專利名稱：新的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以肽中的氨基酸被修飾為特征的，具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度作用或生長激素分泌誘導(dǎo)活性的新的肽。另外，本發(fā)明還涉及該新肽的獲取方法和制造方法，編碼該肽和該肽前體的遺傳因子，以及使用該遺傳因子的該肽和該肽前體的制造方法。進(jìn)一步，涉及本發(fā)明公開的新修飾肽的結(jié)構(gòu)類似物，具有與生長激素誘導(dǎo)化合物的受體結(jié)合提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用或生長激素分泌誘導(dǎo)活性的肽類似物及其制備方法。本發(fā)明還涉及含有該肽或該肽類似物作為有效成分的藥物組成物，動(dòng)物生長促進(jìn)劑，或該肽的抗體或其利用方法。
自從人GH可通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)以來，GH不僅用于上述侏儒的治療[J.O.Jorgensen，Endocr.Rev.12，189(1991)]，在其它疾病的治療中也被使用，并可看到各種效果[J.O.Jorgensen，et al.，Horm.Res.42，235(1994)]。例如，具有在正常人中活性成骨細(xì)胞和骨的再構(gòu)成[K.Brixen，et al.，Miner.Res.5，609(1990)]，在GH缺乏癥成人中增強(qiáng)肌肉量和肌肉力量[R.C.Cuneo，et al.，J.Appl.Physiol.70，688(1991)]，提高GH缺乏癥成人的運(yùn)動(dòng)能力[R.C.Cuneo，et al.，J.Appl.Physiol.70，695(1991)]，治療小兒重度燒傷[D.N.Herndon，et al.，Ann.Surg.212，424(1990)]、在誘發(fā)排卵中與促性腺激素并用[R.Homburg，et al.，Clin.Endocrinol.(Oxf).32，781(1990)]，預(yù)防強(qiáng)的松給藥引起的蛋白質(zhì)代謝異常[F.F.Horber and M.W.Haymond，J.Clin.Invest.86，265(1990)]，促進(jìn)重度免疫缺損癥中的T細(xì)胞“教育”[W.J.Murphy，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，4481(1992)]，抑制老年性體重減少，脂肪組織擴(kuò)大和皮膚萎縮的效果[D.Rudman，et al，N.Engl.J.Med.323，1(1990)]等。
在促進(jìn)小兒生長，以及使缺乏GH的成人中伴隨的代謝或功能缺損正常化中，使用重組GH給藥是有效的，但是存在限定用量的副作用，以及不能口服和費(fèi)用方面的問題[B.A.Lefker，et al.，in GrowthHormon Secretagogues in Clinical Practoce，B.B.Bercu and R.F.Walker，Eds.(Marcel Dekker，Inc.，New York，1998)，p.107-p.108]。很多成人患者，由于過剩的鈉和體液貯留引起的關(guān)節(jié)痛或手根管綜合征等副作用，不能繼續(xù)GH給藥[E. Corpas，et al.，Endocr.Rev.14，20(1993)]。這些副作用與GH給藥引起的非生理方式的激素分泌相關(guān)，用GH給藥不能模仿正常GH分泌的脈動(dòng)性[(pulsatility)][B.A.Lefker，et al.，in Growth Hormon Secretagogues in Clinical Practoce，B.B.Bercu and R.F.Walker，Eds.(Marcel Dekker，Inc.，New York，1998)，p.107-p.108]。
生物體內(nèi)GH分泌的脈動(dòng)性，一般通過下丘腦由來的2種控制因子相互作用來確立的，即，GHRH與生長抑素對(duì)下垂體的作用，控制GH的分泌[G.S.Tannenbaum and N.Ling，Endocrinology 115，1952(1984)，R.G.Clark and I.C.Robinson，Endocrinology 122，2675(1988)]。正常的GH分泌形式是晝夜不同，在夜間更頻繁地釋放出更多的GH。GH釋放的脈沖振幅，通過各種甾類激素、神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)、GH和胰島素樣生長因子引起的反饋，營養(yǎng)狀態(tài)，睡眠和運(yùn)動(dòng)進(jìn)一步被調(diào)節(jié)[J.S.Strobl and M.J.Thomas，Pharmacol.Rev.46，1(1994)]。
為克服上述GH給藥中伴隨的副作用，合成了大量具有GH分泌誘導(dǎo)活性的化合物，作為GH分泌誘導(dǎo)物質(zhì)(GHS；growth hormonesecretagogue)，集中精力研究了其構(gòu)效關(guān)系、藥理學(xué)、臨床應(yīng)用等。首先，合成了GHRP-6(Growth Hormone-Releasing hexapeptide)等肽，作為GH欠缺至低下引起的疾病的治療藥被開發(fā)[C.Y.Bowers，etal.，Endocrinology 114，1537-1545(1984)]。但是，這些肽化合物只有靜脈注射才能發(fā)揮效果，因此開發(fā)了可口服給藥的低分子量非肽類化合物[R.G.Smith，et al.，Science 260，1640-1643(1993)]，并進(jìn)行到第二期臨床試驗(yàn)階段[A.A.Patchett，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，7001-7005(1995)]。
在細(xì)胞中，將從受體接收信號(hào)到表達(dá)功能的一連串情報(bào)的傳導(dǎo)稱為信號(hào)傳導(dǎo)(signal transduction)，與G蛋白質(zhì)共軛的信號(hào)傳導(dǎo)按照如下的機(jī)理進(jìn)行[八杉龍一ら編，巖波生物學(xué)辭典第4版(巖波書店，東京，1997)，555-556頁]。該G蛋白質(zhì)共軛體系分為具有細(xì)胞膜7次貫通性受體的，產(chǎn)生作為第二信使的cAMP的cAMP體系和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)或二酰基甘油(DG)肌醇磷脂情報(bào)傳導(dǎo)體系。cAMP活化cAMP依賴性激酶(A激酶)，引起功能蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，修飾活性。另一方面，IP3與小胞體上的IP3受體結(jié)合，促進(jìn)鈣離子的游離，DG促進(jìn)C激酶的活化，激素等作用的表達(dá)。
在IP3或DG成為第二信使的信號(hào)傳導(dǎo)體系中，提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的機(jī)理如下所述[J.Kendrew，et al.，Eds.，The Encyclopediaof Molecular Biology(Blackwell Science Ltd.，London，1994)，p.136-137]。配位體一旦與受體結(jié)合，通過G蛋白磷脂酶C被活化，從PIP2生成IP3。IP3將貯存于作為細(xì)胞內(nèi)顆粒的ER等小胞體中的鈣離子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，提高細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度。IP3或鈣離子如果進(jìn)一步存在于細(xì)胞質(zhì)中，鈣離子再次被小胞體攝取，細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度降低。即，配位體與受體的結(jié)合，可一次性提高細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度。
GHS協(xié)同作用于GHRH引起的GH分泌和細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的提高[K.Cheng，et al.，Endocrinology 124，2791-2798(1989)]、且GHRH與受體的結(jié)合相對(duì)于作為第二信使的cAMP的產(chǎn)生，GHS使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，由此暗示GHS的作用機(jī)理與GHRH不同[J.Herrington and B.Hille，Endocrinology 135，1100-1108(1994).]，假定為GHS結(jié)合的受體不同于GHRH結(jié)合的GHRH受體。實(shí)際上，從GHS結(jié)合的受體基因克隆，Northern印跡分析的結(jié)果顯示GHS受體(GHS-R)在下丘腦和下垂體表達(dá)，且從豬和人的GHS-R的氨基酸序列顯示90％以上的同一性[A.D.Howard，et al.，Science 273，974-977(1996)]。但是，與GHS-R結(jié)合的內(nèi)在性配位體不能分離出來，該GHS-R是配位體為不明確的孤兒受體。
在蛋白質(zhì)的氨基末端或構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基側(cè)鏈中，鍵合了肉豆蔻酸、香葉基酸(ゲラニル酸)、棕櫚?；?パルミトイル酸)、或法呢基酸(フアルネシル酸)等脂肪酸，這些脂肪酸的任務(wù)是將這些脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)錨合(anchoring)到細(xì)胞膜上[J.Kendrew，etal.，Eds.，The Encyclopedia of Molecular Biology(Blackwell ScienceLtd.，London，1994)，p.616]。在這些脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)中，脂肪酸與半胱氨酸殘基通過S-酰基鍵結(jié)合，如本發(fā)明公開的內(nèi)在性GHS那樣的通過O-酰基與絲氨酸殘基結(jié)合了脂肪酸的氨基酸、含有該脂肪酸修飾的氨基酸的蛋白質(zhì)和肽是完全未知的。另外，含有脂肪酸修飾的氨基酸的肽，也不知道其作為受體的配位體的功能。
在詳細(xì)說明本發(fā)明之前，先定義以下用語。
肽是指，多個(gè)氨基酸通過肽鍵連接的化合物。這里氨基酸(或氨基酸殘基)是指，在氨基酸的通式NH2-CH(R′)-COOH中，R′是具有天然存在取代基的天然氨基酸，并包括它的D，L-光學(xué)異構(gòu)體。
天然氨基酸也會(huì)被修飾的氨基酸(或修飾的氨基酸殘基)替代。修飾的氨基酸是指，上述通式中的取代基R′進(jìn)一步被修飾的氨基酸，并包括其D，L-光學(xué)異構(gòu)體，還包括例如上述通式中的取代基R′中，通過或不通過酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、脲或硫脲等，鍵合了各種取代基的非天然氨基酸。另外，還包括氨基酸的氨基上被低級(jí)烷基取代的非天然氨基酸。
肽類似物是指，肽中至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸化合物替代的化合物，因此，該替代化合物的肽類似物中至少一個(gè)鍵不是肽鍵。
另外，將這些肽和肽類似物的氨基末端和/或羧基末端被修飾的化合物作為衍生物，將肽、肽類似物和這些衍生物總稱為肽類化合物。
在SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列中，至少從氨基末端第4至第10的氨基酸序列是如下所示序列。
Gly Ser Ser Phe、Gly Ser Ser Phe Leu、Gly Ser Ser Phe Leu Ser、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His、或、Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln。
人們需要與GHS受體結(jié)合提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，或具有誘導(dǎo)GH分泌活性的內(nèi)在性配位體，即內(nèi)在性GHS表達(dá)和利用方法。另外，還需要在該內(nèi)在性GHS的結(jié)構(gòu)類似物中，可提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度或具有GH分泌誘導(dǎo)活性的化合物。另外，還需要含有該內(nèi)在性GHS或其結(jié)構(gòu)類似化合物，可通過誘導(dǎo)GH脈動(dòng)分泌，無GH給藥副作用的藥物組合物或促進(jìn)動(dòng)物生長的組合物，以及使用該組合物的治療方法。
本發(fā)明的發(fā)明者，著眼于配位體與GHS受體(GHS-R)結(jié)合可以將肌醇磷脂作為第二信使一次性提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，將表達(dá)GHS-R的CHO細(xì)胞(CHO-GHSR62)中提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性(Ca提高活性)作為指標(biāo)，篩選各種臟器或組織萃取物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠胃萃取物具有強(qiáng)的Ca提高活性，從該萃取物用各種色譜純化得到具有Ca提高活性的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)是脂肪酸修飾的分子量約3,000的新的肽。另外，確認(rèn)該新肽可促進(jìn)垂體前葉細(xì)胞的GH特異性分泌，發(fā)現(xiàn)該新肽是GHS-R的內(nèi)在性配位體，即內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)物質(zhì)(內(nèi)在性GHS)。即，本申請(qǐng)的第1項(xiàng)發(fā)明是，內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽，和該肽的獲取方法，其特征在于具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性或GH分泌誘導(dǎo)活性，且構(gòu)成氨基酸殘基被脂肪酸修飾。
本發(fā)明者對(duì)該內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)地解析，發(fā)現(xiàn)該肽是SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列形成的肽，氨基末端第3位的絲氨酸側(cè)鏈的羥基被脂肪酸酰化。另外，與大鼠相同，從存在強(qiáng)Ca提高活性的人胃萃取物中，可用大鼠的GH分泌誘導(dǎo)肽同樣的方法純化并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽可從SEQID NO.3記載的氨基酸序列形成，氨基末端第3位的絲氨酸側(cè)鏈的羥基也被脂肪酸?；⒋笫蠛腿说膬?nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的氨基酸序列進(jìn)行比較的話，總體上顯示89％的高同一性。
