiàn)rance)襯里的器官浴槽(2ml容積)中，其中所述的器官浴槽中灌注有組成如下(單位mM)的生理溶液(哺乳動物克雷布斯-林格氏液(Krebs-Ringer’s solution))NaCl，154.0；KCl，5.0；CaCl2，2；MgCl2，1.0；HEPES緩沖液，5.0；葡萄糖，11.0。供有純O2的溶液的pH為7.4。
小鼠坐骨神經(jīng)制備物 從通過頸椎脫位處死的小鼠中剖取出兩側(cè)坐骨神經(jīng)(左側(cè)和右側(cè))。在使用前，該神經(jīng)用充氧的哺乳動物克雷布斯-林格氏液在室溫淋洗30分鐘。
狗魚嗅神經(jīng)制備物 左側(cè)和右側(cè)嗅神經(jīng)取自斷頭的狗魚(白斑狗魚)。在使用前，每條神經(jīng)用充氧的狗魚林格氏液(Ringer’s solution)(82.5mM NaCl，2.5mM KCl，1mMCaCl2，1mM Na2HPO4緩沖液，5mM HEPES，1mM MgCl2，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.3)在室溫下淋洗30分鐘。
小鼠神經(jīng)肌肉制備物上的機械記錄 在這種類型的實驗中，將小鼠偏側(cè)膈肌的一端釘至組織浴槽并且另一端(腱)與等長收縮的(isometric transucer)傳感器(FT03，Grass Instruments)連接。使用吸引電極(suction electrode)，以頻率0.1Hz的持續(xù)時間0.15毫秒的電流脈沖對運動神經(jīng)進行刺激而誘發(fā)收縮。調(diào)節(jié)每種制備物的靜息張力(restingtension)以至在正常條件下通過直接刺激肌肉或經(jīng)運動神經(jīng)間接刺激肌肉而得到最大的收縮反應。從傳感器中記錄的張力信號借助配備有數(shù)字界面的計算機(DT-2821，Data Translation)進行放大、收集和數(shù)字化。實驗在室溫下進行。
蛙和小鼠神經(jīng)肌肉制備物上的電生理學記錄 分離的神經(jīng)肌肉制備物中的運動神經(jīng)以0.05-0.1毫秒持續(xù)時間和超大電壓(一般是3-8V)的脈沖經(jīng)適合該神經(jīng)直徑的吸引微電極(suctionmicroelectrode)加以刺激。這些脈沖通過與刺激分離單元連接的S-44刺激儀(Grass Instruments，West Warwick，U.S.A.)產(chǎn)生。
使用常用技術(shù)和Axoclamp-2A系統(tǒng)(Axon Instruments，F(xiàn)oster city，CA，U.S.A.)，以填充有3M KCl的細胞內(nèi)微電極(8-12MΩ電阻)在室溫(22-24℃)下從終板區(qū)中記錄膜電位和突觸電位。記錄在施加所測試的芋螺毒素之前和在所述施加全程期間從相同終板中連續(xù)地進行。借助于改良數(shù)字式錄音處理器(Sony PCM 701 ES)和盒式磁帶錄像器(Sony SLC9F)，電信號在放大后顯示在數(shù)字式示波器上并且同時記錄在錄像帶上。借助于配備有模擬及數(shù)字I/O接口板的計算機(DT2821，Data Translation Marlboro，U.S.A.)，數(shù)據(jù)以25kHz的采樣速率進行收集和數(shù)字化。計算機化的數(shù)據(jù)的獲取和分析是通過JohnDempster博士(Strathclyde大學，Scotland)提供的程序而實施的。終板電位(EPP)和微型終板電位(MEPP)分別就幅度和時程進行分析。對于研究的每種條件，進行3-6個獨立實驗并且將結(jié)果平均化以給出所提供的均值±均值的標準差(S.E.M.)。統(tǒng)計檢驗通過使用t檢驗(student’s test)進行，認為P<0.05表示顯著性。
小鼠和狗魚神經(jīng)上的電生理學記錄 將來自小鼠的坐骨神經(jīng)或狗魚嗅神經(jīng)設(shè)置在與樹脂玻璃(Plexiglas)室連接的兩對鉑線(內(nèi)直徑0.5mm)上。為了刺激，第一對電極與送遞多種幅度和時間的矩形電流脈沖的刺激儀(S-88，Grass Instruments)相連接。為了記錄整體動作電位(GAP)，第二對電極與高倍率的自制微分放大器連接。一條額外的鉑線將這兩對電極接地。與電刺激相對應，神經(jīng)活動在配備有模擬和數(shù)字轉(zhuǎn)換器的計算機上借助軟件程序Axon Pclamp 6.0版(Axon instruments)進行收集、數(shù)字化和記錄。全部實驗在室溫進行。在記錄期間，將神經(jīng)保持在潮濕室內(nèi)，而不與任何溶液發(fā)生任何緊密接觸以避免任何短路。在每次記錄之間，將神經(jīng)安置在4℃下盛有林格氏液或試驗溶液的小容器內(nèi)。
在兔眼上的體內(nèi)實驗 在兔角膜上體內(nèi)測定CnIII對表面神經(jīng)末梢末端的局部麻醉活性。為此，使用體重1.5-2kg的長著有色眼的成年雄性智利(Chilean)兔。試驗溶液緩慢灌注至一只眼的結(jié)膜囊內(nèi)并在其中滯留2分鐘。刺激通過來自尼龍毛刺激儀的壓力以約2Hz的頻率施加至角膜上直至誘發(fā)眼-眼瞼反射(oculo-palpebral reflex)。每個刺激期由100次刺激構(gòu)成，或如果誘發(fā)了眼-眼瞼反射，則由更少的刺激構(gòu)成。兩個刺激期間隔至少5分鐘的間隔期。麻醉作用的強度表述為從施用試驗溶液或麻醉溶液直至重新出現(xiàn)眼-眼瞼反射的期間可以施加至角膜的刺激總數(shù)。該方法還允許測定麻醉作用的持續(xù)時間。使用利多卡因HCl(Sigma-Aldrich)的鹽水溶液并且它的pH值用1NNaOH調(diào)節(jié)為6.9±0.01。
