專利名稱：由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物產品制造技術領域，尤其涉及一種由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法。
背景技術：
膠原蛋白在動物皮膚、軟骨、骨骼、肌腱等組織中廣泛存在，是一組蛋白，已發(fā)現(xiàn)有近20種。真皮中80～85％為膠原蛋白，主要是I、III型膠原蛋白，骨骼三分之一的有機物中，絕大部分是I型膠原蛋白。天然膠原蛋白分子由三股螺旋多肽鏈纏繞組成，螺旋間以氫鍵結合，分子量大。膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量異常豐富。將膠原蛋白進行水解，可得到較小分子量的膠原活性多肽，其水溶性增大，并保持了膠原蛋白的諸多優(yōu)良性質，在醫(yī)學美容、化妝品、組織修復、手術止血、醫(yī)用膠囊、微膠囊、藥用、食品工業(yè)等眾多工業(yè)領域有重要應用。
通常，膠原蛋白由牛、豬等家畜的皮膚、肌腱和骨骼中提取。近幾年，受世界范圍內瘋牛病、口蹄疫等家畜流行病的影響，畜源性膠原蛋白的安全性引起了普遍擔憂。由禽源性動物皮膚、骨骼、肌腱等組織中提取膠原蛋白，成為獲取天然膠原蛋白及其水解活性多肽的一條新途徑。目前對禽源性膠原蛋白的提取研究很少，對其水解多肽制品的研究未見報道。美國專利US 5138030(1992)提出了用酶法和有機酸溶解方法從禽類組織中提取膠原蛋白的方法；美國專利US 0142368A1(2002)公開了以雞、鵝等家禽皮、骨等組織為原料，在水介質中進行加熱處理來直接提取膠原蛋白的方法；中國臺灣D.C.Liu等在Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，14(11)1638-1644，2001中報道了用酸溶液浸取從雞腳中提取酸溶性膠原蛋白的方法?，F(xiàn)有的禽源性膠原蛋白提取技術得到的是膠原明膠，分子量大，常溫下水溶性差，而且明膠的純度低，收率不高。
對禽源性膠原明膠進一步水解，可得到膠原多肽。目前針對禽源性膠原活性多肽的制備技術未見報道。對畜源性膠原蛋白的水解已是公知技術，主要有堿法、酶水解法(例如中國專利CN1403585A，2003)和酸法(例如美國專利US4130555，1978)。這些方法各有利弊堿法易使蛋白質分子結構破壞和變性而失去活性，尤其是大部分胱氨酸和半胱氨酸會被破壞，降低了膠原蛋白水解多肽的營養(yǎng)價值；酶法操作條件溫和，得到的產品屬分子量較集中的單一產品，但需要的反應時間長，條件控制嚴格，使用的酶是一次性的，成本往往較高，且易因所用的生物酶難于純化而使水解產物的分離困難；酸法水解迅速，可避免外消旋作用，減少水解多肽的損失，但得到的多肽分子量范圍較大，控制條件要求嚴格。禽源性天然膠原蛋白與畜源性膠原蛋白的不同主要體現(xiàn)在其膠原間交聯(lián)的緊密程度不同，禽源性膠原蛋白交聯(lián)較弱(美國專利US 0142368A1)。因此，禽源性膠原蛋白水解為活性多肽時，需要的水解技術和條件與公知的畜源性膠原蛋白水解技術不同，有特殊性的一面，需要進行研究探索。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法。
以鴨腳為原料，用1.0～5.0％稀酸液對原料進行浸泡預處理，水洗后用60～85℃熱水抽提4～10小時得到膠原明膠提取液，將提取液濃縮至膠原蛋白濃度為5～25％(w/w)，加酸調節(jié)pH值為0.5～4.0，65～90℃水解3～8小時，加堿液中和至pH為7.0～8.0，離心得到膠原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有機溶劑，有機溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)，充分攪拌后靜置5～8小時，離心得多肽沉淀，經減壓干燥，制得膠原活性多肽產品。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)采用酸法水解，工藝簡單迅速，成本低，且減少了水解多肽的損失，產品質量好；(2)采用有機溶劑沉淀法，既分離得到水解多肽產品，又同時實現(xiàn)去雜、去色和去味，提高了產品的質量；(3)產品的氨基酸含量高；(4)通過控制適宜的水解條件，使膠原蛋白大分子斷裂為活性多肽，增加了膠原蛋白的水溶性，便于在化妝品、醫(yī)藥、食品等工業(yè)領域中應用具體的實施方式由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法，它的生產步驟如下(1)原料預處理與膠原明膠液的提取取鴨腳即鴨掌、鴨蹼、鴨腳梗為原料，清洗干凈，用稀酸液浸泡，水洗，然后用去離子水浸泡，所用酸為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸中的一種或多種配成的混合物，濃度1.0～5.0％，浸泡時間為400～480小時，水洗后pH值為4.0～6.0，去離子水浸泡時間為12～24小時，將預處理好的原料加入去離子水，在溫度60～85℃下進行抽提，得到膠原明膠液，抽提時間為4～10小時；(2)膠原明膠液濃縮和酸法水解將所得的膠原明膠液過濾，然后于50～70℃、0.095～0.099MPa下減壓濃縮，使?jié)饪s液中膠原蛋白的濃度為5～25％(w/w)，直接用酸法進行水解，所用的酸液為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸、草酸中的一種或多種