更詳細(xì)地說，在大鼠和人中，從氨基末端到第10氨基酸序列和第13～28氨基酸序列相同，但是第11和12氨基酸不同，在大鼠中是賴氨酸、丙氨酸，在人中分別是精氨酸、纈氨酸替代。將大鼠的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽用各種蛋白酶切斷，測(cè)定純化的肽片段的Ca提高活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從氨基末端到第7氨基酸序列形成的肽是具有Ca提高活性的最小的肽。
另外，從測(cè)定化學(xué)合成肽的Ca提高活性等可知，表達(dá)Ca提高活性必須的核心序列是SEQ ID NO.8記載的4個(gè)氨基酸形成的序列。另外，從大鼠以外的人、豬、牛分離的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽(28個(gè)氨基酸)和從這些肽中缺失一個(gè)谷氨酰胺的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽(27個(gè)氨基酸)中的任何一個(gè)，都保存了SEQ ID NO.9記載的10個(gè)氨基酸形成的序列。
即，本申請(qǐng)的第2項(xiàng)發(fā)明是，含有SEQ ID NO.8記載的氨基酸序列，優(yōu)選是SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列，更優(yōu)選是SEQ ID NO.9記載的氨基酸序列作為表達(dá)Ca提高活性必須的核心序列的脂肪酸修飾的肽。
另外，從雞、鱔魚、青蛙也分離出內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽，可知其具有SEQ ID NO.8記載的4個(gè)氨基酸形成的核心序列。
另一方面，從青蛙也分離出與大鼠的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽類似性非常高的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽。
另外，從爪蟾屬、鮭屬、狗也分離出了內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽。另外，從鮭屬分離出23個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-23和20個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-20。
另外，鱔魚的Ghrelin、鮭屬的Ghrelin-23和Ghrelin-20的羧基末端的氨基酸被酰胺化。
另外，由于爪蟾屬的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽是從氨基末端的第3個(gè)氨基酸殘基是蘇氨酸，因此本發(fā)明也涉及含有SEQ ID NO.8記載的氨基酸序列，優(yōu)選是SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列，更優(yōu)選是SEQ ID NO.9記載的氨基酸序列的氨基末端第3個(gè)氨基酸殘基絲氨酸轉(zhuǎn)化為蘇氨酸的肽，作為表達(dá)Ca提高活性必須的核心序列的脂肪酸修飾的肽。
本發(fā)明公開的具有GH分泌誘導(dǎo)活性的內(nèi)在性脂肪酸修飾肽或由上述核心序列形成的脂肪酸修飾的肽，也提供了具有Ca提高活性化合物的設(shè)計(jì)指導(dǎo)。
即，本申請(qǐng)的第3項(xiàng)發(fā)明是，通過合成與該脂肪酸修飾肽結(jié)構(gòu)類似的化合物，確認(rèn)該結(jié)構(gòu)類似化合物具有Ca提高活性，可得到具有Ca提高活性的新化合物。因此，在具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的肽或肽類似物中，構(gòu)成氨基酸為被修飾氨基酸或非氨基酸化合物替代的化合物當(dāng)然也屬于本發(fā)明。
編碼內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的cDNA，可用常規(guī)方法獲得。如SEQID NO.4和5記載的氨基酸序列所示，大鼠和人的cDNA都是由117個(gè)氨基酸形成的，氨基末端的第24至第51的28個(gè)氨基酸序列分別與大鼠和人的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的氨基酸序列一致。即，可知內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽是作為117個(gè)氨基酸形成的前體肽被合成的，氨基末端的23個(gè)氨基酸形成的信號(hào)肽被切斷，且羧基末端的56個(gè)氨基酸被切除，可生成具有GH分泌誘導(dǎo)活性的脂肪酸修飾肽。另外，從豬也發(fā)現(xiàn)了編碼28個(gè)氨基酸形成的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽前體的cDNA。
而且，從豬也發(fā)現(xiàn)了編碼27個(gè)氨基酸形成的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽前體的cDNA。
從牛也發(fā)現(xiàn)了編碼27個(gè)氨基酸形成的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽前體的cDNA的一部分。
另外，從鱔魚、爪蟾屬、鮭屬也發(fā)現(xiàn)了編碼內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽前體的cDNA。另外，從鮭屬分離出編碼23個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-23前體的cDNA和編碼20個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-20前體的cDNA。
因此，本申請(qǐng)的第4項(xiàng)發(fā)明是編碼內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽前體的cDNA，以及使用該cDNA，制造作為具有Ca提高活性的脂肪酸修飾肽或肽類似物原料的肽的方法。
純化從大鼠胃萃取物得到的28個(gè)氨基酸構(gòu)成的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽(Ghrelin)時(shí)，解析作為次要組分回收的肽時(shí)，發(fā)現(xiàn)了在第13或14位缺失一個(gè)谷氨酰胺的27個(gè)氨基酸形成的肽(Ghrelin-27)。Ghrelin-27具有與28個(gè)氨基酸形成的Ghrelin完全相同的Ca提高活性和GH分泌誘導(dǎo)活性，由于是內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽，因此該Ghrelin-27也包括在本發(fā)明內(nèi)。
編碼Ghrelin的第13和14位的谷氨酰胺的堿基序列是gca gca，它是引起mRNA剪接(splicing)的外顯子末端的序列，通過引起不同的剪接，有可能生成2個(gè)谷氨酰胺密碼子中脫落一個(gè)的cDNA。實(shí)際上，研究大鼠和人的cDNA庫時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了編碼27個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-27前體肽的cDNA。
即，可知，大鼠和人的Ghrelin-27肽是作為SEQ ID NO.12或13記載的116個(gè)氨基酸形成的前體肽被合成的，氨基末端的23個(gè)氨基酸形成的信號(hào)肽被切斷，且羧基末端的56個(gè)氨基酸被切除，可生成27個(gè)氨基酸形成的具有GH分泌誘導(dǎo)活性的脂肪酸修飾肽。
另外，從豬和牛也發(fā)現(xiàn)了編碼Ghrelin-27肽前體的cDNA，在這些動(dòng)物中也確認(rèn)了Ghrelin-27和其前體的存在。
即，SEQ ID NO.10，11，17和22記載的氨基酸序列形成的Ghrelin-27肽、和具有SEQ ID NO.12、13、19和23記載的氨基酸序列的Ghrelin-27前體肽，以及具有SEQ ID NO.14、15、21和24記載的堿基序列的編碼該前體肽的cDNA當(dāng)然也屬于本發(fā)明。
本發(fā)明公開的具有Ca提高活性的脂肪酸修飾肽或具有Ca提高活性的肽類似物等肽類化合物，也可提供為治療GH欠缺或低下引起的疾病的藥物組合物。該藥物組合物可用于全部GH給藥有效的疾病，且可克服GH給藥產(chǎn)生的各種副作用。另外，該藥物組合物也可作為動(dòng)物生長促進(jìn)劑等動(dòng)物用藥劑使用。
由于本發(fā)明的肽類化合物，可通過腦室內(nèi)給藥和靜脈給藥增進(jìn)食欲，因此可作為治療食欲不振或絕食癥的食欲增進(jìn)劑使用。另外，由于具有促進(jìn)運(yùn)動(dòng)和胃酸分泌的作用，因此可作為非潰瘍性消化不良，突發(fā)性輕型胃張力弛緩，功能性消化不良和逆流性食道炎等胃功能性疾病治療劑使用。另外，由于通過靜脈給藥在骨髓、十二指腸和空腸中，確認(rèn)具有細(xì)胞增殖促進(jìn)作用，因此可作為腸道粘膜保護(hù)劑，經(jīng)靜脈營養(yǎng)時(shí)的小腸粘膜障礙預(yù)防劑和骨質(zhì)疏松癥治療劑使用。
將本發(fā)明公開的具有Ca提高活性的脂肪酸修飾肽，作為抗原制備的抗體，使用該抗體測(cè)定內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的方法，以及具備該抗體的測(cè)定試劑盒也屬于本發(fā)明。
另外，將相對(duì)于Ghrelin氨基末端和羧基末端的肽，制作抗體，前者可利用對(duì)修飾第3位絲氨酸的脂肪酸的特異性識(shí)別，可分別定量脂肪酸修飾的Ghrelin和脫除脂肪酸的Ghrelin的測(cè)定方法，以及組合了相對(duì)于Ghrelin氨基末端肽的抗體和相對(duì)于羧基末端肽的抗體的檢查試劑盒也屬于本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了含有稱為?；z氨酸的新修飾氨基酸的新肽激素，并提供了以該肽的結(jié)構(gòu)作為基本骨架的具有Ca提高活性化合物的新的設(shè)計(jì)指導(dǎo)。
另外，通過本發(fā)明公開的脂肪酸修飾肽、GH釋放激素和生長抑素的GH分泌誘導(dǎo)機(jī)理的解釋，暗示這并不限于簡單地GH分泌誘導(dǎo)機(jī)制，也詳述了其他激素分泌控制機(jī)理。本發(fā)明，公開了脂肪酸修飾肽作為循環(huán)體系和代謝體系的控制因子的各種功能，本發(fā)明的效果也涉及新的生物體控制機(jī)理的解釋。
具體地說，本發(fā)明涉及(1)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述肽具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的肽，其至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，(2)前述(1)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸序列，該氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列或(b)具有該序列中至少從氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在該氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸，(3)前述(2)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23記載的氨基酸序列，(4)前述(2)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.25、26、29、30、31、32、34和35記載的氨基酸序列，(5)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性或誘導(dǎo)生長激素分泌活性的肽的(a)構(gòu)成氨基酸被修飾或不被修飾，且(b)至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代，(6)前述(1)或(5)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.27、28和33記載的氨基酸序列，(7)前述(5)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸序列，該氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列或(b)具有該序列中至少從氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在從氨基酸末端第4至第10氨基酸的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸，(8)前述(7)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23記載的氨基酸序列，(9)前述(7)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.25、26、29、30、31、32、34和35記載的氨基酸序列，(10)前述(1)或(5)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中相當(dāng)于氨基末端第1至第4氨基酸序列的部分如下式所示，A-B-C-D-A氨基酸、非氨基酸化合物或無；B氨基酸、非氨基酸化合物或無；(其中，A+B的分子鏈長相當(dāng)于二肽的長度)C或D可相同或不同，表示(a)修飾的氨基酸、或(b)具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸，(11)前述(10)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于C是修飾的氨基酸，其向氨基酸α碳原子中導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫醚、酰胺或二硫化物鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈；D是具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸。