實施例2 結(jié)果 新μ-芋螺肽的分離、純化和表征 干燥的毒液溶解在0.08％的三氟乙酸(TFA)水溶液中并以10mg批量裝載在半制備性C18多孔層實心球(Vydac)柱上。在色譜內(nèi)大約20分鐘洗脫的餾分(fraction)在分析級上進一步純化。該餾分對蛙的神經(jīng)肌接頭顯示出有效的初步活性。將這種餾分施用于所述離體制備物誘導了對由刺激運動神經(jīng)所激發(fā)的肌肉收縮的阻斷。所述餾分最終被純化至如由紫外光(UV)色譜和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)質(zhì)譜所證實的均一性(圖1)。該餾分隨后進行數(shù)次阿德曼(Edman)降解，但沒有產(chǎn)生任何結(jié)果。對該餾分的氨基酸分析導致鑒定出幾種不同的氨基酸(結(jié)果未顯示)，因而表明該餾分是肽質(zhì)的，但帶有可能封閉的氨基末端。為進一步表征該化合物，餾分使用DTT還原并且樣品在分析前進行脫鹽。隨后在脫鹽樣品上實施串聯(lián)質(zhì)譜分析。選擇在m/z 596上的4x帶電種類并且手工調(diào)節(jié)碰撞能，以提供適當和均一的肽片段。數(shù)據(jù)的人工注釋導致賦予具有22個氨基酸的肽序列。該序列與先前發(fā)表的μ-芋螺肽共有同源性并因此得名CnIIIA(表4)。
CnIIIA的化學合成 肽如上所述進行裝配(見肽合成)。合成的肽使用在酸化水中的乙腈(ACN)梯度，通過反相HPLC純化至均一。肽純度和完整性由ESI-MS控制。探索幾種條件用于線性肽的氧化性再折疊。肽溶解在含有鹽酸胍(0.5M)的pH 7.8的Tris緩沖液(100mM)，并且在4℃的空氣氧化下靜置或在含有多種比例的還原型/氧化型谷胱苷肽(gluthation)的混合物中靜置。最終的再折疊實驗使用Tris 100mM，鹽酸胍0.5M和還原型/氧化型谷胱苷肽0.5mM/0.1mM進行。這種混合物在室溫下攪拌過夜。該混合物隨后使用乙酸酸化，并使用C18 SepPak筒(cartridge)按照制造商的方案進行濃縮。最終的折疊肽通過反相色譜以半制備級別進行純化。其顯示出均一性并且從線性實體(linear entity)開始產(chǎn)率大約為35％。合成的化合物的純度由HPLC和ESI-MS分析評估。具有天然形式的合成性肽的真實性(authenticity)由HPLC共洗脫和MS/MS分析證實(圖2)。合成的CnIIIA隨后用于不同的生物學分析。
對小鼠偏側(cè)膈收縮的作用 在因直接刺激小鼠偏側(cè)膈而誘導的肌肉收縮上評估CnIIIA的活性(圖3)。在每種條件(缺乏或存在多種CnIIIA濃度)下，記錄與250μs和各種強度的刺激相對應的收縮。這允許測定超大刺激強度，即得到最大收縮幅度所需要的強度。對于每個CnIIIA濃度，在肽施用至該制備物2小時后記錄肌肉的收縮，以使毒素受體位點飽和。如圖3A中所示，在100和300nM CnIIIA的存在下，收縮的幅度降低，直至在600nM CnIIIA時完全被抑制。通過比較，需要濃度至少2μM的μ-芋螺毒素GIIIA或GIIIB以便在相同條件下完全阻斷同一種制備物。CnIIIA因此似乎比這種離體模型中所測試的現(xiàn)有μ-芋螺毒素的效果至少高少4倍。CnIIIA作用的劑量-反應曲線表明產(chǎn)生小鼠偏側(cè)膈收縮的一半最大抑制的CnIIIA濃度是150nM(圖3B)。當由刺激運動神經(jīng)誘導肌肉收縮時，得到相似的結(jié)果(結(jié)果未顯示)。
對小鼠神經(jīng)肌接頭處的突觸應答的作用 為評估CnIIIA在肌肉和神經(jīng)組織之間的作用選擇性，在小鼠偏側(cè)膈神經(jīng)肌接頭上施用600nM CnIIIA后進行突觸應答的細胞內(nèi)記錄。首先，結(jié)果顯示纖維的膜靜息電位與對照相比沒有改變。這表明CnIIIA的去極化作用不會產(chǎn)生對肌肉收縮的抑制。其次，可以在CnIIIA的存在下檢測到微終板電位(MEPP)，因此表明煙堿乙酰膽堿受體的敏感性在產(chǎn)生肌肉收縮完全阻斷的劑量下未改變。最后，在600nM CnIIIA的存在下，神經(jīng)刺激能夠產(chǎn)生位相突觸應答(phasic synaptic response)。因此，類似于對照，可以記錄到終板電位(EPP)。這表明神經(jīng)傳導在這個芋螺毒素濃度下沒有改變。另外，細胞外電流記錄允許檢測到突觸前電流，這反映運動神經(jīng)末梢中存在突觸前神經(jīng)動作電位。也觀察到因肌膜內(nèi)陽離子突觸通道的開放所致的突觸后電流。
對蛙神經(jīng)肌肉制備物的肌動作電位和突觸應答的作用 研究了CnIIIA在蛙皮胸肌神經(jīng)-肌肉制備物上的作用(圖4)。在這種制備物中，通過甲酰胺處理容易地實現(xiàn)刺激-收縮的解偶聯(lián)，因此允許細胞內(nèi)記錄由神經(jīng)刺激而不是運動所誘導的肌動作電位。結(jié)果表明在2μM CnIIIA的存在下，纖維的膜靜息電位與對照相似。向制備物施用1μM CnIIIA持續(xù)5-20分鐘，引起由運動神經(jīng)刺激所誘發(fā)的動作電位的幅度下降和持續(xù)時間增加。在25分鐘后，肌動作電位完全被消除而仍能夠記錄到EPP。在更高濃度(2μM)的CnIIIA的存在下觀察到相似的作用，不過出現(xiàn)得更快。應當指出的是，神經(jīng)刺激和肌肉應答之間的潛伏期未顯著地受芋螺毒素影響。與對照相比，施用CnIIIA(1和2μM)也不改變MEPP的幅度和頻率。這些結(jié)果有力地表明，對通過芋螺毒素CnIIIA所產(chǎn)生得骨骼肌收縮的抑制因肌動作電位的偏好性阻斷而產(chǎn)生，肌動作電位因此比神經(jīng)動作電位對芋螺毒素更敏感。