配成的混合物，調節(jié)pH值為0.5～4.0，水解溫度為65～90℃，水解時間為3～8小時；(3)水解液中和與有機溶劑沉淀將水解液用堿液進行中和至pH為7.0～8.0，靜置2～8小時，6000～8000rpm下離心15～20min，棄去沉淀，得到膠原多肽的水溶液，所用堿液為碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種；向所得的膠原多肽水溶液中加入有機溶劑將膠原多肽沉淀析出，在6000～8000rpm下離心15～20min，收集沉淀，所用的有機溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或多種配成的混合物，有機溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)；(4)干燥將所得沉淀于50～70℃下進行干燥24～36小時，粉碎，或者配為溶液進行噴霧干燥，得到粉末即為膠原多肽產品。
根據以上方法制得的膠原活性多肽收率為3.5～5.5％(干品/原料濕重)。
產品的指標如下外觀白色略帶淡黃色粉末分子量2kDa～35kDa含氮量＞16％氨基酸總量＞90％重金屬含量＜10ppm水溶性＞15g/100mL水(25℃)1％水溶液pH值為6.5～7.0水分含量2.0～4.5％。
以上制備過程中，酸法水解適宜條件的控制和膠原水解多肽的分離純化是本發(fā)明的關鍵技術。
鴨是我國廣泛飼養(yǎng)的家禽。新鮮鴨腳原料來源廣，尤其在我國南方地區(qū)鴨腳資源豐富，很容易得到，價格便宜。鴨掌和鴨蹼中80％以上為天然膠原蛋白、其次為少量的脂肪、其它蛋白和水分等成分，鴨腳梗1/3有機物中絕大部分也是膠原蛋白，品質優(yōu)良。本發(fā)明所用的鴨腳原料購自浙江杭州。
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述實例1取鴨腳(鴨趾、鴨蹼和鴨腳梗)10000g，清洗干凈，于5.0％乙酸液中浸泡400小時，水洗pH值6.0，去離子水浸泡24小時。然后，在72℃熱水中抽提8小時，過濾，所得濾液于50℃、0.099MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為5％(w/w)，向濃縮液中加入檸檬酸調pH為3.5。于90℃下水解3小時，用碳酸鈉調pH值為7.0，靜置2小時，然后在8000rpm下離心20min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入有機溶劑混合物(丙酮和甲醇1∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為4∶1(v/v)，8000rpm下離心20min，棄上清液得沉淀，將沉淀于65℃干燥30小時，得膠原多肽粉末440g，膠原多肽收率為4.4％(干品/原料濕重)。
實例2取鴨腳梗2000g，清洗干凈，于3.0％檸檬酸液中浸泡480小時，水洗pH值5.0，去離子水浸泡16小時。然后，在85℃熱水中抽提4小時，過濾，所得濾液于55℃、0.099MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為15％(w/w)，向濃縮液中加入硫酸調pH為4.0。于68℃下水解7小時，用氫氧化鉀調pH值為7.5，靜置8小時，然后在8000rpm下離心15min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入有機溶劑混合物(丙酮和乙醇2∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為4.5∶1(v/v)，8000rpm下離心15min，棄上清液得沉淀，將沉淀于50℃干燥30小時，得膠原多肽粉末90g，膠原多肽收率為4.5％(干品/原料濕重)。
實例3取鴨腳750g，清洗干凈，于1.0％硫酸液中浸泡450小時，水洗pH值4.0，去離子水浸泡18小時。然后，在65℃熱水中抽提8小時，過濾，所得濾液于65℃、0.097MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為25％(w/w)，向濃縮液中加入乙酸和鹽酸混合液(乙酸和濃鹽酸6∶1，v/v)，調pH為0.5。于65℃下水解8小時，用碳酸氫鈉調pH值為7.0，靜置8小時，然后在7000rpm下離心18min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入有機溶劑混合物(乙醇和異丙醇4∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為3∶1(v/v)，7000rpm下離心18min，棄上清液得沉淀，將沉淀于61℃干燥28小時，得膠原多肽粉末31g，膠原多肽收率為4.1％(干品/原料濕重)。
實例4取鴨蹼約40g，清洗干凈，4.0％鹽酸浸泡420小時，水洗，去離子水浸泡12小時，再水洗pH值5.0。60℃熱水抽提10小時，得提取液于50℃、0.095atm下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為10％(w/w)，向濃縮液中加入草酸與檸檬酸混合液(草酸和檸檬酸2∶1，v/v)，調pH約2.5。72℃下水解4小時，用氫氧化鈉調pH值為8.0。靜置5小時，然后在6000rpm下離心20min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入丙酮，與膠原多肽水溶液的比例為4∶1(v/v)，6000rpm下離心20min，棄上清液得沉淀，將沉淀于70℃干燥24小時，得膠原多肽粉末2.1g，膠原多肽收率為5.2％(干品/原料濕重)。