(12)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，在一個(gè)由選自SEQ IDNO.2、3、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30和31記載的氨基酸序列形成的氨基酸序列中，相當(dāng)于氨基末端的第1至第4氨基酸序列部分是前述(10)或(11)記載的肽類化合物，(13)前述(1)、(2)、(3)、(5)、(7)或(8)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中修飾的氨基酸是氨基末端的第3個(gè)氨基酸，(14)前述(13)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于修飾的氨基酸中的氨基酸是絲氨酸或半胱氨酸，(15)前述(1)、(2)、(3)、(5)、(7)或(8)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有修飾的氨基酸，其向氨基酸α碳原子中導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、或脲鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)H或具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，(16)前述(1)、(2)、(4)、(5)、(6)、(7)、(9)、(10)或(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中修飾的氨基酸是這樣的一種氨基酸其向氨基酸的α碳中導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫酯、硫醚、二硫化物、酰胺、脲或硫脲鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，(17)前述1、2、3、5、7或8記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有通過酯鍵修飾的修飾氨基酸，(18)前述(1)、(2)、(4)、(5)、(6)、(7)、(9)、(10)、(11)或(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有氨基酸側(cè)鏈的官能基是通過形成酯鍵被修飾的修飾氨基酸，(19)前述(17)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有其氨基酸側(cè)鏈中的羥基與脂肪酸形成酯鍵的氨基酸，(20)前述(18)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有脂肪酸與氨基酸側(cè)鏈中的羥基形成酯鍵或與巰基形成硫酯鍵的氨基酸，
(21)前述(19)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有結(jié)合了碳原子數(shù)2～35的脂肪酸的氨基酸，(22)前述(20)中的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸的碳原子數(shù)是2～35，(23)前述(21)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有結(jié)合了選自碳原子數(shù)2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸的氨基酸，(24)前述(22)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是選自碳原子數(shù)2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸，(25)前述(23)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(26)前述(24)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(27)前述(23)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(28)前述(24)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(29)肽類化合物，其特征在于，在前述(1)至(28)記載的肽類化合物的羧基末端，進(jìn)一步結(jié)合了堿性氨基酸，(30)前述(1)，(2)，(3)，(5)，(7)，(8)，(13)，(14)，(15)，(17)，(19)，(21)，(23)，(25)，(27)項(xiàng)記載的肽類化合物，其特征在于，N末端是被具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或?；揎椀暮?或C末端羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))，(31)前述(1)，(2)，(4)，(5)，(6)，(7)，(9)，(10)，(11)，(12)，(16)，(18)，(20)，(22)，(24)，(26)，(28)，(29)記載的肽類化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通過導(dǎo)入具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或?；恍揎椇?或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))，(32)肽類化合物，其特征在于在前述(30)或(31)記載的肽類化合物的羧基末端酰胺衍生物中，進(jìn)一步導(dǎo)入堿性基團(tuán)，(33)前述(1)至(32)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有効成分的藥物組合物，(34)前述(1)至(32)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的治療生長激素欠缺或減少引起的疾病的藥物組合物，(35)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的藥物組合物，其包含非起因于生長激素欠缺或減少的疾病所涉及的治療劑和含有前述(1)至(32)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，(36)適用于人以外動(dòng)物的前述(33)至(35)記載的藥物組合物，(37)生長激素欠缺或減少為起因的疾病的治療方法，其中使用前述(1)至(32)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物給藥，(38)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，包括使用非起因于生長激素欠缺或減少的疾病所涉及的治療劑和含有前述(1)至(32)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物給藥，(39)適用于人以外動(dòng)物的前述(37)或(38)記載的治療方法，(40)DNA，是編碼前述(1)至(32)記載的肽類化合物氨基酸序列的DNA，該DNA具有編碼肽的堿基序列，該肽在所述DNA編碼的氨基酸序列中具有至少一個(gè)氨基酸能被修飾的識(shí)別序列，(41)前述(40)記載的DNA，其中堿基序列是選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21、24、36、37、38和39記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列，(42)前述(40)記載的DNA，其中堿基序列是編碼氨基酸的堿基序列，其選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21、24、36、37、38和39記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列，(43)具有前述(40)至(42)記載的DNA的載體，(44)含有前述(43)記載的載體的細(xì)胞，(45)可產(chǎn)生肽類化合物的細(xì)胞，具有包含前述(40)至(42)記載的DNA的載體，且具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽化合物是所述氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸被修飾，(46)與前述(1)至(32)記載的肽類化合物相對(duì)應(yīng)的抗體，(47)前述(1)至(32)記載的肽類化合物的測(cè)定方法，其特征在于，通過前述(46)記載的抗體，檢測(cè)前述(1)至(32)記載的肽類化合物，(48)前述(1)至(32)記載的肽類化合物檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，使用前述(46)記載的抗體，檢測(cè)前述(1)至(32)記載的肽類化合物，(49)前述(1)至(32)記載的肽類化合物的制造方法，是在使用基因重組技術(shù)制造前述(1)至(32)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(40)至(42)記載的DNA的載體，將可修飾所述肽中的至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中采集目的肽類化合物，(50)前述(1)至(32)記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重組技術(shù)制造前述(1)至(32)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(40)至(42)記載的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)后，將任意的氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，(51)前述(19)至(28)記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重組技術(shù)制造前述(19)至(28)記載的肽類化合物的方法中，使用具有可使脂肪酸與氨基酸側(cè)鏈中的羥基形成酯鍵或與巰基形成硫酯鍵活性的細(xì)胞，(52)前述(19)至(28)記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.8記載的氨基酸序列中的絲氨酸側(cè)鏈羥基與脂肪酸形成酯鍵的絲氨酸?；钚缘募?xì)胞，(53)前述(19)至(28)記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.28記載的氨基酸序列中的蘇氨酸側(cè)鏈中的羥基與脂肪酸形成酯鍵的酰化活性細(xì)胞，(54)基因治療用藥物組合物，通過將含有編碼前述(1)至(32)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的至少具有一個(gè)修飾的氨基酸的肽，以治療生長激素欠缺或減少導(dǎo)致的疾病，(55)生長激素欠缺或減少引起的疾病的治療方法，其特征在于，通過將具有編碼前述(1)至(32)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入細(xì)胞，得到具有生長激素分泌誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列，(56)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將具有編碼前述(1)至(32)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的，具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的肽，和(57)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，其特征在于通過將具有編碼前述(1)至(32)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有生長激素誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列。
更具體地說，本發(fā)明涉及(1)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述肽是具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的肽，其至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，
(2)前述(1)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸序列，該氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列或(b)具有該序列中至少從氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在該氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸，(3)前述(2)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22、23、25和26記載的氨基酸序列，(4)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，是具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性和誘導(dǎo)生長激素分泌活性的肽的(a)構(gòu)成氨基酸被修飾或不被修飾，且(b)至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代，(5)前述(1)或(4)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.27記載的氨基酸序列，(6)前述(4)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸序列，該氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列或(b)具有該序列中至少從氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在從氨基酸末端第4至第10氨基酸的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸，(7)前述(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22、23、25和26記載的氨基酸序列，(8)前述(1)或(4)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中相當(dāng)于氨基末端第1至第4氨基酸序列的部分，如下式所示，A-B-C-D-A氨基酸、非氨基酸化合物或無；B氨基酸、非氨基酸化合物或無；(其中，A+B的分子鏈長相當(dāng)于二肽的長度)C或D可相同或不同，表示(a)修飾的氨基酸、或(b)具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸，或(c)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，
(9)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，在一個(gè)選自SEQ ID NO.2、3、8、9、10、11、16、17、22、25和26記載的氨基酸序列中，與氨基末端第1至第4氨基酸序列相當(dāng)?shù)牟糠质乔笆?8)記載的序列。