對小鼠坐骨運動神經(jīng)的整體動作電位(GAP)的作用 申請人:優(yōu)化了刺激的持續(xù)時間和強度，以獲得代表組成神經(jīng)的全部纖維的活性的GAP。對于給定的刺激持續(xù)時間(0.10、0.05或0.01毫秒)，GAP幅度隨著所施加的刺激強度(0.1-15V)的增加而增加，原因是被召集的神經(jīng)纖維的數(shù)目增加。與等于或超過7V的刺激強度相對應，GAP幅度達到最大值，無論刺激持續(xù)時間多長(0.05或0.10ms)均保持恒定。這意味神經(jīng)的全部纖維都對刺激作出應答。相反，0.01毫秒刺激不足以召集全部神經(jīng)纖維，因為GAP最大幅度僅是在0.05或0.10ms刺激后所記錄的GAP最大幅度的92％。為研究CnIIIA對GAP的作用，刺激的持續(xù)時間因而設(shè)定為0.05毫秒并且施加強度從0.1增加至15V。然而，為了證明我們的實驗條件對研究的CnIIIA的任何濃度是最適合的，還以多種強度施加0.10毫秒刺激。在0.1-50μM的濃度范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)CnIIIA降低GAP幅度，在神經(jīng)用50μM CnIIIA處理持續(xù)30-60分鐘時，GAP幅度幾乎達到零值(圖5A，B)。此外，達到50％的GAP最大幅度所需的刺激強度隨芋螺毒素濃度增加而增加(圖5C)。最后，CnIIIA沒有未顯著調(diào)整GAP的傳播速度。
總之，這些結(jié)果結(jié)論性地表明μ-芋螺毒素CnIIIA通過降低各個神經(jīng)纖維的應答而對小鼠坐骨神經(jīng)發(fā)揮作用，而沒有顯著改變它們的膜興奮性。
CnIIIA對小鼠坐骨神經(jīng)作用的劑量-反應曲線顯示，1.53μM的芋螺毒素濃度使坐骨神經(jīng)的最大GAP幅度降低了50％(圖6)。這些數(shù)據(jù)顯示運動神經(jīng)對CnIIIA應答的敏感性比肌肉收縮對CnIIIA應答的敏感性低十倍。這些結(jié)果還表明μ-芋螺毒素比常見麻醉藥如利多卡因在小鼠坐骨神經(jīng)上的效果大約高1000倍。確實需要毫摩爾濃度的利多卡因以對小鼠坐骨神經(jīng)得到相似的抑制劑作用。
通過以下方式評價CnIIIA作用的可逆性首先在多種濃度(2、10和50μM)的芋螺毒素的存在下記錄坐骨神經(jīng)的GAP，并且其次在將神經(jīng)在無CnIIIA的哺乳動物林格氏液中浸泡多個時間段(從2小時至24小時)后記錄坐骨神經(jīng)的GAP。甚至在洗滌24小時后，僅觀察到GAP幅度的輕微增加(圖7)。為檢驗可逆性的缺乏是否可能因作為時間的函數(shù)的GAP幅度自發(fā)下降(“下降”現(xiàn)象)所致，將坐骨神經(jīng)僅在哺乳動物克雷布斯-林格氏液中浸泡多個時間段(從2小時至24小時)后記錄坐骨神經(jīng)的GAP。在這些條件下，未觀察到GAP幅度的明顯調(diào)整。
總之，這些數(shù)據(jù)有力地表明μ-芋螺毒素CnIIIA牢固地與小鼠坐骨神經(jīng)上的受體位點結(jié)合，即芋螺毒素/受體復合體的解離發(fā)生得相當緩慢。
對狗魚嗅神經(jīng)的整體動作電位(GAP)的作用 歐洲狗魚(白斑狗魚)的嗅感神經(jīng)含有大約五百萬個相對均一(95％)的平均直徑為0.20μm的無髓鞘軸突。這種神經(jīng)具有高密度的軸突膜包裝(axonalmembrane packing)，并且因此是生物物理學、電生理學和藥理學研究的特殊模型。先前已經(jīng)報道用于記錄組成這種感覺神經(jīng)的全部纖維的GAP的最適條件(刺激的強度和持續(xù)時間)(Benoit等，2000)。強度和持續(xù)時間分別是8-9V和7-8ms的刺激召集嗅神經(jīng)的全部纖維。在這種條件下，應答的最大幅度是2.77±0.15mV(n＝37)，并且以12±0.5cm/秒(n＝37)的速度傳播，其中所述的速度比由有髓鞘的軸突構(gòu)成的坐骨神經(jīng)中的速度慢60倍。因此，使用持續(xù)時間8毫秒和強度1-15V的刺激，研究CnIIIA對狗魚嗅神經(jīng)GAP的作用。當嗅神經(jīng)用增加濃度的芋螺毒素處理時，觀察到GAP幅度的降低，并且在施用10μM芋螺毒素30-60分鐘時，可能記錄不到GAP(圖8A，B)。此外，與50％最大GAP幅度(即在15V上記錄的)相對應的刺激強度隨著芋螺毒素濃度的增加而增加。最后，CnIIIA沒有顯著調(diào)整GAP的傳播速度(圖8C)。
總之，這些結(jié)果結(jié)論性地表明CnIIIA通過降低各個神經(jīng)纖維的應答而對狗魚嗅神經(jīng)發(fā)揮作用，而沒有顯著改變它們的膜興奮性。
CnIIIA對狗魚嗅神經(jīng)作用的劑量-反應曲線顯示0.15μM的芋螺毒素濃度使嗅神經(jīng)的最大GAP幅度降低了50％(圖9)。這些數(shù)據(jù)表明組成嗅感覺神經(jīng)的無髓鞘的軸突的應答如小鼠肌肉一樣對CnIIIA敏感(見圖3B)并且對μ-芋螺毒素的應答敏感比組成坐骨運動神經(jīng)的有髓鞘的軸突高10倍(見圖6)。
通過以下方式評價CnIIIA作用的可逆性首先在多種濃度(1、2和10μM)的芋螺毒素的存在下記錄狗魚嗅神經(jīng)的GAP，并且其次將神經(jīng)在無CnIIIA的狗魚林格氏液中浸泡多個時間段(從12小時至24小時)后記錄狗魚嗅神經(jīng)的GAP。甚至在洗滌24小時后，也不能檢測到GAP幅度的增加。為檢驗可逆性的缺乏是否可能因作為時間的函數(shù)的GAP幅度自發(fā)下降(“下降”現(xiàn)象)所致，將嗅神經(jīng)僅在狗魚林格氏液中在多種實驗條件下浸泡后記錄嗅神經(jīng)的GAP(i)在室溫下實驗腔室中持續(xù)30-60分鐘(n＝10)、(ii)在室溫在狗魚林格氏液中持續(xù)小于3小時(n＝14)和(iii)在4℃在狗魚林格氏液持續(xù)48小時(n＝66)和持續(xù)72小時(n＝46)。無論實驗條件如何，均未觀察到GAP幅度的明顯調(diào)整。
