專利名稱：一種從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離純化高純度藻膽蛋白的方法。特別是涉及一種從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法。
背景技術：
藻紅蛋白、藻藍蛋白、變藻藍蛋白是一種很好的純天然色素，有鮮艷的顏色，可用作食物色素，也可用于化妝品工業(yè)，不會造成人為傷害，是理想的安全的添加劑，同時，藻紅蛋白、藻藍蛋白、變藻藍蛋白也是活性物質(zhì)，均具有穩(wěn)定的熒光現(xiàn)象和產(chǎn)生自由基作用，可以作為抗體熒光標記物質(zhì)以替代合成熒光物質(zhì)，因而已有生產(chǎn)藻藍蛋白和藻紅蛋白熒光標記免疫抗體試劑，用于醫(yī)學疾病臨床分子診斷和生命科學分子檢測，除了用于熒光檢測外，近年來，根據(jù)藻紅蛋白、藻藍蛋白、變藻藍蛋白吸收光譜的特征和產(chǎn)生自由基特點，藻紅蛋白、藻藍蛋白均可作為光敏劑，在光動力學治療腫瘤方面的前景不斷被越來越多的人看好，它以高效、無毒、副作用小等優(yōu)點，被認為是光動力學治療法中一種非常有前景的光敏劑，在光學信息存儲與處理，快速光電探測、人工神經(jīng)網(wǎng)絡等方面具有潛在的應用前景。目前，已可從數(shù)種海洋紅藻中提取藻膽蛋白，但高純度的藻膽蛋白價格十分昂貴，且價格還在迅速上漲，關于藻膽蛋白提取純化方面，雖然方法各異，但大多數(shù)是從螺旋藻中提取藻藍蛋白，而且，有的工藝簡單，所取蛋白純度極低，有的工藝過于復雜，且易使蛋白變性，不適合大量提取，還有些在提取過程中，要添加食用穩(wěn)定劑、糖類、無機鹽類、pH調(diào)節(jié)劑等，一般只能制得藥品級(A615nm/A280nm＞2)的藻藍蛋白，很難達到試劑級(A615nm/A280nm＞4)，正是由于上述這些分離技術存在的這些缺陷，使得制得的藻膽蛋白純度低，得率亦不高，以使高純度藻膽蛋白的價格高昂，最后，大大影響了高純度藻膽蛋白的廣泛應用，因此，降低藻膽蛋白純化成本是關鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種改進的從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，它不但能有效地從紫菜中提取高純度藻膽蛋白，而且，工藝簡單，成本低廉，得率較高。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的原料為紫菜，從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的步驟在低溫4℃條件下，先采用間隙方式，以10000～12000轉(zhuǎn)/分高速搗碎紫菜，低速離心得到紫菜最初提取液，接著將上述溶液加硫酸銨至20％飽和度，中速離心后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，中速離心后取沉淀，將上述沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解，再加硫酸銨至10％飽和度，接著中速離心后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至40％飽和度，再中速離心后取沉淀，將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解后高速離心，接著上清液脫鹽，脫鹽液再高速離心后上羥基磷灰石柱，用0.010M至0.030M的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)將藻紅蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集，用0.04M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集，用0.100M至0.120M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將變藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集，得到的藻紅蛋白純度達到4.5-6(A564nm/A280nm)，藻藍蛋白純度達到4-6(A615nm/A280nm)。
由于本發(fā)明以大型海藻紫菜為材料，通過細胞破碎方法、硫酸銨多次鹽析方法、柱層析方法等方法提取和純化藻膽蛋白，因此具有以下優(yōu)點1、采用多次硫酸銨鹽析法，使得藻類中的脂肪和多糖在初提階段就已全部除去，既防止了初提物中殘渣和粘性多糖堵塞層析柱，又克服了低滲法降低得率的缺點；
2、一次過柱就可得到高純度的藻膽蛋白，解決了大規(guī)模提取純化藻膽蛋白的瓶頸；3、一次過柱就可得到三種藻膽蛋白(藻紅蛋白、藻藍蛋白、變藻藍蛋白)；4、我國是紫菜生產(chǎn)大國，年產(chǎn)量20億張左右，目前市場上大多是自然涼干的紫菜，銷售價格在每千克20-30元，而每噸飼料級螺旋藻干粉6-8萬元人民幣(60-80元/千克)，曾一度高達每kg 30美元(約240元/千克)，是紫菜的十倍，因此，本發(fā)明所用原料來源廣泛，無需加工，成本相對于螺旋藻便宜的多；5、所用材料硫酸銨價格便宜，羥基磷灰石可重復使用，再生方便；6、成本低，如果不包括勞動力成本，初步估算僅為同類產(chǎn)品的四十至五十分之一；7、得率高，可以達到0.2％左右，是目前常用的藻膽蛋白分離方法的20倍。
具體實施例方式以下將對本發(fā)明的一種從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法的實施例作進一步詳細的描述。