(10)前述(1)至(9)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，修飾的氨基酸是向氨基酸α碳原子中導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫酯、硫醚、二硫化物、酰胺、脲或硫脲鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈的氨基酸，(11)前述(1)至(10)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有氨基酸側(cè)鏈的官能基通過形成酯鍵被修飾的修飾氨基酸，(12)前述(11)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有氨基酸側(cè)鏈的羥基或巰基與脂肪酸形成酯鍵的氨基酸，(13)前述(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸的碳原子數(shù)是2至35，(14)前述(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是選自碳原子數(shù)2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸，(15)前述(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(16)前述(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(17)前述(1)至(16)記載的肽類化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通過導(dǎo)入具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或?；恍揎椇?或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))，(18)肽類化合物，其特征在于，在前述(1)至(16)記載的肽類化合物的羧基末端，進(jìn)一步結(jié)合堿性氨基酸，(19)肽類化合物，其特征在于，在前述(1)至(16)、或(18)記載的肽類化合物的羧基末端酰胺衍生物中，進(jìn)一步導(dǎo)入堿性基團(tuán)，(20)前述(1)至(19)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有効成分的藥物組合物，(21)前述(1)至(19)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的治療生長激素欠缺或減少引起的疾病的藥物組合物，(22)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病治療劑和含有前述(1)至(19)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽形成的為治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的藥物組合物，(23)適用于人以外動(dòng)物的前述(20)至(22)記載的藥物組合物，(24)生長激素欠缺或減少為起因的疾病的治療方法，其中使用前述(1)至(19)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物給藥，(25)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，包括使用非起因于生長激素欠缺或減少的疾病涉及的治療劑和含有前述(1)至(19)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物給藥，(26)適用于人以外動(dòng)物的前述(24)或(25)記載的治療方法，(27)DNA，是編碼前述(1)至(19)記載的肽類化合物氨基酸序列的DNA，在該DNA編碼的氨基酸序列中，具有編碼肽的堿基序列，該肽具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列，(28)前述(27)記載的DNA，其中堿基序列是選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21和24記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列，(29)前述(27)記載的DNA，堿基序列是選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21和24記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列中，編碼氨基酸的堿基序列，(30)具有前述(27)至(29)記載的DNA的載體，(31)含有前述(30)記載的載體的細(xì)胞，(32)可產(chǎn)生肽類化合物的細(xì)胞，具有前述(27)至(29)記載的DNA的載體，且具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽化合物是，該氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸被修飾，(33)與前述(1)至(19)記載的肽類化合物相對(duì)應(yīng)的抗體，(34)前述(1)至(19)記載的肽類化合物的測(cè)定方法，其特征在于，使用前述(33)記載的抗體，檢測(cè)前述(1)至(19)記載的肽類化合物，(35)前述(1)至(19)記載的肽類化合物檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，使用前述(33)記載的抗體，檢測(cè)前述(1)至(19)記載的肽類化合物，(36)前述(1)至(19)記載的肽類化合物的制造方法，是在使用基因重組技術(shù)，制造前述(1)至(19)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(27)至(29)記載的DNA的載體，將可修飾該肽中的至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中采集目的肽類化合物，(37)前述(1)至(19)記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于使用基因重組技術(shù)，制造前述(1)至(19)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(27)至(29)記載的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)后，將任意的氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，(38)前述(12)至(16)記載肽類化合物的制造方法，其特征在于使用基因重組技術(shù)制造前述(12)至(16)記載的肽類化合物的方法中，使用具有可使脂肪酸與氨基酸側(cè)鏈中的羥基或巰基形成酯鍵活性的細(xì)胞，(39)前述(12)至(16)記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.8記載的氨基酸序列中的絲氨酸側(cè)鏈羥基與脂肪酸形成酯鍵的絲氨酸?；钚缘募?xì)胞，(40)基因治療用藥物組合物，通過將含有編碼前述(1)至(19)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的至少具有一個(gè)修飾的氨基酸的肽，治療生長激素欠缺或減少導(dǎo)致的疾病，(41)生長激素欠缺或減少引起的疾病的治療方法，其特征在于，通過將具有編碼前述(1)至(19)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有生長激素分泌誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列，(42)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將具有編碼前述(1)至(19)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的，具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的肽，和(43)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，通過將具有編碼前述(1)至(19)記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有生長激素誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列。
另外，具體地說，本發(fā)明涉及(1)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述肽具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性，至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，(2)前述(1)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列，或具有該序列中至少從氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在氨基末端第4至第10氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(3)前述(2)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23記載的氨基酸序列，(4)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性和誘導(dǎo)生長激素分泌活性，(a)構(gòu)成氨基酸被修飾或不被修飾，且(b)至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代，(5)前述(4)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列，或具有該序列中至少從氨基末端第4至第10的氨基酸序列，且在氨基末端第4至第10氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(6)前述(4)至(5)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23記載的氨基酸序列，(7)前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，修飾的氨基酸是從氨基末端第3個(gè)氨基酸，(8)前述(7)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，在修飾的氨基酸中的氨基酸是絲氨酸或半胱氨酸，(9)前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有向氨基酸α碳原子中導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈的氨基酸，(10)前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有通過酯鍵被修飾的修飾氨基酸，(11)前述(10)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有鍵合了脂肪酸的氨基酸，(12)前述(11)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有鍵合了碳原子數(shù)2至35的脂肪酸的氨基酸，(13)前述(12)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有鍵合了選自碳原子數(shù)2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸的氨基酸，(14)前述(13)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中鍵合的脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(15)前述(13)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中鍵合的脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(16)前述(1)至(15)記載的肽類化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通過具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或酰基被修飾和/或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))，(17)前述(1)至(16)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有効成分的藥物組合物，(18)前述(1)至(16)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的治療生長激素欠缺或減少引起的疾病的藥物組合物，(19)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病治療劑，和含有前述(1)至(16)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽形成的為治療該疾病的藥物組合物，(20)適用于人以外動(dòng)物的前述(17)至(19)記載的藥物組合物，(21)生長激素欠缺或減少為起因的疾病的治療方法，其中使用前述(1)至(16)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物給藥，(22)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，包括使用非起因于生長激素欠缺或減少的疾病涉及的治療劑，和含有前述(1)至(16)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物給藥，(23)適用于人以外動(dòng)物的前述(21)或(22)記載的治療方法，(24)DNA，是編碼前述(1)至(16)記載的肽類化合物涉及的DNA，在該DNA堿基序列中，具有編碼肽的堿基序列，該肽具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列，(25)前述(24)記載的DNA，具有選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21和24記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列，(26)前述(24)記載的DNA，具有選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21和24記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列中，編碼氨基酸部分的序列，(27)具有前述(24)至(26)記載的DNA的載體，(28)含有前述(27)記載的載體的細(xì)胞，(29)可產(chǎn)生肽類化合物的細(xì)胞，具有前述(24)至(26)記載的DNA的載體，且具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽化合物是，該氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸被修飾，(30)與前述(1)至(16)記載的肽類化合物相對(duì)應(yīng)的抗體，(31)肽類化合物的測(cè)定方法，其特征在于，使用前述(30)記載的抗體，鑒定前述(1)至(16)記載的肽類化合物，(32)肽類化合物檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，使用前述(30)記載的抗體，檢測(cè)前述(1)至(16)記載的肽類化合物，(33)肽類化合物的制造方法，是在使用基因重組技術(shù)，制造前述(1)至(16)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(24)至(26)記載的DNA的載體，將可修飾該肽中的至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中采集目的肽類化合物，(34)肽類化合物的制造方法，其特征在于使用基因重組技術(shù)制造前述(1)至(16)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(24)至(26)記載的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)后，將任意的氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，(35)肽類化合物的制造方法，其特征在于使用基因重組技術(shù)制造前述(11)至(15)記載的肽類化合物的方法中，使用可產(chǎn)生具有可使SEQ ID NO.8記載的氨基酸序列中的絲氨酸殘基與脂肪酸鍵合的肽的細(xì)胞，(36)具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和誘導(dǎo)生長激素分泌活性的肽類化合物的制造方法，其特征在于，通過含有編碼前述(4)至(6)記載的肽類化合物的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)，(37)為治療生長激素欠缺或減少導(dǎo)致的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將具有編碼前述(1)至(16)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的具有至少一個(gè)被修飾的氨基酸的肽，(38)生長激素欠缺或減少引起的疾病的治療方法，其特征在于，通過將具有編碼前述(1)至(16)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有生長激素分泌誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列，(39)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將具有編碼前述(1)至(16)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的肽，和(40)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，其特征在于，通過將具有編碼前述(1)至(16)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有生長激素誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列。
另外，具體地說，本發(fā)明涉及(1)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述肽具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性，至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，(2)前述(1)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列，(3)前述(1)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第7個(gè)氨基酸為止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(4)前述(1)記載的肽類似物或其衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.3記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第7個(gè)氨基酸為止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(5)前述(3)記載的肽類化合物的前體肽類化合物，具有SEQ IDNO.4記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第28個(gè)氨基酸為止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(6)前述(4)記載的肽類化合物的前體肽類化合物，具有SEQ IDNO.5記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第28個(gè)氨基酸為止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(7)具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性和誘導(dǎo)生長激素分泌活性的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，(8)前述(7)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性和誘導(dǎo)生長激素分泌的活性，至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸化合物替代，(9)前述(7)至(8)記載的肽類化合物或其衍生物以及其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列，(10)前述(7)至(8)記載的肽類化合物或其衍生物以及其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第7個(gè)氨基酸為止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(11)前述(7)至(8)記載的肽類化合物或其衍生物以及其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.3記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第7個(gè)氨基酸為止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(12)前述(10)記載的肽類化合物前體肽類化合物，具有SEQ IDNO.4記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第28個(gè)氨基酸為止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(13)前述(11)記載的肽類化合物前體肽類化合物，具有SEQ IDNO.5記載的氨基酸序列，或具有該序列中從氨基末端到第28個(gè)氨基酸為止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列，(14)前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，修飾的氨基酸是從氨基末端第3個(gè)氨基酸。
(15)前述(14)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，修飾的氨基酸中的氨基酸是絲氨酸或半胱氨酸。
(16)前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，修飾氨基酸中的修飾是，向氨基酸α碳原子中導(dǎo)入了(a)通過或不通過碳原子數(shù)1以上的亞烷基，通過選自酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲的鍵合方式鍵合的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)H或具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，(17)前述(1)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有通過酯鍵修飾的修飾氨基酸，(18)前述(17)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有鍵合了脂肪酸的氨基酸，(19)前述(18)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有鍵合了碳原子數(shù)2至35的脂肪酸的氨基酸，(20)前述(18)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是辛酸(caprylic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(21)前述(18)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是辛酸(caprylic acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(22)前述(18)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是月桂酸(lauric acid)、或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，(23)前述(1)至(22)記載的肽類化合物，通過如下被修飾，氨基末端通過具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或?；恍揎椇?或羧基末端是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))，(24)前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的治療生長激素欠缺或減少引起的疾病的藥物組合物，(25)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病相關(guān)治療劑，和含有前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽形成的為治療該疾病的疾病的藥物組合物，(26)適用于人以外動(dòng)物的前述(24)至(25)記載的藥物組合物，(27)生長激素欠缺或減少為起因的疾病的治療方法，包括使用前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物給藥，(28)非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，包括使用非起因于生長激素欠缺或減少的疾病涉及的治療劑，和含有前述(1)至(6)記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物給藥，(29)適用于人以外動(dòng)物的前述(27)至(28)記載的治療方法，(30)DNA，是編碼前述(1)至(6)記載的肽類化合物所涉及的DNA，在該DNA序列中，DNA序列編碼具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列的肽，(31)前述(30)記載的cDNA(含有NCR)，具有SEQ ID NO.6記載的DNA序列，(32)前述(30)記載的cDNA(不含NCR)，具有SEQ ID NO.6記載的DNA序列中第31至381位核苷酸的DNA序列，(33)前述(30)記載的c DNA(含有NCR)，具有SEQ ID NO.7記載的DNA序列，(34)前述(30)記載的c DNA(不含NCR)，具有SEQ ID NO.7記載的DNA序列中第34至385位核苷酸的DNA序列，(35)具有前述(30)至(34)記載的DNA的載體，(36)含有前述(35)記載的載體的細(xì)胞，
(37)可產(chǎn)生肽類化合物的細(xì)胞，具有包含前述(30)至(34)記載的DNA的載體，且具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽化合物是，具有該氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列的肽類化合物，(38)與前述(1)至(23)記載的肽類化合物相對(duì)應(yīng)的抗體，(39)肽類化合物的測(cè)定方法，其特征在于，使用前述(38)記載的抗體，鑒定前述(1)至(23)記載的肽類化合物，(40)肽類化合物檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，使用前述(38)記載的抗體，檢測(cè)前述(1)至(23)記載的肽類化合物，(41)肽類化合物的制造方法，是在使用基因重組技術(shù)制造前述(1)至(6)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(30)記載的DNA的載體，將可修飾該肽中的至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中采集目的肽類化合物，(42)肽類化合物的制造方法，其特征在于使用基因重組技術(shù)制造前述(1)至(6)記載的肽類化合物的方法中，通過含有前述(30)記載的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)后，將任意的氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，(43)肽類化合物的制造方法，其特征在于使用基因重組技術(shù)制造前述(18)至(22)記載的肽類化合物的方法中，使用可產(chǎn)生SEQ IDNO.1記載的氨基酸序列中的絲氨酸殘基與脂肪酸鍵合的肽的細(xì)胞，(44)具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性和誘導(dǎo)成長激素分泌活性的肽類化合物的制造方法，其特征在于，通過含有編碼前述(7)至(13)記載的肽類化合物的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)，(45)治療生長激素欠缺或減少導(dǎo)致的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將含有編碼前述(1)至(6)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的具有至少一個(gè)修飾的氨基酸的肽，(46)生長激素欠缺或減少引起的疾病的治療方法，其特征在于，通過將具有編碼前述(1)至(6)記載的肽類化合物的DNA的載體插入細(xì)胞，得到具有生長激素分泌誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列，(47)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將具有編碼前述(1)至(6)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的，具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的肽，和(48)治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，通過將具有編碼前述(1)至(6)記載的肽類化合物的DNA的載體插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有生長激素誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的識(shí)別序列。