總之，這些數(shù)據(jù)有力地表明μ-芋螺毒素CnIIIA牢固地與狗魚嗅神經(jīng)上的受體位點結(jié)合，即芋螺毒素/受體復合體的解離發(fā)生得相當緩慢。
CnIIIA在兔眼中的表面麻醉作用及其與利多卡因表面麻醉作用的比較 在兔角膜上得到的結(jié)果表明濃度為2.5、5.0和10g/l的利多卡因的麻醉作用持續(xù)時間分別是5.3、14.2和22.3分鐘。CnIIIA不僅在等摩爾基礎(chǔ)上比利多卡因更有效，而且CnIIIA的作用持續(xù)時間更長，如圖10中所示。CnIIIA的麻醉作用強度也比利多卡因更明顯，其中所述的麻醉作用強度表述為施用至角膜表面直至再出現(xiàn)眨眼反射時刺激的總數(shù)。有趣的是，角膜反射在施用CnIIIA后恢復而沒有出現(xiàn)可檢測到的粘膜表面損傷。
對通過膜片鉗從HEK細胞中記錄的鈉電流的體外實驗 在穩(wěn)定表達大鼠骨骼肌Na通道α亞單元(μl，NaV1.4)的HEK 293細胞中進行膜片鉗電流記錄(Yamagishi等，1997)。這些細胞表現(xiàn)強大的Na電流(>2nA)，并且對蛤蚌毒素(STX)及衍生物敏感(Velez等，2001)，并尺寸小(直徑<20μm)，允許合適地控制維持電位。
在室溫(20-22℃)下在穩(wěn)定表達NaV1.4通道的HEK 293細胞上實施全細胞膜片鉗記錄(Hamill等，1981)。在填充有內(nèi)部生理溶液時，由硼硅玻璃制成并在P-97拉針器(Sutter Instrument Company，Novato，CA)上拉出的膜片吸管(patch pipette)具有1.5-3.0MΩ的尖端電阻。使用Axopatch 200-B膜片鉗放大器(Axon Instruments，Union City，CA)記錄膜電流。通過來自-100至-10mV維持電壓的10-毫秒去極化脈沖來激發(fā)鈉峰值電流。使用P/4方案來減去線性電容電流和漏電流。膜電流用集成8極低通貝塞爾(Bessel)濾波器在10kHz上過濾。過濾的信號由12比特的A/D轉(zhuǎn)換器(Digidata 1200B，AxonInstruments)數(shù)字化并使用pCLAMP軟件(Axon Instruments)存儲。使用Origin7軟件(OriginLab Corp.，Northampton，MA)分析記錄結(jié)果。
細胞用含有如下成分的(單位mM)對照外部溶液以1ml·min-1連續(xù)地灌注70NaCl，70氯化四乙銨，5 KCl，3 CaCl2，1 MgCl2，10mM葡萄糖，10 HEPES(pH 7.4)。膜片吸管含有(單位mM)140 CsF，5 NaCl，1 MgCl2，10亞乙基次氮基四乙酸(EGTA)，10 HEPES緩沖液(pH 7.2)。在對照條件下和在以不同濃度的μ-芋螺毒素CnIIIA(μ-CnIIIA)或以二乙酸蛤蚌毒素(STX)(Sigma-Aldrich Chemical Corp)灌注后記錄Na電流。
如一般實驗中所示(圖15)，通過浴槽溢流而施加的μ-CnIIIA(50nM)阻斷了由-100至-10mV去極化脈沖家族所激發(fā)的鈉電流(圖15A和15B)。如對濃度-反應數(shù)據(jù)擬合的S型非線性回歸曲線所確定的，μ-CnIIIA以濃度依賴方式阻斷鈉電流。降低50％峰值鈉電流(EC50)的有效濃度是14.0nM。如圖15C中所示，在μ-CnIIIA的存在下，鈉峰值電流已經(jīng)達到穩(wěn)態(tài)水平后開始沖失(washout)，并且在以無肽介質(zhì)洗滌時沒有被逆轉(zhuǎn)。相反，STX對鈉電流的作用在以不含STX的溶液灌注2-3分鐘之內(nèi)被徹底逆轉(zhuǎn)。在一般實驗中，μ-CnIIIA作用是持續(xù)存在的，而STX作用在從介質(zhì)中沖洗出去時是可逆的。
對小鼠的體內(nèi)實驗-趾外展評分(DAS)分析 在成年(2-3月齡)雄性或雌性Swiss-Webster小鼠(20-40g)上實施這些實驗。輕度麻醉的每只小鼠接受單次肌內(nèi)注射50μL或100μL含有μ-CnIIIA或普魯卡因的生理溶液至左后肢前外側(cè)區(qū)域。注射后，通過使用DAS分析法(Aoki，2001)監(jiān)測功能恢復。簡而言之，通過尾巴使小鼠懸空以激發(fā)其中動物伸展后肢并外展后趾的特征性震驚反應。在注射μ-CnIIIA或普魯卡因后，將左后肢和右后肢的趾外展程度作為時間的函數(shù)進行測定并由不了解處理的觀察者依據(jù)5點量表(0＝正常至4＝趾外展和腿伸展的最大減少)評分。
對小鼠的體內(nèi)實驗-握力評估 輕度麻醉的每只小鼠接受單次肌內(nèi)注射50μL含μ-CnIIIA或普魯卡因的生理溶液至每個前肢的前外側(cè)區(qū)域。使用與便攜式計算機連接的小鼠握力計(600g量程；Technical和Scientific Equipment GmbH，Bad Homburg，Germany)在注射前和在注射后的多個時間點上測量肌肉力量。本實驗基本上如最初對大鼠所述的(Tilson & Cabe，1978)實施。簡而言之，在尾基部固定小鼠并允許小鼠用兩只前爪子抓牢滾動桿。隨后溫和地把小鼠向后拽直至小鼠松開前爪為止。將每次試驗的峰值力量視為握力。每只小鼠進行三次試驗，間隔約30秒。試驗的平均值相對于對應的對照而表述，并用于分析(2-3只小鼠的均值±SEM)。
結(jié)果(圖12)顯示，分別在肌內(nèi)注射108-111皮摩爾μ-CnIIIA和22-26皮摩爾普魯卡因每克小鼠后約5分鐘和10分鐘出現(xiàn)相對力量的50％降低。除了約快2倍出現(xiàn)外，麻醉作用在肽存在下也比在局麻藥存在下更明顯。在體內(nèi)導致小鼠肌肉力量下降方面，肌內(nèi)注射μ-CnIIIA至少比普魯卡因更有效約5000倍。
