專利名稱：雙(5－甲?；坊?醚衍生物、制備方法及藥學的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬藥物合成領域，具體涉及一類新型天然雙(5-甲?；坊?醚衍生物，制備方法和在藥學上的應用。
自1963年Blumberg等人在人血清中發(fā)現乙型肝炎病毒(HepatitisB virus，HBV)以來，HBV在全世界范圍內廣泛傳播。目前有20億人感染過HBV，我國的感染率高達50～70％，有1億多人是乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的攜帶者。HBV持續(xù)感染會導致肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌等肝臟疾病，病死率高。盡管乙肝疫苗已經廣泛使用，在一定范圍內對乙型肝炎起到有效的預防，但存在有無應答和不良反應等問題，目前用于臨床的抗HBV藥物，有以核苷類似物為代表的化學藥物、以干擾素為代表的生物類藥物和中草藥及其有效成分。然而核苷類似物藥物雖然是有效的HBV病毒DNA的逆轉錄酶抑制劑，卻存在停藥后復發(fā)率高、對HBsAg作用不明顯、以及有較大不良反應等問題；干擾素生物類藥物治療乙型肝炎的復發(fā)率較高，且不良反應大，臨床難以廣泛使用；中草藥有效成分提取純化難度大，結構復雜因而合成困難。尋找低毒、高效、停藥復發(fā)率低、結構簡單合成容易的抗HBV藥物，已成為當今醫(yī)藥學界的一項重要任務。
有研究報道，從植物山里紅(Crataegus Pinnatifida Bge.Var.majcrN.E.Br.)的成熟果實山楂、西南忍冬(Lonicera bournei Hemsl)花蕾、薄蓋林芝(Ganoderma capense(Lloyd)Teng)深層發(fā)酵菌絲體、川芎(Ligusticum chuanxing Hort)的根莖中分離得到化合物雙(5-甲?；坊?醚(1)和羥甲基呋喃甲醛(2)(Scheme 1)，其中化合物1具有廣泛的抗病毒、抗結核桿菌以及抗氧化活性，并經實驗證實其能強烈地抑制乙型肝炎病毒(HBV)，達到保護肝細胞的作用。

本發(fā)明的另一目的是提供上述雙(5-甲?；坊?醚衍生物的制備方法。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述新型雙(5-甲?；坊?醚衍生物在制備治療病毒性疾病的藥物中的應用。
本發(fā)明雙(5-甲?；坊?醚衍生物具有下述式I、II、III、IV、V或VI的結構， 其中R1、R2、R3和R4可以是獨立的氫，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，鹵素，羧基，羧酸酯，酮基和酰胺基或胺基。R5可以是氫，烷基，環(huán)烷基，芳基或取代芳基和?；?。X可以是-CH2-、-NH-、-O-。Y可以是-CH-、-N-。 其中R6、R7、R8和R9可以是獨立的氫，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，鹵素，羥基或胺基。
R10可以是獨立的氫，芳基，取代芳基或烷基。
Z可以是-NH-、-O-。
本發(fā)明雙(5-甲酰基糠基)醚衍生物通過藥效學包括體外抑制HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg和HBeAg試驗研究，顯示了很好的抑制HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg和HBeAg活性，并且毒副作用小，可研制治療病毒性疾病尤其是病毒性乙型肝炎病毒的新藥。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物是具有下述3、4、5結構的化合物 本發(fā)明雙(5-甲?；坊?醚由下式反應獲得 本發(fā)明實施例1，詳細描述了化合物1的新的制備方法，制備過程如下式 本發(fā)明公開的上述式II和式IV的雙(5-甲?；坊?醚衍生物由下式反應獲得 其中，X＝-NH-，R1、R2、R3、R4的定義如上所述。本發(fā)明實施例2，描述了化合物5的制備方法，制備過程如下式 化合物5的制備工藝包括將吡啶與30％的雙氧水在冰醋酸條件下維持80～85℃ 11.5小時，蒸干溶劑并經油泵減壓蒸餾后得化合物6純品。化合物6溶于濃硫酸后加入濃硫酸-發(fā)煙硝酸硝化，維持95～100℃ 12小時，然后加入冰水中稀釋并經氫氧化鈉中和后，用氯仿提取、洗滌、干燥、蒸去氯仿后得化合物7。將7溶于甲醇，加入鈀炭、甲酸銨回流15分鐘，過濾除濾渣，甲醇洗滌濾渣后與濾液合并、濃縮，用2 N氫氧化鈉溶液溶解，乙酸乙酯提取，干燥、濃縮后得化合物8的純品。將化合物8和化合物2溶解于甲苯中，對甲苯磺酸催化下帶水回流110小時，冷至室溫后加入甲醇和硼氫化鉀、維持35℃攪拌3小時至完全，濃縮后加入少量蒸餾水溶解、氯仿提取、洗滌、干燥、濃縮，經硅膠柱層析分離得到化合物5純品。