在本發(fā)明中，氨基酸是指包括L-氨基酸、D-氨基酸、α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、天然氨基酸、合成氨基酸等所有氨基酸。
在本發(fā)明中，修飾的氨基酸是指，上述氨基酸的任意基團(tuán)被化學(xué)修飾的氨基酸。特別優(yōu)選，α-氨基酸中α碳原子被化學(xué)修飾的修飾氨基酸。即，修飾氨基酸是用式(I)表示的α-氨基酸時(shí) R′、R″是H或任意的取代基，總之是將天然氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾后的任何產(chǎn)物就都可以。另外，R′、R″的任意一方可以是H。
作為R′、R″所示的取代基，將天然氨基酸中存在的取代基，用天然氨基酸或與之對(duì)應(yīng)的D-氨基酸中不存在的取代部分取代的氨基酸稱為修飾氨基酸。
作為這樣的取代部分，例如，可以將天然存在的氨基酸側(cè)鏈中含有-OH、-SH、-NH-或-NH2時(shí)，將這些基團(tuán)?；纬傻幕鶊F(tuán)作為優(yōu)選例子列舉。
作為這樣的?；?，可列舉例如，從有機(jī)羧酸、有機(jī)磺酸、有機(jī)磷酸化合物除去羥基形成的基團(tuán)。
作為有機(jī)羧酸，更具體地可列舉脂肪酸，其碳原子數(shù)優(yōu)選2～35，更優(yōu)選6～18，最優(yōu)選8～16。作為這樣的脂肪酸，具體可列舉，八碳酸(優(yōu)選辛酸)、十碳酸(優(yōu)選，正癸酸)、十二酸(優(yōu)選月桂酸)、其單烯或多烯脂肪酸等。
對(duì)于有機(jī)磺酸或有機(jī)磷酸化合物，也優(yōu)選碳原子數(shù)2～35的化合物。
另外，進(jìn)一步修飾的氨基酸可以是上述R′或/和R″所示基團(tuán)被例如下式所示取代的氨基酸。
-(CH2)n-P-Q(式中、n是0～10的整數(shù)、P是 -O-、 -S-、-CO-NH-、 或-CO-NH-CO-、Q是H或C1-35、優(yōu)選C1-20的烷基)另外，P也可以是-CO-。
P也可以是-S-S-、或-NH-CS-。另外，在上述所有-NH-中，H可被C1～35的飽和或不飽和烷基、C6～20的芳基、C7～13的芳烷基取代。
α-氨基酸用上述式(1)表示時(shí)，R′或R″被上述-(CH2)n-P-Q取代的修飾氨基酸是優(yōu)選的實(shí)施方案。特別是，氨基酸為絲氨酸的α碳原子與上述式-(CH2)n-P-Q所示取代基鍵合的式 (式中、n、P或Q定義同上。)所示修飾的絲氨酸是優(yōu)選的。
下面就通過或不通過碳原子數(shù)1以上的烷基的選自酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲的鍵合方式進(jìn)行說明。
例如，氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或羥基脯氨酸時(shí)，該氨基酸在側(cè)鏈中有羥基。氨基酸是半胱氨酸時(shí)，該氨基酸在側(cè)鏈中有巰基。氨基酸是賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、脯氨酸或羥基脯氨酸時(shí)，在側(cè)鏈中有氨基或亞氨基。
這些羥基、巰基、氨基、亞氨基可被化學(xué)修飾。即，羥基或巰基可被醚化、酯化、硫醚化或硫酯化。亞氨基可被亞氨醚化、亞氨硫醚化、烷基化。氨基可被酰胺化、硫代酰胺化或脲化。
另外，巰基可被二硫化物化，亞氨基可被酰胺化、或硫代酰胺化，氨基可被烷基化或硫脲化。
這樣被化學(xué)修飾的羥基或巰基可用下式表示 或 酰胺化或硫代酰胺化的氨基或亞氨基可用下式表示 或 醚化的羥基或巰基可用下式表示-O-Z3、或-S-Z3作為亞氨醚化或亞氨硫醚化的亞氨基可用下式表示 或 作為烷基化的氨基可用下式表示 作為烷基化的亞氨基可用下式表示 作為脲化或硫脲化的亞氨基可用下式表示 或
二硫化物化的巰基可用下式表示-S-S-Z8。
上述式中，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7和Z8可以是不違背本發(fā)明精神的，為進(jìn)行任何化學(xué)修飾的取代基，由于是在藥物領(lǐng)域常用的或用于肽化學(xué)修飾的取代基在專利文獻(xiàn)或?qū)W術(shù)文獻(xiàn)中公知的，在本發(fā)明中也可采用這些本身公知的用于修飾的取代基，且化學(xué)修飾可按照其以前公知的方法進(jìn)行。
在上述式中，Z1可以是氫原子或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，這些烷基可以是飽和或不飽和的。碳原子數(shù)通常為C1-50，優(yōu)選為C6-20。
Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7或Z8可以是氫原子或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，這些烷基可以是飽和或不飽和的。碳原子數(shù)通常為C1-10，優(yōu)選為C1-6。
該Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7或Z8所表示的烷基，可以被例如，羥基、氨基、鹵素、硝基、C1-3烷氧基等通常用于肽化學(xué)修飾中的取代基取代。
上述中， 為脂肪酸 的殘基時(shí)，是鍵合了脂肪酸的氨基酸的一個(gè)例子。此時(shí)，作為脂肪酸，可列舉例如辛酸、正癸酸、十二(烷)酸、丁酸、己酸、十一烷酸、十六烷酸、癸酸、十九烷酸、二十二烷酸、褐煤酸、或三十二(烷)酸等飽和脂肪酸，例如丙烯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、或アアテアロ一ル酸等不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸可以是單烯，也可以是多烯。
另外，修飾的氨基酸可以是與α-氨基酸中的α碳原子鍵合構(gòu)成肽鍵的羧基和氨基以外的基團(tuán)被氫原子或飽和或不飽和烷基取代形成的α-氨基酸。
另外，本發(fā)明中修飾的氨基酸可以是，氨基酸的氨基被碳原子數(shù)1至6的飽和或不飽和烷基取代形成的氨基酸。
本發(fā)明中的非天然氨基酸，是在分子兩端具有氨基和羧基的物質(zhì)，例如可列舉，NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-COOH、NH2-(CH2)4-COOH、NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH、或NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH等。這些中的任何一個(gè)，分子鏈長相當(dāng)于二肽的長度，當(dāng)然也包括分子鏈長相當(dāng)于肽長的物質(zhì)。
另外，本發(fā)明中的非氨基酸化合物，包括例如，NH2-CH(CH2OH)-CH3、CH3-CH(R)-COOH、CH3-CH(R)-CH3(每一個(gè)的分子鏈長與肽長相當(dāng))，或NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-CH3、NH2-(CH2)3CH(R)-CH3(每一個(gè)的分子鏈長與二肽長相當(dāng))等。
這里，R是表示天然氨基酸的側(cè)鏈或上述修飾氨基酸的α碳原子的取代基。
圖2顯示，確認(rèn)Ghrelin中的正辛?；揎棥是顯示，天然型Ghrelin(上段)、和合成Ghrelin和合成脫?；疓hrelin(下段)、分別取2μg，用逆相HPLC的分析結(jié)果圖。b是顯示，天然型Ghrelin(實(shí)線)、合成Ghrelin(小虛線)和合成脫酰基化Ghrelin(大虛線)引起的CHO-GHSR62細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化圖。
圖3是顯示，Ghrelin對(duì)于CHO-GHSR62細(xì)胞的特異性相互作用的圖，圖中，在箭頭所示的點(diǎn)，添加試樣。a是顯示，Ghrelin、GHRP-6和GRF(GHRH)引起的CHO-GHSR62細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化圖。b是顯示，添加(○)或不添加(●)作為GHS-R特異性抑制劑的[D-Lys-3]-GRP-6時(shí)，Ghrelin引起的CHO-GHSR62細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化圖，也顯示GRF(GHRH)引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化(黑三角)。
圖4顯示，從大鼠和人得到的Ghrelin前體的氨基酸序列、和研究這些前體在各種組織的表達(dá)的結(jié)果圖。a是大鼠和人的Ghrelin前體氨基酸序列比較圖，圖中，相同氨基酸結(jié)網(wǎng)，虛線表示信號(hào)肽，黑三角表示信號(hào)肽的切斷點(diǎn)，三角表示羧基末端側(cè)的切斷點(diǎn)，框中表示成熟型Ghrelin部分、*表示用正辛酸修飾。b顯示的是用Northern印跡分析的大鼠各種組織中Ghrelin的表達(dá)的結(jié)果圖。
圖5顯示，在體外和體內(nèi)，Ghrelin對(duì)下垂體激素分泌的影響效果圖。a是顯示，在大鼠下垂體初期培養(yǎng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化引起的熒光強(qiáng)度的變化圖，實(shí)線表示添加Ghrelin的情況，虛線表示添加脫?；疓hrelin的情況。b是顯示，Ghrelin引起的下垂體激素分泌的圖，圖中，黑柱表示添加Ghrelin時(shí)，白柱表示不添加時(shí)的下垂體激素濃度。c是顯示用Ghrelin對(duì)雄性大鼠靜脈注射后血漿中的下垂體激素濃度隨時(shí)間的變化圖。在圖b和圖c中，GH表示生長激素，ACTH表示促腎上腺皮質(zhì)激素，F(xiàn)SH表示促卵泡激素，LH表示促黃體激素，PRL表示催乳激素，TSH表示促甲狀腺激素。
圖6顯示的是，用Ghrelin對(duì)腦室內(nèi)給藥時(shí)的促進(jìn)進(jìn)食的效果圖，表示用Ghrelin給藥后2小時(shí)的攝餌量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。a表示，對(duì)于Ghrelin的效果誤差范圍不足0.0001的情況。
圖7顯示、在尿烷麻醉的大鼠中，對(duì)給藥引起的胃酸分泌的效果圖，A是使用大鼠Ghrelin(rGhrelin)，B是使用組胺(Histamine)給藥時(shí)的結(jié)果。各符號(hào)表示的是，用4例大鼠的平均值，標(biāo)準(zhǔn)誤差用誤差框(error bar)表示。作為對(duì)照，使用生理鹽水(Saline)給藥。在箭頭指的時(shí)間點(diǎn)用藥劑給藥。
圖8顯示，在尿烷麻醉的大鼠中，大鼠Ghrelin對(duì)于胃運(yùn)動(dòng)的作用圖，A表示，使用生理鹽水(Saline)和大鼠Ghrelin(rGhrelin)給藥時(shí)的典型胃運(yùn)動(dòng)波形，B是顯示，4例大鼠的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差值的圖。在箭頭指的時(shí)間點(diǎn)給藥(Drug)。
圖9顯示的是，放射免疫測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和抗體交叉反應(yīng)性圖，a顯示各種Ghrelin對(duì)用125I標(biāo)識(shí)的大鼠Ghrelin與N端抗體結(jié)合的抑制圖，b顯示，各種Ghrelin對(duì)用125I標(biāo)識(shí)的大鼠Ghrelin與C端抗體結(jié)合的抑制圖。圖的橫軸表示的是，各種Ghrelin在每個(gè)反應(yīng)管的添加量，縱軸表示，相對(duì)于無各種Ghrelin存在下的大鼠Ghrelin結(jié)合量(B0)的在各種Ghrelin存在下的結(jié)合量(B)的百分比(％)。圖中符號(hào)分別表示，大鼠Ghrelin(○)、人Ghrelin(●)、大鼠Ghrelin-27(□)、[Ser3(癸?；?]-大鼠Ghrelin(◇)、[Ser3(己?；?]-大鼠Ghrelin(△)和脫脂肪酸大鼠Ghrelin()。
發(fā)明實(shí)施的最佳方案對(duì)于形成GHS受體(GHS-R)的內(nèi)在性配位體的肽，可通過向表達(dá)GHS-R的細(xì)胞中添加各種臟器或組織萃取物，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，得知該內(nèi)在性配位體在臟器·組織間的分布。
作為表達(dá)GHS-R的細(xì)胞，已知一直表達(dá)GHS-R的的下丘腦和腦垂體，以及從這些組織得到的細(xì)胞株，但是優(yōu)選對(duì)GHS-R基因合適的細(xì)胞，例如，向CHO細(xì)胞中導(dǎo)入·表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
在本發(fā)明的內(nèi)在性GHS肽中，不僅在表達(dá)該肽的下丘腦和腦垂體，而且在作為消化系統(tǒng)臟器的胃萃取物中確認(rèn)有強(qiáng)的Ca提高活性。因此，為了尋找目的孤兒·受體的內(nèi)在性配位體，不僅要在表達(dá)該受體的組織·臟器中尋找，而且需要在其他組織·臟器中廣泛尋找。
測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的方法可使用公知的方法，優(yōu)選利用鈣離子濃度變化引起的Fluo-4 AM(Molecular Probe社)的熒光強(qiáng)度變化的FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader，Molecular Devices社)。
為了從已確認(rèn)Ca提高活性的組織·臟器的萃取物中，生成目的內(nèi)在性GHS肽，可使用公知的純化方法。
作為肽的純化方法，用各種分離方法分離后，凝膠過濾通過單獨(dú)或組合使用離子交換和和逆相色譜有效進(jìn)行，不一定需要拘泥于通過該色譜純化，可利用在肽純化中有效的任何手段。