鈉通道表達 為在非洲爪蟾卵母細胞(X.laevis)中表達，將Nav1.4/pUI-2載體用NotI線性化并用T7mMESSAGE mMACHINE試劑盒(Ambion)轉(zhuǎn)錄。
對克隆通道的電生理學研究 卵母細胞使用來自Drummond Scientific(Broomall，PA)的微量注射器以1ng/nl的濃度注射50nl cRNA。用于溫育卵母細胞的溶液含有96mM NaCl，2mM KCl，1.8mM CaCl2，2mM MgCl2和5mM HEPES，pH 7.4，補充有50mg/l硫酸慶大霉素和180mg/l茶堿。使用受pClamp數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)(Molecular Devices)控制的基因鉗(GeneClamp)500放大器(Molecular Devices)在室溫(18-22℃)進行雙-電極電壓鉗(TEVC)記錄。注射1日后記錄來自卵母細胞的全細胞電流。電壓電極和電流電極裝有3M KCl。維持這兩個電極電阻盡可能低。電解槽溶液組成是96mM NaCl，2mM KCl，1.8mM CaCl2，2mM MgCl2和5mM HEPES，pH 7.4。電流用4極低通貝塞爾濾波器在1kHz上過濾并且在5kHz上采樣。使用-P/4方案進行泄露扣除((leak subtraction)。在表達克隆的Nav1.4電壓門控鈉通道的卵母細胞中，通過從維持電位-90mV去極化至測試電位-10mV持續(xù)100毫秒而激發(fā)電流。脈沖頻率是0.2Hz并且采樣頻率是20kHz。全部實驗在室溫進行。
圖14中所示的結(jié)果顯示CnIIIA(500nM)阻斷所表達的Nav1.4通道的能力。從這些實驗中可以得出結(jié)論，即肽CnIIIA能夠以所估計的1-50nM范圍內(nèi)的IC50阻斷電壓門控鈉通道Nav1.4同種型。肽-通道相互作用與其中結(jié)合速率呈濃度依賴性的生物分子反應兼容。最后，已經(jīng)指出作用的可逆性很低。
實施例3 CnIIIA與其它μ-芋螺毒素的比較 對小鼠指長伸(EDL)肌收縮的體外實驗 從通過頸椎脫位處死并隨后立即放血的小鼠中分離EDL肌。將分離的肌肉設(shè)置在硅氧烷襯里的樹脂玻璃浴槽(4ml容積)中，其中該述浴槽含有組成如下(單位mM)的標準克雷布斯-林格氏生理溶液154 NaCl；5 KCl；2CaCl2；1 MgCl2；5 Hepes緩沖液(pH 7.4)；11葡萄糖。溶液供有純O2，。
為測量抽搐張力，EDL肌的一個腱通過可調(diào)式不銹鋼勾用絲線系扎于FT03等長傳感器(Grass Instruments，Astro-Med Inc.，West Warwick，RI，USA)，并且另一個腱用不銹鋼大頭針釘在硅氧烷襯里的浴槽上。通過用0.2毫秒持續(xù)時間和超大強度的電流脈沖以0.1Hz的頻率直接刺激肌纖維而誘發(fā)抽搐，其中所述的電流脈沖由S-44刺激儀(Grass Instruments，Astro-MedInc.，West Warwick，RI，USA)向沿著EDL肌放置的電極陣列供應。對于研究的每種制備物，調(diào)節(jié)靜息張力以得到最大收縮反應并且在整個實驗期間監(jiān)測靜息張力。來自等長傳感器的張力信號借助配置有DT-2821模擬/數(shù)字界面板(Data Translation，Marlboro，MA，USA)的計算機進行放大、收集和數(shù)字化。計算機化的數(shù)據(jù)的獲取和分析通過John Dempster博士(Strathclyde大學生理學/藥理學系(Department of Physiology & Pharmacology)，Glasgow，Scotland)提供的程序?qū)嵤?。全部實驗?2℃下進行。制備物用含有10μM筒箭毒堿的充氧生理溶液平衡15分鐘(旨在阻斷煙堿型受體)，將μ-芋螺毒素(CnIIIA、TIIIA、T3.1、PIIIA、SmIIIA或SIIIA)添加至介質(zhì)中。
為比較所研究的不同的μ-芋螺毒素對EDL肌的相對作用，在肌肉收縮上測試μ-芋螺毒素的相似濃度(即100nM)。當有可能時，在單個肌肉中產(chǎn)生濃度-反應曲線(在給定的μ-芋螺毒素的多種濃度存在下測量的收縮被表述為控制抽搐反應的百分數(shù))。μ-芋螺毒素的每種濃度通過灌注而施用并且允許平衡45-60分鐘。對濃度-反應數(shù)據(jù)的S型非線性回歸曲線擬合允許估計使抽搐張力降低達50％的有效濃度(EC50)。
結(jié)果(圖13) 通過40分鐘溫育后與CnIIIA(100nM)進行對比而給出每種肽(100nM)的肌肉的相對平均收縮抑制率。為便于比較，CnIIIA已經(jīng)歸一化至100％?？梢灾赋龅氖?，全部肽SmIIIA、PIIIA和T3.1顯示出的活性比CnIIIA低(下表)。
表2
對濃度-反應數(shù)據(jù)的S型非線性回歸曲線擬合允許估計使抽搐張力降低達50％的有效濃度并且因此推導出每種肽的Kd(單位nM)。結(jié)果如下表所示。
表3
文獻中公開μ-芋螺肽序列與CnIIIA[SEQ ID No2]的總結(jié) 表4
Z和O分別代表焦谷氨酸和羥脯氨酸殘基；*指羧基酰胺化；虛線表示二硫鍵對。
參考文獻列表
Amblard M.et al，2005，Methods Mol Biol.298，3-24
Baker，M.D.and Wood，J.N.，2001.Involvement of Na+ channels in painpathways.Trends Pharmacol.Sci.1(22)，27-31.
Becker，S.，Atherton，E.，Gordon，R.D.，1989.Synthesis andcharacterization of mu-conotoxin IIIa.Eur.J.Biochem.1(185)，79-84.