本實施例中所用的材料為大型海藻紫菜，具體步驟如下一、進行高速搗碎加5000轉(zhuǎn)/分的低速離心15分鐘的方法得到紫菜最初提取液，高速搗碎以間隙搗碎方式進行，以免溫升超過4℃以上，搗碎轉(zhuǎn)速為10000～12000轉(zhuǎn)/分；二、將上述所提取溶液加硫酸銨至20％飽和度，后以10000轉(zhuǎn)/分中速離心15分鐘后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，再以中速10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘后取沉淀；三、將沉淀用0.001M磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)溶解，加硫酸銨至10％飽和度，以10000轉(zhuǎn)/分中速離心15分鐘后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至40％飽和度，再以中速為10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘后取沉淀；四、再次將沉淀用0.001M磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)溶解后高速離心，轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分，30分鐘后，上清液脫鹽，再以轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分高速離心30分鐘，后上羥基磷灰石柱；五、用0.010M至0.030M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將藻紅蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；六、用0.040M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；七、用0.100M至0.120M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將變藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集，得到的藻紅蛋白純度達到4.5-6(A564nm/A280nm)，藻藍蛋白純度達到4-6(A615nm/A280nm)。
上述各步均在溫度為4℃下進行。
權利要求
1.一種從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于選取原料為紫菜，在溫度為4℃下進行以下各項操作步驟(1)、進行高速搗碎，高速搗碎以間隙搗碎方式進行，以免溫升超過4℃以上，高速搗碎轉(zhuǎn)速為10000～12000轉(zhuǎn)/分，后以5000轉(zhuǎn)/分低速離心15分鐘的方法得到紫菜最初提取液；(2)、將上述所提取溶液加硫酸銨至20％飽和度，接著以10000轉(zhuǎn)/分中速離心15分鐘后取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，再以10000轉(zhuǎn)/分中速離心15分鐘后取沉淀；(3)、將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解，加硫酸銨至10％飽和度，中速離心取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至40％飽和度，中速離心取沉淀，中速離心都取為10000轉(zhuǎn)/分，中速離心時間均是15分鐘；(4)、再將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解后以15000轉(zhuǎn)/分，高速離心30分鐘，上清液脫鹽，再以15000轉(zhuǎn)/分高速離心30分鐘后上羥基磷灰石柱；(5)、用0.010M至0.030M的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)將藻紅蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；(6)、用0.040M的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；(7)、用0.100M至0.120M的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)將變藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集，得到的藻紅蛋白純度達到4.5-6(A564nm/A280nm)，藻藍蛋白純度達到4-6(A615nm/A280nm)。
全文摘要
一種從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法?，F(xiàn)有的藻膽蛋白一般都是從螺旋藻中分離，并且分離技術也尚存在一些缺陷，使制得的藻膽蛋白純度低，得率亦不高，以使高純度藻膽蛋白的價格高昂。本發(fā)明的主要特征是采用從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，主要包括以下步驟在低溫下高速搗碎紫菜，離心得上清夜，硫酸銨多次鹽析法制備藻膽蛋白初提液，再經(jīng)透析和高速離心，將得到的溶液上羥基磷灰石柱，用低濃度分步洗脫分別得到藻紅蛋白和藻藍蛋白，再用高濃度洗脫可得到變藻藍蛋白。本發(fā)明的從紫菜中分離純化高純度藻膽蛋白的方法工藝簡單，成本低廉，方便實用。
文檔編號C07K1/00GK1796405SQ20041009903
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權日2004年12月27日
發(fā)明者何培民, 蔡春爾, 吳慶磊 申請人:上海水產(chǎn)大學