另外，從組織·臟器分離·純化肽時(shí)，為了防止組織·臟器中存在的蛋白酶的作用引起的目的肽的分解，最好將組織·臟器在沸水中熱處理使蛋白質(zhì)失活。熱處理后將組織·臟器用冰冷卻除去，在目的肽的萃取·純化中也是有效的。
純化的具有Ca提高活性的肽，為確認(rèn)其在體外和體內(nèi)的GH分泌誘導(dǎo)活性，可利用公知的方法。
例如，在體外，分泌GH，添加到確認(rèn)表達(dá)GHS-R的腦垂體細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌的GH，可通過使用抗GH抗體的放射免疫測(cè)定法測(cè)定。另外，在上述放射免疫測(cè)定法中，如果使用對(duì)于其他激素的抗體代替抗GH抗體，也可測(cè)定該激素的分泌量。
為確認(rèn)體內(nèi)GH分泌誘導(dǎo)活性，可將具有Ca提高活性的肽注射到動(dòng)物的末梢靜脈后，測(cè)定血清中的GH濃度。
純化的肽的結(jié)構(gòu)解析可使用公知的方法。
為了鑒定肽的氨基酸序列的方法有，通過愛德曼氏分解法從羧基末端依次將氨基酸殘基游離，將該游離氨基酸通過高效液相色譜(HPLC)測(cè)定氨基酸的方法，和將該方法自動(dòng)化的通過氨基酸定序器的方法。
另外，還有通過GC-MASS測(cè)定離子化片段的分子量，鑒定氨基酸序列的方法。
含有本發(fā)明的一個(gè)修飾氨基酸的肽的情況，在鑒定上述氨基酸序列時(shí)，修飾的氨基酸被識(shí)別為“未知氨基酸”。
此時(shí)，將該修飾肽分解為氨基酸單元后，將修飾氨基酸分離·純化，通過常用化合物的結(jié)構(gòu)測(cè)定法，鑒定修飾氨基酸的結(jié)構(gòu)，可知道整個(gè)肽的結(jié)構(gòu)。另外，化學(xué)合成具有從編碼修飾肽的cDNA得到的該肽的氨基酸序列的肽，從該合成非修飾肽和修飾肽的分子量或物理性質(zhì)等推定修飾基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。
確定結(jié)構(gòu)的肽中的，提高Ca活性必須部分的氨基酸序列(核心序列)，可通過測(cè)定將該肽用蛋白酶切斷后生成的肽片段的Ca提高活性來明確。
所用蛋白酶，可使用切斷肽的氨基酸序列中特異性高的蛋白酶，但是即使使用特異性低，但在部分分解條件進(jìn)行反應(yīng)，也可制備該肽的各種肽片段。
通過測(cè)定這樣制備的肽片段的Ca提高活性，可得知提高Ca活性必須的核心序列。
內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽，氨基末端的第3個(gè)絲氨酸被脂肪酸?；?，但具有內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的一部分氨基酸序列的肽片段和該肽片段的絲氨酸側(cè)鏈與脂肪酸形成酯鍵的脂肪酸修飾的肽，可通過化學(xué)合成。
通過該合成肽片段，可對(duì)內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽進(jìn)行詳細(xì)的解析。同時(shí)，通過比較各種脂肪酸修飾的肽片段，可判定提高Ca活性必須的脂肪酸的種類。
例如，爪蟾屬等種，內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽，其氨基末端的第3個(gè)氨基酸殘基不是絲氨酸而是蘇氨酸，該蘇氨酸被脂肪酸酰化，而對(duì)于該肽類化合物可合成，由此可詳細(xì)解析該化合物。
另外，通過比較脊椎動(dòng)物中具有GH分泌誘導(dǎo)活性的肽的氨基酸序列，可發(fā)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物廣泛保存的領(lǐng)域，從該領(lǐng)域的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)GH分泌誘導(dǎo)活性必須的核心序列。
具有從內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的氨基酸序列推定的堿基序列的DNA進(jìn)行化學(xué)合成，將該DNA作為探針，篩選從表達(dá)該肽的細(xì)胞的mRNA制備的cDNA庫，可得到編碼該肽的cDNA。
但是，由于與氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子簡并，從肽的氨基酸序列推定的堿基序列很多，從這樣多種堿基序列得到的合成DNA作為探針的篩選是很困難的。
在這種情況下，與該肽氨基酸序列一致的序列，存在于從序列數(shù)據(jù)庫中公開的表達(dá)DNA片段(EST；Expressed Sequence Tag)的堿基序列推定的氨基酸序列中時(shí)，可從該EST部分堿基序列合成得到DNA，用于上述cDNA庫的篩選。
另外，從cDNA獲得染色體組DNA，可用常規(guī)方法進(jìn)行。
從這樣取得的cDNA堿基序列，可明確內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的前體多肽的氨基酸序列。
通過解析該氨基酸序列，可明確信號(hào)肽、內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽和其他肽部分，以及這些肽的切斷點(diǎn)，并可明確內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的生成原理。
另外，作為本發(fā)明之一的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的一部分氨基酸序列，該肽的前體多肽的氨基酸序列和編碼該多肽的DNA的堿基序列，在國際申請(qǐng)公開WO 98/42840中被公開，但是該申請(qǐng)公開的肽是具有胃動(dòng)素(motilin)樣活性的14個(gè)氨基酸形成的肽，沒有記載本發(fā)明公開的Ca濃度提高活性或GH分泌誘導(dǎo)活性。
本發(fā)明涉及的肽類化合物是指，具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性，在下式(2)所示結(jié)構(gòu)中，至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸替代的肽，或至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸替代的肽類似物，以及其氨基末端和/或羧基末端被修飾的肽衍生物。
在本發(fā)明中，上述肽、肽類似物和肽衍生物統(tǒng)稱為肽類化合物。
另外，在該肽類化合物中，可以是多個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸替代。在本發(fā)明中，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中，通常是氨基末端第1～10，優(yōu)選氨基末端第1～4或1～5的氨基酸中的1個(gè)或多個(gè)被修飾氨基酸和/或非氨基酸替代。其中，優(yōu)選第1～5個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸替代的物質(zhì)。
另外，在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中，在氨基末端第1～4個(gè)以外的部分，優(yōu)選第1～6個(gè)以外的部分，更優(yōu)選第1～10個(gè)以外的部分的氨基酸，可缺失或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的肽類化合物，優(yōu)選是具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性和誘導(dǎo)生物體內(nèi)生長激素分泌的肽，是至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代的化合物。
即，本發(fā)明的肽類化合物，是具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性或/和誘導(dǎo)生物體內(nèi)生長激素分泌的作用，肽鏈中的氨基酸被修飾氨基酸或/和非氨基酸化合物替代的肽類化合物。
作為這樣的化合物的具體例，可列舉SEQ ID NO.1、2或3所示肽中第3個(gè)氨基酸Ser的羥基被?；幕衔?，SEQ ID NO.4或5所示肽中第25個(gè)氨基酸Ser的羥基被酰化的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
另外，作為其他的具體例，可列舉SEQ ID NO.10、11、16或17所示肽中第3個(gè)氨基酸Ser的羥基被?；幕衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的鹽。
作為其他的具體例，可列舉SEQ ID NO.22、25、26或27所示肽中第3個(gè)氨基酸Ser的羥基被?；幕衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的鹽。
另外，作為其他的具體例，可列舉SEQ ID NO.29、30或31所示肽中第3個(gè)氨基酸Ser的羥基被?；幕衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的鹽。
另外，可列舉SEQ ID NO.28所示肽中第3個(gè)氨基酸Thr的羥基被酰化的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明中通過?；蛄u基中導(dǎo)入的?；?，例如可以是從有機(jī)羧酸、有機(jī)磺酸、有機(jī)磷酸化合物除去羥基形成的基團(tuán)。
作為有機(jī)羧酸，更具體地說，可列舉碳原子數(shù)優(yōu)選2～35左右，更優(yōu)選6～18左右，最優(yōu)選8～16左右的脂肪酸。作為這樣的脂肪酸，具體可列舉，八碳酸(優(yōu)選辛酸)、十碳酸(優(yōu)選正癸酸)、十二碳酸(優(yōu)選十二烷酸)、它們的單烯或多烯脂肪酸等。
作為有機(jī)磺酸、有機(jī)磷酸化合物，優(yōu)選其碳原子數(shù)是2～35左右的化合物。
含有第3個(gè)Ser的羥基被?；腟EQ ID NO.1的氨基酸序列的任何肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽也是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
即，本申請(qǐng)的第2項(xiàng)發(fā)明是，含有SEQ ID NO.8中記載的氨基酸序列、優(yōu)選SEQ ID NO.1中記載的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO.9中記載的氨基酸序列中第3個(gè)Ser的羥基被酰化的脂肪酸修飾肽的任何肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽也是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
另外，含有將SEQ ID NO.8中記載的氨基酸序列、優(yōu)選SEQ IDNO.1中記載的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO.9中記載的氨基酸序列從氨基末端第3個(gè)氨基酸的絲氨酸轉(zhuǎn)換為蘇氨酸的氨基酸序列中第3個(gè)Thr的羥基被?；闹舅嵝揎楇牡娜魏坞念惢衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的鹽也是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
另外，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是下述通式(2)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
X-AA1-AA2-AA3-Y (2)[式中，X相當(dāng)于氨基末端氨基酸的氨基的氫原子部分，表示H或碳原子數(shù)1或多數(shù)的飽和或不飽和烷基或酰基。Y相當(dāng)于羧基末端氨基酸的α-羧基的羥基部分，表示OH、OZ或NR6R7(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R6或R7表示H或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R6和R7可相同或不同。)]這里，AA1是下式所示結(jié)構(gòu) (式中、n表示1或2，R1和R1’可相同或不同，表示氫或取代基。)。
其中，n為2時(shí)，兩個(gè)取代基的R1可相同或不同?；颍琑1’也同樣。
作為取代基的具體例，可列舉(1)通過或不通過碳原子數(shù)1以上烷基鏈，通過選自酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲的鍵鍵合的具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，(2)H或具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(3)天然氨基酸的側(cè)鏈等。
另外，也可以是通過或不通過碳原子數(shù)1以上的烷基鏈，通過二硫化物或硫脲鍵鍵合的具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈。
AA2是下式 (式中、R1和R1’定義同前。R2表示H或碳原子數(shù)1至6的飽和或不飽和烷基。)或表示-CH2-CH(R1)-CH2-、或-CH2-CH(R1)-CO-(R1定義同前)。
AA3是下式 (式中、m表示1以上的整數(shù)，R1、R1’或R2定義同前。)其中，m是2以上的整數(shù)時(shí)，其兩個(gè)取代基的R1可相同或不同?；騌1’R2也同樣。
作為X所示的具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基，具體優(yōu)選甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、n-戊基、正己基、n-癸基、乙烯基、丙烯基或己烯基等C1-20的烷基。
作為X所示的?；闪信e甲?；?、乙?；?、丙?；⒒虮郊柞；菴1-10羧酸?；?；或苯磺酰基，萘磺酰基等C7-13的磺酸?；?。R1或R1’所示的基團(tuán)，優(yōu)選列舉的是，式(2)所示基團(tuán)-(CH2)n-P-Q (2)(式中、n是0～10的整數(shù)、P是 -O-、 -S-、-CO-NH-、-NH-CO-或-CO-NH-CO-，Q表示H或上述X所示的C1-20烷基。)另外，P可以是-CO-。
另外，P也可以是-S-S-、或-NH-CS-。另外，在上述所有-NH-中，H可被C1～35的飽和或不飽和烷基、C6～20的芳基、C7～13的芳烷基取代。
更優(yōu)選，P是 -O-、-S-、-S-S-、 -CO-NH-、-NH-CO-或 另外，R1或R1’所示的基團(tuán)也可以是不通過P，-(CH2)n與Q鍵合的基團(tuán)。
作為Z、R6或R7所示的低級(jí)烷基，優(yōu)選例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異丁基、正戊基或正己基等C1-6的烷基。
下面表示本發(fā)明涉及的肽類化合物的優(yōu)選方案。