本發(fā)明實施例3，描述了化合物3、4的制備方法，制備過程如下式， 化合物3或4的制備工藝包括將化合物8和化合物9溶解于苯中，對甲苯磺酸催化下帶水回流84小時，冷至室溫后加入甲醇和硼氫化鉀、室溫攪拌5小時至完全，濃縮后加入蒸餾水溶解、氯仿提取、洗滌、干燥、濃縮，經硅膠柱層析分離得化合物3純品。將化合物3和DCC溶解于丙酮和三乙胺的混合溶液中，加入呋喃甲酸室溫攪拌18小時后，濃縮、乙酸乙酯溶解、蒸餾水洗滌、干燥，濃縮后經硅膠柱層析得到化合物4純品。
本發(fā)明雙(5-甲?；坊?醚衍生物經乙型肝炎病毒體外藥效試驗(體外抑制HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg和HBeAg試驗)結果顯示對HbsAg的抑制作用明顯超過對照品拉米呋啶(3TC)。細胞毒性試驗顯示此類雙(5-甲?；坊?醚衍生物毒性較小(100μg/ml的細胞存活率高于75％)。此類雙(5-甲?；坊?醚衍生物顯示很好的抑制HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg活性和較小的細胞毒性作用，可研制治療病毒性感染疾病尤其是病毒性乙型肝炎的新藥。
5-氯甲基呋喃甲醛36.6g(0.253mol)滴加至100mL煮沸的蒸餾水中，回流。薄層色譜跟蹤顯示反應完全，冷卻至室溫，用乙酸乙酯提取，無水硫酸鎂干燥，蒸盡溶劑，得紅棕色液體羥甲基呋喃甲醛35.8g，收率約100％，薄層板經羥甲基呋喃甲醛對照品比較，結果一致，本品直接用于下步反應。
羥甲基呋喃甲醛1.26g(10mmoL)、氯甲基呋喃甲醛1.45g(10mmoL)溶解于100mL丙酮，加入1.6g(11mmoL)碳酸鉀和1.9g(11mmoL)碘化鉀，氮氣下回流12小時。冷卻至室溫，蒸去丙酮，加入50mL氯仿和30mL蒸餾水，攪拌20分鐘。分離出水相和氯仿相，水相用氯仿提取四次(50mL×4)。合并氯仿相，飽和氯化鈉溶液洗滌二次(50mL、30mL)至中性，無水硫酸鎂干燥過夜。蒸去氯仿，得粗品3.2g，硅膠柱層析分離，得純品雙(5-甲?；坊?醚1.01g，收率42.7％，mp112～114℃。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ4.6(4H，s，-CH2-O-)，6.6(2H，dd，ArH)，7.2(2H，dd，ArH)，9.6(2H，s，-CHO)。MS(％)m/z234(1.68)，206(17.59)，123(7.76)，109(100.00)，95(16.36)，81(80.08)，69(10.70)，53(61.22)。
實施例2合成化合物5雙[5-(4-吡啶基)氨甲基糠基]醚160mL30％雙氧水溶于300mL乙酸，加熱至70℃以上，滴加123mL吡啶，控制反應溫度80℃以下，維持80～85℃2.5小時，補加160mL雙氧水，繼續(xù)維持80～85℃ 9小時。冷卻至室溫，減壓除去水和過量的乙酸后，油泵減壓蒸餾，得產品N-氧化吡啶132.4g，收率91.7％，bp135～138℃/400Pa。
向6g N-氧化吡啶中，攪拌下滴加12mL濃硫酸使之溶解，再滴加含15mL發(fā)煙硝酸和17mL濃硫酸的混酸，加熱至95～100℃，反應12小時。倒入120g的冰水中，攪拌下，用60g氫氧化鈉糊調節(jié)至中性，析出固體。過濾，氯仿提取濾液三次，濾渣用氯仿洗滌三次，合并氯仿溶液，無水硫酸鎂干燥2小時。減壓蒸去氯仿，得淡黃色結晶固體4-硝基-N-氧化吡啶7.3g，收率82.6％，mp162～164℃。
將10.5g 4-硝基-N-氧化吡啶、35.5g甲酸胺和0.9g鈀炭溶于350mL甲醇中，加熱至60℃，維持15分鐘，冷卻至室溫，過濾，除去鈀炭，甲醇洗滌(20mL×4)，合并甲醇溶液。減壓蒸去甲醇，析出固體。向固體中加入2N氫氧化鈉溶液后，用乙酸乙酯提取八次(60mL×8)，合并乙酸乙酯溶液，無水硫酸鎂干燥過夜。減壓蒸去乙酸乙酯，得淡黃色固體4-氨基吡啶5.7g，收率81％，mp162～165℃。
