專利名稱：從地龍?bào)w內(nèi)提取超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從生物體內(nèi)提取超氧化物歧化酶的工藝制備方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SuperOxide dismutase，簡稱SOD)屬金屬酶，是主要的氧自由基清除劑，它能專一清除人體內(nèi)的超氧陰離子 。作為有重大醫(yī)療價(jià)值的藥用酶和工具酶，在國內(nèi)外生化界和醫(yī)藥界引起極大關(guān)注。目前SOD廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、某些自身免疫性疾病，對(duì)腫瘤的發(fā)生、組織的老化、血液栓塞、血液氧以及其他物質(zhì)中毒等病癥都有一定的療效。
目前國內(nèi)開發(fā)SOD資源有牛血、豬血和刺梨等，以這些物質(zhì)為原料，消耗的資源很大，通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)以地龍(俗稱蚯蚓)為資源提取SOD的方法。

發(fā)明內(nèi)容
(1)發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種從地龍的體內(nèi)提取超氧化物歧化酶的方法，以解決消耗資源大等方面存在的問題。
(2)技術(shù)方案1、從地龍?bào)w內(nèi)提取超氧化物歧化酶的方法，其步驟如下a、將活蚯蚓洗凈，置于新鮮水中或含不超過0.3％(以重量計(jì))的有機(jī)酸鈉鹽中清洗，直至其消化道內(nèi)的污物被徹底清除，然后在除去其表面軀體上的所有污物；b、將活蚯蚓濕磨，得到的蚓汁在-60℃～-10℃的溫度下冷凍后儲(chǔ)存；c、新鮮的蚓汁或其冷凍物在PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液中勻漿2L/kg，攪拌1～2小時(shí)，15000r/min離心30分鐘，棄沉淀物得清夜；d、上述清夜于65℃加熱10～20分鐘，冷卻至4℃，過濾后濾液中加入1.25倍體積的丙酮，收集沉淀，沉淀物用少量的PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液溶解，棄沉淀物得上清液；e、上清液在攪拌下加入內(nèi)含10molmg、10molCu、10molZn，飽和度達(dá)45％，繼續(xù)攪拌15分鐘，然后在2000r/min離心30分鐘，棄去沉淀，向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨溶液，使其飽和度達(dá)65％，離心收集沉淀；f、將上述沉淀溶解在PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液中，接著透析至無SO2-4，透析液最后上DEAE-Sephadex A-50層析柱(柱床體積為2.5×50cm)，收集洗脫液，濃縮、冷卻、干燥，即得藍(lán)綠色的Cu、ZnSOD。
(3)、優(yōu)點(diǎn)及效果利用地龍?zhí)崛〕趸锲缁?SOD)，其主要優(yōu)點(diǎn)在于原料易取，成本低廉，不與其他行業(yè)爭原料，它比用豬、牛血等提取要節(jié)約5～6倍，且提取SOD成分與同量比要高2～3倍。
具體實(shí)施例方式1、從地龍?bào)w內(nèi)提取超氧化物歧化酶的方法，其步驟如下a、將活蚯蚓洗凈，置于新鮮水中或含不超過0.3％(以重量計(jì))的有機(jī)酸鈉鹽中清洗，直至其消化道內(nèi)的污物被徹底清除，然后在除去其表面軀體上的所有污物；b、將活蚯蚓濕磨，得到的蚓汁在-30℃的溫度下冷凍后儲(chǔ)存；c、新鮮的蚓汁或其冷凍物在PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液中勻漿2L/kg，攪拌1小時(shí)，15000r/min離心30分鐘，棄沉淀物得清夜；d、上述清夜于65℃加熱20分鐘，冷卻至4℃，過濾后濾液中加入1.25倍體積的丙酮，收集沉淀，沉淀物用少量的PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液溶解，棄沉淀物得上清液；e、上清液在攪拌下加入內(nèi)含10molmg、10molCu、10molZn，飽和度達(dá)45％，繼續(xù)攪拌15分鐘，然后在2000r/min離心30分鐘，棄去沉淀，向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨溶液，使其飽和度達(dá)65％，離心收集沉淀；f、將上述沉淀溶解在PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液中，接著透析至無SO2-4，透析液最后上DEAE-Sephadex A-50層析柱(柱床體積為2.5×50cm)，收集洗脫液，濃縮、冷卻、干燥，即得藍(lán)綠色的Cu、ZnSOD。
本發(fā)明中SOD的活性測定方法是采用苯三酚或腎上腺素法。
本發(fā)明中SOD的含量測定方法是利用彩色免疫板測定Cu、ZnSOD含量，或采用放射免疫法和核素標(biāo)記法。
地龍主要棲息在5℃～25℃的土壤里，其飼料是腐爛的有機(jī)物質(zhì)，飼養(yǎng)周期短、成熟快，繁殖率高，是處理生活垃圾的能手。
地龍?bào)w內(nèi)含有十八種氨基酸和三十多種藥用酶，有其重大的醫(yī)療價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種從地龍?bào)w內(nèi)提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于該方法的制備步驟如下a、將活蚯蚓洗凈，置于新鮮水中或含不超過0.3％(以重量計(jì))的有機(jī)酸鈉鹽中清洗，直至其消化道內(nèi)的污物被徹底清除，然后在除去其表面軀體上的所有污物；b、將活蚯蚓濕磨，得到的蚓汁在-60℃～-10℃的溫度下冷凍后儲(chǔ)存；c、新鮮的蚓汁或其冷凍物在PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液中勻漿2L/kg，攪拌1～2小時(shí)，15000r/min離心30分鐘，棄沉淀物得清夜；d、上述清夜于65℃加熱10～20分鐘，冷卻至4℃，過濾后濾液中加入1.25倍體積的丙酮，收集沉淀，沉淀物用少量的PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液溶解，棄沉淀物得上清液；e、上清液在攪拌下加入內(nèi)含10molmg、10molCu、10molZn，飽和度達(dá)45％，繼續(xù)攪拌15分鐘，然后在2000r/min離心30分鐘，棄去沉淀，向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨溶液，使其飽和度達(dá)65％，離心收集沉淀；f、將上述沉淀溶解在PH值7.6、25mmol/LTris-Gly緩沖液中，接著透析至無SO2-4透析液最后上DEAE-Sephadex A-50層析柱(柱床體積為2.5×50cm)，收集洗脫液，濃縮、冷卻、干燥，即得藍(lán)綠色的Cu、ZnSOD。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從生物體內(nèi)提取超氧化物歧化酶的工藝制備方法。該方法的制備步驟為將活蚯蚓洗凈，濕磨，得到的蚓汁經(jīng)過冷凍、在緩沖液中勻漿、攪拌，離心，棄沉淀物得清液；上述清液進(jìn)行加熱，冷卻，過濾后濾液中加入丙酮，沉淀物用緩沖液溶解，棄沉淀物得上清液；上清液在攪拌下加入mg、Cu、Zn，然后離心，棄去沉淀，向上清液中加入硫酸銨溶液，離心收集沉淀；將上述沉淀溶解在緩沖液中，接著透析至無SO
文檔編號(hào)C07K1/00GK1453355SQ0210952
公開日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2002年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月23日
發(fā)明者劉玉才, 劉晟至 申請(qǐng)人:劉玉才