專利名稱：重組人甲狀旁腺激素pth(1－34)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人甲狀旁腺激素PTH(1-34)的制備方法，特別是使用基因重組技術(shù)制備該產(chǎn)品的方法，該產(chǎn)品可用于治療骨質(zhì)疏松癥。
隨著年齡的增加，骨的再吸收活動超過骨形成活動，造成骨質(zhì)流失，骨密度逐漸減小，是骨骼呈現(xiàn)中空疏松、脆弱易骨折等現(xiàn)象，稱為骨質(zhì)疏松癥。骨質(zhì)疏松癥的患者，容易在臀部、手腕、脊椎骨等處發(fā)生骨折。老年人特別是停經(jīng)后的婦女，容易出現(xiàn)該癥狀。另一方面，老年人尤其是停經(jīng)后的婦女由于雌激素的減少和腸道對鈣吸收能力下降，致使骨骼中的礦物質(zhì)減少而成為骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物包括鈣制劑、VD、生長激素、氟化物、二磷酸鹽、降鈣素、雌激素及其衍生物等，主要著眼于鈣的代謝，通過抑制破骨細胞的活性，減緩骨質(zhì)的分解而減少骨質(zhì)的流失，達到緩解骨質(zhì)疏松癥的目的。
甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是調(diào)節(jié)骨細胞新陳代謝的重要因子，既可刺激破骨細胞的增殖及其對老化骨質(zhì)的分解，又具有促進成骨細胞合成新骨的作用。甲狀旁腺激素可以激活成骨細胞的活性，分解吸收老化骨質(zhì)，增加骨質(zhì)量及骨質(zhì)密度。此外，甲狀旁腺激素可以促進腎小管細胞對鈣磷的再吸收，增加血鈣、血磷的含量；激活腎臟產(chǎn)生羥化酶，后者使25-羥維生素D3轉(zhuǎn)化為1，25-二羥基維生素D3，從而促進小腸上皮細胞對鈣離子的吸收，為成骨細胞合成新骨提供物質(zhì)保障。因此，甲狀旁腺激素可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的理想藥物。
PTH由甲狀旁腺主細胞分泌，最初合成產(chǎn)物是115個氨基酸的前甲狀旁腺激素原，在分泌過程中，切掉N端31個氨基酸，形成成熟PTH(1-84)1.Potts J TJr，et al Adv.Protein Chem.1982 35323-396，2.Habener J F，et alJ.Biol.Chem.1976 25113893-3899，3.Kronenberg H M，et al PNAS 1979764981-4985。當其進入血液后，很快代謝為N-端1-34氨基酸片段(PTH(1-34))，PTH(1-34)與腎、骨組織中的特異性受體結(jié)合從而啟動信號傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮生物學作用6.Tregear G W，et al Greene E.Endocrinology 1973 931349，7.Potts JT Jr，et al PNAS 1971 6863-67，8.Martz A Thomas M L.Biochem.Pharmcol.1983 323429-3433。。研究發(fā)現(xiàn)PTH(1-84)N-端1-34個小肽PTH(1-34)具有完全的天然甲狀旁腺激素的生理活性，而且在較低或中等劑量的濃度下，長時間作用于骨，會刺激骨的形成，并通過誘導(dǎo)骨中的合成作用而有效治療骨質(zhì)疏松癥4.Reeve J，et al.Br.Med.J.1980 2801340-1344。由于PTH(1-34)不含半胱氨酸，在體內(nèi)很不穩(wěn)定，且含量很低，從天然組織中分離提取幾乎不可能。因此，為使hPTH(1-34)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，必須找到一種可靠的可以獲得大量產(chǎn)品的方法。化學合成的成本和風險性太高，不適合大量生產(chǎn)PTH(1-34)。隨著基因工程重組技術(shù)的發(fā)展，人們可利用該技術(shù)來生產(chǎn)重組甲狀旁腺激素，但產(chǎn)率等不盡如人意10.Nakagawa，S.，et al 1994. Biochem.Biophys.Res.Commun.2001735-1741。Yuji Suzuki等9.Applied Environ.Microbiol.1998，(2)562-569報道了高產(chǎn)率的獲得PTH(1-34)的方法。該報道是以大腸桿菌表達融合蛋白，通過培養(yǎng)、純化獲得重組人PTH(1-34)。他們采用pBR332為表達載體，Top10為宿主菌；采用腸激酶進行酶切以去除融合蛋白，獲得具有天然結(jié)構(gòu)的重組PTH(1-34)。但腸激酶價格昂貴，使得該工藝的成本高昂，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明通過構(gòu)建新的表達載體，不僅成功解決了純化工藝導(dǎo)致的高成本、工藝復(fù)雜性等問題，也獲得了高表達量、高純度的產(chǎn)品，從而使得PTH(1-34)通過基因工程技術(shù)獲得大規(guī)模的生產(chǎn)成為可能。