300mg 4-氨基吡啶、384mg雙(5-甲酰基糠基)醚及催化量的對甲苯磺酸溶解于40mL甲苯，分水器帶水回流110小時。冷卻至室溫，加入920mg鉀硼氫和40mL甲醇，油浴35℃加熱3小時。停止加熱，減壓蒸去溶劑，加入50mL氯仿和20mL蒸餾水溶解，分離出水相和氯仿相，水相用氯仿提取三次(50mL×3)。合并氯仿相，飽和氯化鈉溶液洗滌二次(50mL、30mL)至中性，無水硫酸鎂干燥過夜。次日，蒸去氯仿，得到粗品(15)，硅膠層析柱分離，得純品雙[5-(4-吡啶基)氨甲基糠基]醚140mg，收率21.3％。1H-NMR(300MHz，DMSO)δ4.2(4H，d，-CH2-N-)，4.3(4H，s，-CH2-O-)，5.6(2H，br，NH)，6.1(2H，d，ArH)，6.2(2H，d，ArH)，6.5(4H，d，ArH)，8.1(4H，d，ArH)。MS(％)m/z390(100.00)，203(59.48)，187(88.25)，173(26.66)，102(23.50)，95(64.32)，81(21.15)，51(11.51)。實施例3合成化合物[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇300mg 4-氨基吡啶、384mg5-乙酰氧甲基呋喃-2-甲醛及催化量的對甲苯磺酸溶解于20mL甲苯，分水器帶水回流84小時。停止加熱，冷卻至室溫，加入680mg鉀硼氫和20mL甲醇，室溫攪拌5小時。減壓蒸去溶劑，加入50mL氯仿和20mL蒸餾水溶解，分離出水相和氯仿相，水相用氯仿提取三次(50mL×3)。合并氯仿相，飽和氯化鈉溶液洗滌二次(50mL、30mL)至中性，無水硫酸鎂干燥過夜。次日，蒸去氯仿，得到粗品500mg，硅膠層析柱分離，得純品[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇240mg，收率52％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ4.3(2H，d，-CH2-N-)，4.6(2H，s，-CH2-O-)，5.0(H，br，NH)，6.2(2H，dd，ArH)，6.5(2H，dd，ArH)，8.1(2H，dd，ArH)。MS(％)m/z204(35.80)，173(10.52)，111(100.00)，94(18.15)，83(35.67)，55(26.21)，51(19.33)，43(13.04)。
實施例4 合成化合物[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇糠酸酯201mg[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇和206mgDCC溶解于35ml丙酮和吡啶(6∶1)的混合溶液，冰浴下滴加含112mg糠酸的35ml丙酮和吡啶(6∶1)的溶液，室溫攪拌18小時。停止反應，減壓蒸去溶劑，加入100ml乙酸乙酯溶解，蒸餾水洗滌5次(30ml×5)，無水硫酸鎂干燥過夜。過濾，蒸凈乙酸乙酯苯帶吡啶二次，硅膠層析柱分離，得純品[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇糠酸酯180mg，收率94.9％。1H-NMR(300MHz，)δ3.6(H，br，NH)，4.3(2H，d，-CH2-N-)，5.2(2H，s，-CH2-O-)，6.3(H，d，ArH)，6.5(2H，d，ArH)，6.7(2H，d，ArH)，7.3(H，t，ArH)，7.9(H，d，ArH)，8.1(2H，d，ArH)。MS(％)m/z298(22.83)，205(41.96)，203(14.98)，187(10.34)，186(18.50)，95(100.00)，78(12.65)，51(15.71)。實施例5化合物的細胞毒性實驗測定化合物的細胞毒性之實驗方法采用MTT法，即四氮唑鹽還原法，簡述如下HepG2 2.2.1.5細胞(由教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室提供)在96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天后，加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)9天(每3天換液一次)，用MTT法檢測樣品對HepG2 2.2.1.5細胞的毒性。