Benoit，E.，Charpentier G，Mateu L，Luzzati V，Kado R，2000.The pikeolfactory nervea source of unmyelinated sensory axons.Cybium，Rev.Eur.Ichtyol.3(24)，241-248.
Bulaj，G.，West，P.J.，Garrett，J.E.，Marsh，M.，Zhang，M.M.，Norton，R.S.，Smith，B.J.，Yoshikami，D.，Olivera，B.M.，2005.Novel conotoxins from Conusstriatus and Conus kinoshitai selectively block TTX-resistant sodium channels.Biochemistry 19(44)，7259-7265.
Cruz，L.J.，Gray，W.R.，Olivera，B.M.，Zeikus，R.D.，Kerr，L.，Yoshikami，D.，Moczydlowski，E.，1985.Conus geographus toxins that discriminate betweenneuronal and muscle sodium channels.J.Biol.Chem.16(260)，9280-9288.
Cruz，L.J.，Kupryszewski，G.，LeCheminant，G.W.，Gray，W.R.，Olivera，B.M.，Rivier，J.，1989.mu-conotoxin GIIIA，a peptide ligand for muscle sodiumchannelschemical synthesis，radiolabeling，and receptor characterization.Biochemistry 8(28)，3437-3442.
Decosterd，I.，Ji，R.R.，Abdi，S.，Tate，S.，Woolf，C.J.，2002.The pattern ofexpression of the voltage-gated sodium channels Na(v)1.8 and Na(v)1.9 does notchange in uninjured primary sensory neurons in experimental neuropathic painmodels.Pain 3(96)，269-277.
Fainzilber，M.，Kofman，O.，Zlotkin，E.，Gordon，D.，1994.A newneurotoxin receptor site on sodium channels is identified by a conotoxin thataffects sodium channel inactivation in molluscs and acts as an antagonist in ratbrain.J.Biol.Chem.4(269)，2574-2580.
Fainzilber，M.，Nakamura，T.，Gaathon，A.，Lodder，J.C.，Kits，K.S.，Burlingame，A.L.，Zlotkin，E.，1995.A new cysteine framework in sodiumchannel blocking conotoxins.Biochemistry 27(34)，8649-8656.
Finucane B.T.，2005.Allergies to local anesthetics-the real truth.50869-874.Canadian Journal of Anesthesia(50)，869-874.
French，R.J.，Prusak-Sochaczewski，E.，Zamponi，G.W.，Becker，S.，Kularatna，A.S.，Horn，R.，1996.Interactions between a pore-blocking peptideand the voltage sensor of the sodium channelan electrostatic approach tochannel geometry.Neuron 2(16)，407-413.
Gold，M.S.，Weinreich，D.，Kim，C.S.，Wang，R.，Treanor，J.，Porreca，F(xiàn).，Lai，J.，2003.Redistribution of Na(V)1.8 in uninjured axons enables neuropathicpain.J.Neurosci.1(23)，158-166.
Hill，J.M.，Alewood，P.F.，Craik，D.J.，1996.Three-dimensional solutionstructure of mu-conotoxin GIIIB，a specific blocker of skeletal muscle sodiumchannels.Biochemistry 27(35)，8824-8835.
Julius，D.and Basbaum，A.I.，2001.Molecular mechanisms of nociception.Nature 6852(413)，203-210.
Keizer，D.W.，West，P.J.，Lee，E.F.，Yoshikami，D.，Olivera，B.M.，Bulaj，G.，Norton，R.S.，2003.Structural basis for tetrodotoxin-resistant sodium channelbinding by mu-conotoxin SmIIIA.J.Biol.Chem.47(278)，46805-46813.