本發(fā)明的另一個目的是提供使用該菌株制備PTH(1-34)的方法。
本發(fā)明所提供的甲狀旁腺激素PTH(1-34)分子量為4100道爾頓。其氨基酸序列見序列表序列1的1-34個氨基酸序列。
本發(fā)明的甲狀旁腺激素PTH(1-34)的制備方法包括以下步驟(1)合成相應(yīng)的cDNA片段(2)將所述的cDNA在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(3)分離純化菌體中的PTH(1-34)本發(fā)明通過以下步驟制備PTH(1-34)構(gòu)建一個PTH(1-34)與融合蛋白的基因工程表達載體；克隆獲得工程菌后，經(jīng)發(fā)酵、收集菌體、破壁提取包涵體、包涵體溶解并后續(xù)純化，制得本產(chǎn)品。
本發(fā)明先以人工合成DNA的方法，得到PTH(1-34)與融合蛋白的cDNA，應(yīng)用基因重組技術(shù)，把此片段導(dǎo)入大腸桿菌細胞，經(jīng)培養(yǎng)并誘導(dǎo)，獲得以包涵體形式存在的，分子量約為18千道爾頓的融合蛋白，其表達量在20％以上；離心收集菌體、破壁提取包涵體，經(jīng)包涵體溶解，復(fù)性，凝血酶酶切后，進一步純化，得到PTH(1-34)，其純度大于95％。獲得的目的蛋白經(jīng)氨基酸序列分析，其N-端15個氨基酸為SVSEIQLMHNLGKHL，C-末端的氨基酸為HNF。經(jīng)質(zhì)譜分析，其分子量約為4100道爾頓。與天然的甲狀旁腺素具有相同的生物活性，重組人甲狀旁腺素(1-34)的生物比活性大于8000單位/mg。發(fā)明的詳細描述1.序列設(shè)計采用如下DNA序列(見序列表序列2)catgatttacgaattcEcoR Ictg gtt ccg cgt tct gta tct gaa atc caa ctg atg cac aac ctg ggt aaa cac ctg aac tctLeuValProArgSerValSerGluIleGlnLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSeratg gaa cgt gta gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag gat gta cac aac ttc taagtcgacctgcagMetGlu ArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGlnGluValHisAsnPhe Stop Sal I該序列具有如下特征(1)采用大腸桿菌簡并密碼子修改序列的對應(yīng)cDNA，避免序列中堿基的過多重復(fù)，以保證序列的穩(wěn)定性和翻譯效率。(2)基本序列為L-V-P-R-PTH(1-34)，其中L-V-P-R為凝血酶的酶切位點。(3)在其核苷酸序列末端加大腸桿菌終止密碼子TAA；(4)為便于克隆，在序列的5’-端加EcoR I的酶切位點，3’-端加Sal I的酶切位點。2.基因合成上述核苷酸序列采用化學合成方法制備。該序列克隆于載體PUC18，經(jīng)DNA測序，與設(shè)計一致。3.表達菌株的構(gòu)建1)選用pThio-HisA為表達載體，其特征為質(zhì)粒復(fù)制子為E.coli的coli E I。選擇抗性標記為Ampr，轉(zhuǎn)錄啟動子為大腸桿菌雜合啟動子trc，轉(zhuǎn)錄終止子為aspA基因的終止序列，插入位點EcoR I-Sal I。2)以EcoR I-Sal I從PUC-18質(zhì)粒中切出基因片段，用1％Agarose膠分離，純化備用。酶切條件10*Buffer5μl、DNA30μl、EcoR I 1μl、Sal I 1μl、水13μl，37℃水浴2小時。3)用EcoR I-Sal I酶切pThio His A載體，用CAP處理，純化備用。酶切條件10*Buffer5μl、DNA30μl、EcoR I 1μl、Sal I 1μl、水13μl，37℃水浴2小時。4)將步驟2)中小片段克隆至步驟3)所得的大片段，載體片段與目的片段按1∶3的比例混合，用T4連接酶16℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒。5)將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，并涂布在含100ug/ml Amp的LB平板，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和DNA測序，表達檢測篩選最優(yōu)工程菌。