本測定以細胞存活率作為判斷細胞毒性的指標，細胞存活率＞或＝75％認為無明顯的細胞毒性，細胞存活率＜75％認為有細胞毒性。
試驗結果表明，化合物毒性較小。100μg/ml濃度下，HepG22.2.1.5細胞存活率均＞或＝75％；200μg/ml濃度下，大部分化合物作用下的HepG2 2.2.1.5細胞存活率＞或＝75％。表1是HepG2 2.2.1.5細胞的存活率。
表1樣品HepG2 2.2.1.5細胞存活率(％)200μg/ml100μg/ml50μg/ml1 51.4 77.480.93 75.2 77.285.14 ＜50 66.177.45 76.3 89.195.4
測定化合物的對HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg、HBeAg的抑制活性之實驗方法采用ELISA法，HBsAg、HBeAg診斷試劑盒購自上海實業(yè)科華科技生物技術公司，以拉米呋啶作為陽性對照。
HepG2 2.2.1.5細胞在24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天后，加入不同濃度的樣品液，繼續(xù)培養(yǎng)9天，每3天換液一次，用ELISA法檢測樣品對HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg、HBeAg的抑制活性。
實驗結果表明化合物對HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg具有明顯的抑制作用，而且顯著高于陽性對照品拉米呋啶；對HepG2 2.2.1.5細胞HBeAg有一定的抑制作用。表2是化合物對HBsAg和HBeAg的抑制活性。
表2樣品 對HBsAg的抑制率(％)對HBeAg的抑制率(％)200 100 50 200 100 50μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml1 /46.737.9/ 22.76.33 60.1 42.823.720.810.05.64 // 53.9// 46.85 89.2 67.747.545.2 27.5 22.63TC 29.6 35.權利要求
1.雙(5-甲?；坊?醚衍生物，其特征是具有式I、II、III、IV、V或VI的結構， 其中R1、R2、R3和R4可以是獨立的氫，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，鹵素，羧基，羧酸酯，酮基，，酰胺基或胺基等。R5可以是氫，烷基，環(huán)烷基，芳基或取代芳基，酰基等。X可以是-CH2-、-NH-、-O-等。Y可以是-CH-、-N-等。 其中R6、R7、R8和R9可以是獨立的氫，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，鹵素，羥基或胺基。R10可以是獨立的氫，芳基，取代芳基或烷基。Z可以是-NH-、-O-。
2.根據權利要求1所述雙(5-甲?；坊?醚衍生物，其特征是所述衍生物是具有下列結構式的化合物，
3.權利要求1的雙(5-甲?；坊?醚的制備方法，其特征是由下式反應獲得
4.權利要求1的雙(5-甲?；坊?醚衍生物在制備治療病毒性疾病藥物中的用途。
5.權利要求1的雙(5-甲?；坊?醚衍生物在制備治療病毒性病毒性肝炎藥物中的用途。
6.權利要求1的雙(5-甲?；坊?醚衍生物在制備治療病毒性乙型肝炎藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物合成領域，具體涉及一類新型天然雙(5－甲?；坊?醚衍生物，制備方法和在藥學上的應用。本發(fā)明雙(5－甲酰基糠基)醚由上式反應獲得。本發(fā)明天然雙(5－甲?；坊?醚衍生物通過體外抗乙型肝炎病毒藥效學研究，結果表明抑制HepG2 2.2.1.5細胞HBsAg的活性明顯超過陽性對照品拉米呋啶，體外細胞毒性試驗表明毒副作用小，本發(fā)明化合物可制備治療病毒性疾病尤其是病毒性乙型肝炎的新藥。
文檔編號C07D307/46GK1456556SQ03129068
公開日2003年11月19日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權日2003年6月3日
發(fā)明者聞韌, 余凡, 董肖椿, 繆宇平, 周佩, 林志剛, 鄭劍斌, 王浩, 黃磊, 青島均 申請人:復旦大學