Kerr，L.M.and Yoshikami，D.，1984.A venom peptide with a novelpresynaptic blocking action.Nature 5956(308)，282-284.
Lee，A.G.，1976.Model for action of local anaesthetics.Nature 5569(262)，545-548.
McIntosh，J.M.，Olivera，B.M.，Cruz，L.J.，1999.Conus peptides as probesfor ion channels.Methods Enzymol.(294)，605-624.
Moczydlowski，E.，Olivera，B.M.，Gray，W.R.，Strichartz，G.R.，1986.Discrimination of muscle and neuronal Na-channel subtypes by bindingcompetition between [3H]saxitoxin and mu-conotoxins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 14(83)，5321-5325.
Nielsen，K.J.，Watson，M.，Adams，D.J.，Hammarstrom，A.K.，Gage，P.W.，Hill，J.M.，Craik，D.J.，Thomas，L.，Adams，D.，Alewood，P.F.，Lewis，R.J.，2002.Solution structure of mu-conotoxin PIIIA，a preferential inhibitor ofpersistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.J.Biol.Chem.30(277)，27247-27255.
Olivera，B.M.，Cruz，L.J.，de，S.，V，LeCheminant，G.W.，Griffin，D.，Zeikus，R.，McIntosh，J.M.，Galyean，R.，Varga，J.，Gray，W.R.，1987.Neuronalcalcium channel antagonists.Discrimination between calcium channel subtypesusing omega-conotoxin from Conus magus venom.Biochemistry 8(26)，2086-2090.
Olivera，B.M.，Gray，W.R.，Zeikus，R.，McIntosh，J.M.，Varga，J.，Rivier，J.，de，S.，V，Cruz，L.J.，1985.Peptide neurotoxins from fish-hunting cone snails.Science 4732(230)，1338-1343.
Olivera，B.M.，McIntosh，J.M.，Cruz，L.J.，Luque，F(xiàn).A.，Gray，W.R.，1984.Purification and sequence of a presynaptic peptide toxin from Conus geographusvenom.Biochemistry 22(23)，5087-5090.
Olivera，B.M.，Rivier，J.，Clark，C.，Ramilo，C.A.，Corpuz，G.P.，Abogadie，F(xiàn).C.，Mena，E.E.，Woodward，S.R.，Hillyard，D.R.，Cruz，L.J.，1990.Diversityof Conus neuropeptides.Science 4966(249)，257-263.
Ott，K.H.，Becker，S.，Gordon，R.D.，Ruterjans，H.，1991.Solution structureof mu-conotoxin GIIIA analysed by 2D-NMR and distance geometry calculations.FEBS Lett.2(278)，160-166.
Safo，P.，Rosenbaum，T.，Shcherbatko，A.，Choi，D.Y.，Han，E.，Toledo-Aral，J.J.，Olivera，B.M.，Brehm，P.，Mandel，G.，2000.Distinction among neuronalsubtypes of voltage-activated sodium channels by mu-conotoxin PIIIA.J.Neurosci.1(20)，76-80.
Sato，K.，Ishida，Y.，Wakamatsu，K.，Kato，R.，Honda，H.，Ohizumi，Y.，Nakamura，H.，Ohya，M.，Lancelin，J.M.，Kohda，D.，.，1991.Active site ofmu-conotoxin GIIIA，a peptide blocker of muscle sodium channels.J.Biol.Chem.26(266)，16989-16991.
Sato，S.，Nakamura，H.，Ohizumi，Y.，Kobayashi，J.，Hirata，Y.，1983.Theamino acid sequences of homologous hydroxyproline-containing myotoxins fromthe marine snail Conus geographus venom.FEBS Lett.2(155)，277-280.
Scholz，A.，2002.Mechanisms of(local)anaesthetics on voltage-gatedsodium and other ion channels.Br.J.Anaesth.1(89)，52-61.
Shichor，I.，F(xiàn)ainzilber，M.，Pelhate，M.，Malecot，C.O.，Zlotkin，E.，Gordon，D.，1996.Interactions of delta-conotoxins with alkaloid neurotoxins revealdifferences between the silent and effective binding sites on voltage-sensitivesodium channels.J.Neurochem.6(67)，2451-2460.
Shon，K.J.，Olivera，B.M.，Watkins，M.，Jacobsen，R.B.，Gray，W.R.，F(xiàn)loresca，C.Z.，Cruz，L.J.，Hillyard，D.R.，Brink，A.，Terlau，H.，Yoshikami，D.，1998.mu-Conotoxin PIIIA，a new peptide for discriminating amongtetrodotoxin-sensitive Na channel subtypes.J.Neurosci.12(18)，4473-4481.
Wakamatsu，K.，Kohda，D.，Hatanaka，H.，Lancelin，J.M.，Ishida，Y.，Oya，M.，Nakamura，H.，Inagaki，F(xiàn).，Sato，K.，1992.Structure-activity relationships ofmu-conotoxin GIIIAstructure determination of active and inactive sodiumchannel blocker peptides by NMR and simulated annealing calculations.Biochemistry 50(31)，12577-12584.
West，P.J.，Bulaj，G.，Garrett，J.E.，Olivera，B.M.，Yoshikami，D.，2002.Mu-conotoxin SmIIIA，a potent inhibitor of tetrodotoxin-resistant sodiumchannels in amphibian sympathetic and sensory neurons.Biochemistry 51(41)，15388-15393.