實例5取鴨腳4500g，清洗干凈，于3.5％鹽酸和乙酸液(重量比2∶1)中浸泡480小時，水洗pH值4.0，去離子水浸泡18小時。然后，在65℃熱水中抽提8小時，過濾，所得濾液于70℃、0.099MPa下減壓濃縮，使得濃縮液中膠原蛋白的含量為20％(w/w)。向濃縮液中加入乙酸和鹽酸混合液(乙酸和濃鹽酸6∶1，v/v)，調pH為1.5。于71℃下水解8小時，用碳酸氫鈉調pH值為7.0，靜置8小時，然后在8000rpm下離心15min，棄去沉淀，得膠原多肽水溶液。向其中加入乙醇和異丙醇(2∶1，v/v)，與膠原多肽水溶液的比例為5∶1(v/v)，7000rpm下離心20min，棄上清液得沉淀，將沉淀于55℃干燥36小時，得膠原多肽粉末220g，膠原多肽收率為4.8％(干品/原料濕重)。
權利要求
1.一種由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法，其特征在于以鴨腳為原料，用1.0～5.0％稀酸液對原料進行浸泡預處理，水洗后用60～85℃熱水抽提4～10小時得到膠原明膠提取液，將提取液濃縮至膠原蛋白濃度為5～25％(w/w)，加酸調節(jié)pH值為0.5～4.0，65～90℃水解3～8小時，加堿液中和至pH為7.0～8.0，離心得到膠原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有機溶劑，有機溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)，充分攪拌后靜置5～8小時，離心得多肽沉淀，經減壓干燥，制得膠原活性多肽產品。
2.根據權利要求1所述的一種由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法，其特征在于它的生產步驟如下(1)原料預處理與膠原明膠液的提取取鴨腳即鴨掌、鴨蹼、鴨腳梗為原料，清洗干凈，用稀酸液浸泡，水洗，然后用去離子水浸泡，所用酸為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸中的一種或多種配成的混合物，濃度1.0～5.0％，浸泡時間為400～480小時，水洗后pH值為4.0～6.0，去離子水浸泡時間為12～24小時，將預處理好的原料加入去離子水，在溫度60～85℃下進行抽提，得到膠原明膠液，抽提時間為4～10小時；(2)膠原明膠液濃縮和酸法水解將所得的膠原明膠液過濾，然后于50～70℃、0.095～0.099MPa下減壓濃縮，使?jié)饪s液中膠原蛋白的濃度為5～25％(w/w)，直接用酸法進行水解，所用的酸液為硫酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸、草酸中的一種或多種配成的混合物，調節(jié)pH值為0.5～4.0，水解溫度為65～90℃，水解時間為3～8小時；(3)水解液中和與有機溶劑沉淀將水解液用堿液進行中和至pH為7.0～8.0，靜置2～8小時，6000～8000rpm下離心15～20min，棄去沉淀，得到膠原多肽的水溶液，所用堿液為碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種；向所得的膠原多肽水溶液中加入有機溶劑將膠原多肽沉淀析出，在6000～8000rpm下離心15～20min，收集沉淀，所用的有機溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或多種配成的混合物，有機溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)；(4)干燥將所得沉淀于50～70℃下進行干燥24～36小時，粉碎，或者配為溶液進行噴霧干燥，得到粉末即為膠原多肽產品。
3.根據權利要求1或2所述的一種由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法，其特征在于最佳制備條件為所說膠原明膠濃縮液中膠原蛋白的濃度為20％(w/w)；酸法水解時濃縮明膠液的pH值調為4.0，水解溫度71℃，水解時間8小時；有機溶劑沉淀步驟中，有機溶劑與膠原多肽水溶液的比例為5∶1(v/v)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由禽源性動物組織中制備膠原活性多肽的方法。以鴨腳為原料，用1.0～5.0％稀酸液對原料進行浸泡預處理，水洗后用60℃～85℃熱水抽提4～10小時得到膠原明膠提取液，將提取液濃縮至膠原蛋白濃度為5～25％(w/w)，加酸調節(jié)pH值為0.5～4.0，65℃～90℃水解3～8小時，加堿液中和至pH為7.0～8.0，離心得到膠原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有機溶劑，有機溶劑與膠原多肽水溶液的比例為3～5∶1(v/v)，充分攪拌后靜置5～8小時，離心得多肽沉淀，經減壓干燥，制得膠原活性多肽產品。本發(fā)明所用原料來源廣泛易得，成本低、操作方便，條件溫和、生產周期較短、產品收率高。
文檔編號C07K14/78GK1587277SQ200410052758
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月8日 優(yōu)先權日2004年7月8日
發(fā)明者姚善涇, 林東強, 贠軍賢, 關怡新 申請人:浙江大學