方法如下轉(zhuǎn)化(1)感受態(tài)的制備①將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16～20小時。②從平板中取出1個2-3mm大小的單菌落，移至含100mlLB的培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，37℃220rpm強烈振蕩培養(yǎng)3小時，使細胞的濃度達到5×107個細胞/ml，此時，細菌的OD600一般在0.2-0.4之間，為對數(shù)生長期。③將培養(yǎng)物于冰上放置10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到兩個50ml離心管中，4000r/min，4℃離心10分鐘。④棄上清，倒置離心管1分鐘，流盡剩余液體，然后加入10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L Cacl2致敏液懸浮細胞，置于冰上10分鐘。⑤4000r/min，4℃離心10分鐘回收細胞，棄上清，每50ml的原培養(yǎng)物再加入2ml冰冷的油，置于-70℃凍貯。(2)轉(zhuǎn)化①加10μl含40ng的DNA溶液至200μl感受態(tài)細胞中，溫和混勻，置于冰上30分鐘。②42℃熱休克90秒，迅速放入冰中，將細胞冷卻1-2分鐘后，加入800μl LB培養(yǎng)基，37℃225r/min，搖蕩培養(yǎng)細菌45分鐘，讓細菌中的質(zhì)粒表達抗生素抗性蛋白。③取200μl轉(zhuǎn)化混合物鋪布于90mm的LB瓊脂平板上，室溫下放置30分鐘，待溶液被瓊脂完全吸收后，倒置平皿于37℃培養(yǎng)過夜。陽性克隆的篩選(1)質(zhì)粒的酶切鑒定質(zhì)粒提取，質(zhì)粒用EcoR I和Sal I雙酶切，用1％agarost電泳在120bp處有一條特征帶，酶切電泳圖譜如下(2)表達實驗①從平板上挑取單菌落(選擇大而飽滿)，接種于裝有5mlLB培養(yǎng)液的中管。②每支中管加5μl50mg/ml的卡那，37℃260轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)(分別編號1.2.…)。③在OD600在0.6左右時開始誘導(dǎo)。從每支中管中取100μl到另一無菌的LB中管，分別對應(yīng)編號1’2’.…做原始菌種在原來1 2.…中按其所剩體積，加入5mM的IPTG誘導(dǎo)劑，37℃220轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)。④誘導(dǎo)4小時后，12％分離膠跑SDS-PAGE電泳檢測表達情況，篩選工程菌，取約1.5ml離心，12000轉(zhuǎn)/分2分鐘。⑤上清到掉，加50μl dd水+50μl電泳上樣buffer。⑥沸水煮4分鐘，上樣20μl/樣，電泳180伏/小時，50分鐘。⑦考馬斯染色，搖床30分鐘；脫色，搖床1小時，觀察結(jié)果。6)工程菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)并加IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測，所得的工程菌包涵體表達一種分子量為18千道爾頓的蛋白質(zhì)，表達量為20％左右。4.PTH的獲得工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體，破菌，提取包涵體。以1倍體積50mM Tris(pH8.0)、150mMNaCl的緩沖液并加緩慢加入固體脲至6M溶解包涵體，離心除去不溶物后，加入50mM Tris(pH8.0)、150mMNaCl使脲的濃度降為1M，過夜復(fù)性。離心除去雜蛋白沉淀后，加5mg/U的凝血酶酶切。反應(yīng)液過Q-sepharose FF柱，洗滌，收集流出液，用乙酸調(diào)pH值至3左右，除去雜蛋白。離心除去雜蛋白后的上清液過Source 15RPC柱，經(jīng)洗脫后，目的蛋白峰再過SP-Sepharose FF柱，洗脫，取樣進行分析。經(jīng)SDS-PAGE和RP-HPLC檢測，純度大于99％。
序列表<110>西南生物工程產(chǎn)業(yè)化中試基地有限公司<120>重組人甲狀旁腺激素PTH(1-34)的制備方法<160>2<210>1<211>38<212>PRT<213>人(huamn)<400>Leu Val Pro Arg Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu1 5 10 15Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Glu Val His Asn Phe20 25 30<210>2<211>145<212>DNA<213>人(human)<400>catgatttacgaattcctgg ttccgcgttc tgtatctgaa atccaactga 50tgcacaacct