Yu，F(xiàn).H.and Catterall，W.A.，2003.Overview of the voltage-gated sodiumchannel family.Genome Biol.3(4)，20權(quán)利要求
1、一種μ-芋螺毒素肽，該μ-芋螺毒素肽基本上包括如SEQ ID No1所示的氨基酸序列、該氨基酸序列的生物活性片斷、它們的鹽、它們的組合、和/或它們的變體
Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17
SEQ ID No 1
其中，Xaa1 為任何N-修飾的氨基酸，
Xaa2 為甘氨酸，
Xaa3 為任何酸性氨基酸、或酸性氨基酸的任何酰胺形式，
Xaa4 為甘氨酸，
Xaa5 為脯氨酸或羥脯氨酸，
Xaa6 為任何堿性氨基酸，
Xaa7 為甘氨酸，
Xaa8 為任何非芳族羥基氨基酸，
Xaa9 為任何非芳族羥基氨基酸，
Xaa10 為任何堿性氨基酸，
Xaa11 為任何芳族氨基酸，
Xaa12 為任何堿性氨基酸，
Xaa13 為任何酸性氨基酸、或酸性氨基酸的任何酰胺形式，
Xaa14 為任何堿性氨基酸、或任何含硫的氨基酸，
Xaa15 為任何疏水性或非極性氨基酸、或任何非芳族羥基氨基酸，
Xaa16 為任何堿性氨基酸，
Xaa17 是缺失的，或者Xaa17為任何非極性氨基酸、或酰胺基。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的μ-芋螺毒素肽，其中，包括氨基酸Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6和Xaa7在內(nèi)的至少一種氨基酸、或者它們的任意組合是缺失的。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的μ-芋螺毒素肽，其中，包括氨基酸Xaa8、Xaa9、Xaa10和Xaa11在內(nèi)的至少一種氨基酸、或者它們的任意組合是缺失的。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的μ-芋螺毒素肽，其中，包括氨基酸Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15和Xaa16在內(nèi)的至少一種氨基酸、或者它們的任意組合是缺失的。
5、根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽，其中
氨基酸Xaa1的N-修飾選自由乙?；?、甲?；?、肉豆蔻酰化、或酰胺化所組成的組中；
Xaa3和Xaa13獨立地選自由天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、和焦谷氨酸所組成的組中；
Xaa6、Xaa10、Xaa12和Xaa16獨立地選自由精氨酸、賴氨酸、和組氨酸所組成的組中；
Xaa8和Xaa9獨立地選自由絲氨酸和蘇氨酸所組成的組中；
Xaa11選自由苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸所組成的組中；
Xaa14選自由精氨酸、賴氨酸、組氨酸、半胱氨酸、和甲硫氨酸所組成的組中；
Xaa15選自由甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、和脯氨酸所組成的組中；
Xaa17選自由甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、和脯氨酸所組成的組中。
6、根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽，其中，Xaa1為焦谷氨酸。
7、根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽，其中，所述氨基酸序列為如SEQ ID No 2所示的氨基酸序列、該氨基酸序列的生物活性片斷、它們的鹽、它們的組合、和/或它們的變體
pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys
SEQ ID No 2。
8、一種分離或純化的核酸序列，該核酸序列包括
i).編碼權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽的核苷酸序列，
ii).與i)互補的核酸序列，
iii).i)或ii)的簡并性核酸序列，
iv).能夠在嚴格條件下與i)、ii)、或iii)雜交的核酸序列，
v).編碼權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽的截短物、或類似物的核酸序列，
vi).和/或i)、ii)，iii)、iv)或v)的片段，該片段編碼權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽的生物活性片段。
9、一種藥物組合物，該藥物組合物含有藥物有效量的至少一種權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽作為活性物質(zhì)，該活性物質(zhì)選擇性地與制藥學上可接受的載體、稀釋劑、和/或輔藥組合。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，該藥物組合物用于治療或預防疼痛。
11、根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的藥物組合物，其中，所述疼痛為偏頭痛、急性疼痛、持續(xù)性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛、或傷害性疼痛。
12、權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備用于治療或預防與電壓敏感性鈉通道相關(guān)的病癥的藥物中的用途。
13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述電壓敏感性鈉通道為Nav1.4通道。
14、權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備麻醉藥中的用途。
15、一種用于在接受需要麻醉的手術(shù)操作的患者中提供骨骼肌松弛的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽、或權(quán)利要求9所述的藥物組合物以藥物有效量給藥至需要的患者。
16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述至少一種μ-芋螺毒素肽作為眼科麻醉藥被給藥。
17、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述至少一種μ-芋螺毒素肽作為局部麻醉藥被給藥。
18、根據(jù)權(quán)利要求15-17中的任意一項所述的方法，該方法具有約30分鐘-48小時的麻醉作用。
19、一種用于局部麻醉的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽、或權(quán)利要求9所述的藥物組合物以藥物有效量進行給藥。
20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于局部麻醉的方法，該方法具有約30分鐘-48小時的麻醉作用。
21、一種用于治療或預防疼痛的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽、或藥物組合物以藥物有效量進行給藥。
22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，該方法具有約30分鐘-12小時的作用。
23、一種麻醉藥，該麻醉藥含有權(quán)利要求9所述的藥物組合物、或權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽。
24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的麻醉藥，其中，該麻醉藥適于皮下施用、靜脈內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、經(jīng)皮膚施用、口腔途徑施用。
25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的麻醉藥，其中，該麻醉藥的形式為片劑、膠囊、錠劑、牙科糊劑、栓劑、吸入劑、溶液劑、軟膏劑、乳膏劑、和胃腸道外長效藥劑。
26、根據(jù)權(quán)利要求25所述的麻醉藥，其中，所述吸入劑為噴霧劑。
27、一種載體，該載體包括權(quán)利要求8所述的分離或純化的核酸序列。
28、一種可植入的裝置，該裝置包括權(quán)利要求9所述的藥物組合物、或權(quán)利要求1-7中的任意一項所述的μ-芋螺毒素肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的μ-芋螺毒素肽、該μ-芋螺毒素肽的生物活性片段、它們的組合、和/或它們的變體。本發(fā)明還涉及它們在用于治療或預防疼痛的藥物組合物中的用途，和它們在制備麻醉藥中的用途。
文檔編號C07K14/435GK101365716SQ200680050205
公開日2009年2月11日 申請日期2006年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者P·法夫羅, E·伯努瓦, J·莫爾格, R·斯托克林 申請人:雅瑟里斯實驗室, 科學研究國家中心