gggtaaacac ctgaactcta tggaacgtgt agaatggctg 100cgtaaaaaac tgcaggatgt acacaacttc taagtcgacc tgcag 145<210>3<211>145<212>DNA<213>人(human)<400>catgatttacgaattc ctg gtt ccg cgt tct gta tct gaa atc caa ctg atg 52Leu Val Pro Arg Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Metcac aac ctg ggt aaa cac ctg aac tct atg gaa cgt gta gaa 94His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val GluTgg ctg Cgt aaa aaa ctg cag gat gta cac aac ttc taa 133Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Glu Val His Asn PheGtcgacctgcag 14權(quán)利要求
1.一種重組人甲狀旁腺激素類似物，其氨基酸序列見序列表中序列1。
2.編碼權(quán)利要求1的甲狀旁腺激素類似物的DNA序列，見序列表中序列2。
3.一種用于制備權(quán)利要求1的人甲狀旁腺激素類似物的工程菌株pThi-PTH/BL21，保藏號為CGMCC NO.0732。
4.一種制備重組人甲狀旁腺激素(1-34)的方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)權(quán)利要求3所述菌株；(2)從培養(yǎng)物中提取粗制權(quán)利要求1的人甲狀旁腺激素類似物；(3)酶切上步的人甲狀旁腺激素類似物制成人甲狀旁腺激素(1-34)；(4)純化上步所得人甲狀旁腺激素(1-34)。
5.權(quán)利要求4的制備方法，其中培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基中含有酵母膏、蛋白胨、NaCl。
6.權(quán)利要求4的制備方法，其中步驟2從培養(yǎng)物中提取粗制人甲狀旁腺激素的方法包括離心收集菌體、用裂解液懸浮菌體、超聲破菌、稀釋離心、收集包涵體產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求4的制備方法，其中步驟3和4包括稀釋復(fù)性、凝血酶酶切、陰離子交換層析、反相層析、陽離子交換層析。
8.權(quán)利要求3的工程菌株的構(gòu)建方法。包括如下步驟①采用權(quán)利要求2的cDNA；②用pThioHis為表達載體；③構(gòu)建重組質(zhì)粒；④轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中cDNA序列編碼的氨基酸序列中LVPR為凝血酶酶切位點。在其核苷酸序列未端加大腸桿菌終止密碼子TAA，在序列5`-端加EcoR I的酶切位點，3`端加Sal I酶切位點。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟②的表達載體的特征是啟動子為大腸桿菌雜合啟動子trc、轉(zhuǎn)錄終止子為asp基因的終止序列，插入位點為EcoRI-Sal I，步驟③的重組質(zhì)粒構(gòu)建方法包括將cDNA序列用EcoR I和SalI雙酶切，插入經(jīng)相同的兩種酶酶切后的PUC-18質(zhì)粒中，再將該片段亞克隆至表達載體pThioHis中，步驟④所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株為BL21。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人甲狀旁腺激素PTH(1－34)的制備方法，該方法通過構(gòu)建了一種新的工程菌株，使表達產(chǎn)量提高，純化工藝簡單，成本降低。本發(fā)明采用大腸桿菌簡并密碼子修改序列的對應(yīng)cDNA，基本序列為L－V－P－R－PTH(1－34)，其中L－V－P－R為凝血酶的酶切位點。在其核苷酸序列末端加大腸桿菌終止密碼子TAA；為便于克隆，在序列的5’－端加EcoR I的酶切位點，3’－端加Sal I的酶切位點。通過對該工程菌的發(fā)酵、包涵體提取、稀釋復(fù)性、凝血酶酶切、陰離子交換層析、反相層析、陽離子交換層析等步驟得到高純度的重組人甲狀旁腺激素PTH(1－34)。
文檔編號C07K14/635GK1417231SQ0215338
公開日2003年5月14日 申請日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者胡昌華, 李明, 何建軍, 徐輝 申請人:西南生物工程產(chǎn)業(yè)化中試基地有限公司