(1)AA1的優(yōu)選方案；(①)氨基酸或肽。例如，可列舉例如，Ser、Gly-Ser或-NH-(CH2)3CH(CH2OH)CO-(2個(gè)氨基酸殘基之間的肽鍵部分是-(CH2)2-時(shí))等。(②)一級(jí)胺。例如，-NH-(CH2)3CH(CH2OH)CH2-(2個(gè)氨基酸殘基之間的肽鍵部分是-(CH2)2-時(shí))、-NH-(CH2)3CH(R1)CH2-(2個(gè)氨基酸殘基之間的肽鍵部分是-(CH2)2-時(shí))[R1定義同前]、-NH-CH(CH2OH)CH2-等。
另外，(①)作為氨基酸或肽，還可列舉NH2-(CH2)4-COOH、NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH、或NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH。
(2)AA2的優(yōu)選方案；(①)氨基酸。例如，可列舉，Ser、高Ser、Cys、高Cys、Asp、Glu、Lys、Ala、Val、Leu、高Leu，Ile、高Ile，鳥氨酸、氨基己二酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、丁硫氨酸、或S-甲基半胱氨酸等，特別優(yōu)選Ser。(②)氨基酸殘基以外的結(jié)構(gòu)；可列舉-CH2-CH(R1)-CO-、-CH2-CH(R1)-CH2-等(R1定義同前)。
特別優(yōu)選，(a)具有疏水性側(cè)鏈的亮氨酸、纈氨酸、正亮氨酸、高亮氨酸、高異亮氨酸、萘基丙氨酸類、色氨酸、苯基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸等、或它們的N-甲基氨基酸。而且，(b)側(cè)鏈中具有可被酰基、烷基、鏈烯基或芳烷基修飾的官能基的、絲氨酸、高絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、己二酸、賴氨酸、鳥氨酸等，和它們的N-甲基氨基酸。
這些(b)的氨基酸側(cè)鏈中，可通過酯、酰胺、二硫化物、醚、硫醚、硫酯，脲或硫脲鍵，鍵合?；?、烷基、鏈烯基或芳烷基。另外，氨基酸的α碳原子也可鍵合烷基、芳烷基。
(3)AA3的優(yōu)選方案；氨基酸或肽。例如，Phe或具有SEQ ID NO.2或3記載的氨基酸序列中，從氨基末端第4個(gè)Phe到第28個(gè)Arg的氨基酸序列的肽或該序列的羧基末端側(cè)的氨基酸是SEQ ID NO.2或3記載的氨基酸序列中，從氨基末端到第5個(gè)Leu為止缺失一個(gè)氨基酸的肽。
作為AA3的例子可列舉，例如、Phe Leu、Phe Leu Ser、Phe Leu Ser Pro、Phe Leu Ser Pro Glu、Phe Leu Ser Pro Glu His、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu SerLys、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys ProPro、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys ProPro Ala Lys、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys ProPro Ala Lys Leu、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys ProPro Ala Lys Leu Gln、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys ProPro Ala Lys Leu Gln Pro、或、Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys ProPro Ala Lys Leu Gln Pro Arg。
另外，在AA3的示例中，不用說，氨基酸可以是L-氨基酸也可以是D-氨基酸。另外，在AA3的上述示例中，例如1～數(shù)個(gè)氨基酸(優(yōu)選氨基酸序列的約3分之1左右)可被非天然氨基酸或非氨基酸單元，例如-NH-(CH2)3CH(CH2OH)--NH-(CH2)3CH(CH2OH)CO--NH-CH(CH2OH)CH2--NH-(CH2)3CH(R1)CH2--CH2-CH(R1)-CO-、或-CH2-CH(R1)-CH2-(上述式中R1定義同前)取代。上述所示基團(tuán)在AA3中有多個(gè)，而且R1所示基團(tuán)是多個(gè)時(shí)，它們可相同或不同。
另外，AA3示例中各氨基酸中的任何一個(gè)都可具有上述R1所示取代基。在AA3所示基團(tuán)中，存在多個(gè)R1時(shí)，它們可相同或不同。
下面表示構(gòu)成肽的氨基酸在側(cè)鏈中具有羥基、巰基、亞氨基或氨基時(shí)的優(yōu)選側(cè)鏈的例子。另外，下面的R8表示具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈。該烷基鏈可與X所示的上述烷基鏈定義相同。
①)Ser的側(cè)鏈；-CH2-O-CO-R8或-CH2-O-R8、②)高Ser的側(cè)鏈；-CH2-CH2-O-CO-R8或-CH2-CH2-O-R8、③)Cys的側(cè)鏈；-CH2-S-CO-R8或-CH2-S-R8、④)高Cys的側(cè)鏈；-CH2-CH2-S-CO-R8或-CH2-CH2-S-R8、⑤)Asp的側(cè)鏈；-CH2-COO-R8或-CH2-CO-NH-R8、⑥)Glu的側(cè)鏈；-CH2-CH2-COO-R8或-CH2-CH2-CO-NH-R8⑦)Lys的側(cè)鏈；-(CH2)4-NH-CO-R8、⑧)氨基己二酸的側(cè)鏈；-CH2-CH2-CH2-COO-R8或-CH2-CH2-CH2-CO-NH-R8、⑨)鳥氨酸的側(cè)鏈；-(CH2)3-NH-CO-R8⑩)對(duì)于側(cè)鏈?zhǔn)峭榛湹陌被崛鏏la、Val、Leu、高亮氨酸、Ile、高異亮氨酸、S-甲基半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、或丁硫氨酸等，同樣地，其烷基可以是上述式(2)所示的修飾的烷基。
另外，本發(fā)明作為優(yōu)選實(shí)施方案含有，具有SEQ ID NO.2或3的氨基酸序列中，從氨基末端到第13、14或15個(gè)氨基酸形成的部分肽的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度提高劑或GH分泌誘導(dǎo)劑。此時(shí)，構(gòu)成部分肽的各氨基酸單元，不一定被化學(xué)修飾。
另外，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是下列肽類化合物。
另外，Ghrelin衍生物是指天然型Ghrelin的化學(xué)結(jié)構(gòu)一部分被改變的肽類化合物，短鏈Ghrelin是指27至28個(gè)氨基酸形成的天然型Ghrelin的一部分氨基酸缺失，由比27至28更少的氨基酸形成的肽。另外，n位的氨基酸殘基是指從氨基末端的第n個(gè)氨基酸殘基。
Ghrelin、或其短鏈Ghrelin衍生物氨基末端的氨基酸，如果該氨基酸的α氨基如果沒被保護(hù)，可以是任何氨基酸(在天然型Ghrelin中氨基末端的氨基酸是甘氨酸)、另外，可以是D-構(gòu)型、L-構(gòu)型中的任何一個(gè)、但是優(yōu)選，丙氨酸、纈氨酸、氨基異丁酸等。
2位殘基可以是任何氨基酸(在天然型Ghrelin中是絲氨酸)、但是優(yōu)選具有小側(cè)鏈的丙氨酸、絲氨酸、組氨酸、正纈氨酸或非氨基酸化合物等。
1位和2位殘基可以是相當(dāng)于氨基酸2個(gè)殘基的δ-氨基酸、例如實(shí)施例所示的5-氨基戊酸或、5-氨基-5-二甲基戊酸、2、5-二氨基戊酸等。
在3位和4位可選擇的氨基酸殘基，可以是D-構(gòu)型或L-構(gòu)型中的任何一個(gè)，也可以是D-或L-N-甲基氨基酸，可以是這些的任意組合。其中優(yōu)選3位是L-構(gòu)型、或3位、4位都是L-構(gòu)型的組合。
在3位和4位可選擇的氨基酸殘基的立體構(gòu)型，可根據(jù)1位和2位的氨基酸序列適當(dāng)選擇。即，優(yōu)選天然Ghrelin的1位和2位的氨基酸序列，Gly-Ser與3位和4位都是L-構(gòu)型，但是其他的氨基酸序列，例如，Aib-His等時(shí)，也可以與3、4位都是D-構(gòu)型。另外，1、2位相當(dāng)于2個(gè)殘基長的δ-氨基酸、例如氨基戊酸時(shí)，3、4位可以是L-構(gòu)型或D-構(gòu)型中的任何一個(gè)。
3位和4位中可選擇的氨基酸殘基，優(yōu)選，D-構(gòu)型或L-構(gòu)型的亮氨酸、纈氨酸、正亮氨酸、高亮氨酸、高異亮氨酸、萘基丙氨酸類、色氨酸、苯基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、以及這些D-、或L-N-甲基氨基酸。
特別是，3位和4位中可選擇的氨基酸殘基，更優(yōu)選，在上述疏水性氨基酸中，例如、萘基丙氨酸類、色氨酸、苯基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸等芳香族疏水性氨基酸。
另外，作為3位和4位中可選擇的氨基酸殘基，優(yōu)選賴氨酸、精氨酸或組氨酸等堿性氨基酸。其中優(yōu)選賴氨酸。
通過這些堿性氨基酸，Ghrelin分子呈堿性，可進(jìn)一步提高Ca提高活性。
3位和4位中可選擇的氨基酸殘基，優(yōu)選在側(cè)鏈中具有可被?；?烷?；?、鏈烯酰基或芳基烷酰基等)、烷基、或芳烷基修飾的官能基的，絲氨酸、高絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、己二酸、賴氨酸、鳥氨酸等。
這些側(cè)鏈中具有反應(yīng)性的氨基酸，可以是D-構(gòu)型或L-構(gòu)型的任何一個(gè)，也可以是對(duì)應(yīng)的D-或L-N-甲基氨基酸，但其中優(yōu)選，3位是L-構(gòu)型、或3位、4位都是L-構(gòu)型的組合。
另外，在氨基酸側(cè)鏈中，可通過氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、酯、酰胺、二硫化物、醚、硫醚或硫酯鍵等，與?；⒗缤轷；?碳原子數(shù)2～35、優(yōu)選6～18、更優(yōu)選8～12)、鏈烯?；?碳原子數(shù)2～35、優(yōu)選6～18、更優(yōu)選8～12)、芳基烷酰基(苯甲?；⒈揭阴；⒈交□；?、萘甲酰基、萘乙酰基或萘基丙?；?；烷基(碳原子數(shù)2～35、優(yōu)選6～18、更優(yōu)選8～12)；或、芳烷基(芐基、苯乙基、苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基、萘基甲基等)鍵合。另外，不通過鍵，3位和4位的α碳原子也可與上述烷基、芳烷基鍵合。
作為3位和4位中可選擇的氨基酸殘基的組合，優(yōu)選3位氨基酸殘基具有疏水性側(cè)鏈，4位的氨基酸是疏水性氨基酸的物質(zhì)。
作為具有疏水性側(cè)鏈的3位氨基酸殘基，優(yōu)選在氨基酸的α碳原子上，(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫醚、酰胺或二硫化物鍵導(dǎo)入碳原子數(shù)1或多數(shù)的飽和或不飽和烷基鏈、或?qū)?b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈的修飾氨基酸。特別優(yōu)選，在氨基酸的α碳原子中導(dǎo)入碳原子數(shù)1以上的飽和烷基鏈的修飾氨基酸。
4位氨基酸的羧基也可以是酰胺、甲基酰胺或乙基酰胺等烷基酰胺、或芐基酰胺、金剛烷酰胺或金剛烷烷基酰胺等芳烷基酰胺。
另外，在烷基酰胺或芳烷基酰胺中，可鍵合氨基或胍基等堿性基。作為該堿性基團(tuán)，可列舉例如，-CONH-CH2CH2-NH2、-CONH-CH2NHCH3，-CONH-CH2CH2CH2-NH-C(NH2)＝NH、-CONHCH2Ph-NH2等。
在4位氨基酸的羧基中，可附加精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸，這些堿性氨基酸可以是D-構(gòu)型、L-構(gòu)型或外消旋體、或D-或L-N-甲基氨基酸中的任何一個(gè)。
這些氨基酸的羧基，如上所述，可以是烷基酰胺或芳烷基酰胺。另外，在烷基酰胺或芳烷基酰胺中，可鍵合氨基、胍基等堿性基團(tuán)。作為該堿性基團(tuán)可列舉上述的堿性基團(tuán)。
5位以后的氨基酸序列，以人Ghrelin、大鼠Ghrelin的5位亮氨酸為基點(diǎn)，到28位為止，可在4位氨基酸上附加任意長的序列。
優(yōu)選可列舉Ghrelin(1-5)、Ghrelin(1-6)，Ghrelin(1-7)，Ghrelin(1-8)，Ghrelin(1-9)，Ghrelin(1-10)、Ghrelin(1-11)。另外，Ghrelin(m-n)是指，具有Ghrelin的氨基末端從第m到第n的氨基酸序列的肽。特別優(yōu)選Ghrelin(1-5)。
其羧基末端優(yōu)選是上述的烷基酰胺、或芳烷基酰胺。
另外，烷基酰胺或芳烷基酰胺中，可進(jìn)一步結(jié)合氨基或胍基等堿性基團(tuán)。作為該堿性基團(tuán)，可列舉上述的堿性基團(tuán)等。
另外，在Ghrelin(1-4)羧基末端部分附加了從5位以后到28位為止的任意氨基酸序列的羧基末端部分缺失的Ghrelin衍生物的羧基末端氨基酸中，可附加精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸。
這些堿性氨基酸可以是D-構(gòu)型、L-構(gòu)型或外消旋體、或D-或L-N-甲基氨基酸。
另外，這些堿性氨基酸的羧基可以是上述的烷基酰胺、或芳烷基酰胺。烷基酰胺或芳烷基酰胺，可進(jìn)一步與氨基或胍基等堿性基團(tuán)結(jié)合。作為該堿性基團(tuán)，可列舉上述堿性基團(tuán)等。
作為特別優(yōu)選的方案，可列舉Ghrelin(1-5)、Ghrelin(1-6)，Ghrelin(1-7)的羧基末端氨基酸是D-構(gòu)型、L-構(gòu)型、或?qū)?yīng)的D-或L-N-甲基氨基酸的情況。
另外，5，6，7位的殘基中可附加精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸，這些氨基酸可以是D-構(gòu)型、L-構(gòu)型或外消旋體、或D-、或L-N-甲基氨基酸。
另外，這些堿性氨基酸的羧基可以是，上述的烷基酰胺、或芳烷基酰胺。烷基酰胺或芳烷基酰胺中可進(jìn)一步結(jié)合氨基或胍基等堿性基團(tuán)。作為該堿性基團(tuán)，例如、可列舉上述堿性基團(tuán)等。
本發(fā)明涉及的肽類化合物，如上所述，羧基末端是烷基酰胺或芳烷基酰胺時(shí)，可以是該烷基或芳烷基進(jìn)一步結(jié)合氨基的酰胺衍生物，這是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案。具體地說，可列舉羧基末端是氨基乙酰胺的情況。
如上所述，羧基末端是酰胺體或酰胺衍生物的本發(fā)明涉及的肽類化合物，在生物體內(nèi)拮抗羧基肽酶類引起的酶分解中也是有用的化合物。
同樣地，含有N-甲基氨基酸的本發(fā)明的肽類化合物，由于具有酶拮抗性，因此也是有用的化合物。
本發(fā)明的肽類化合物，可用常規(guī)方法得到。例如，上述的從天然原料分離，或通過重組DNA技術(shù)和/或化學(xué)的合成制造。另外，在需要對(duì)氨基酸殘基修飾(例如，?；?時(shí)，可按照本身公知的方法進(jìn)行修飾反應(yīng)。
本發(fā)明的肽類化合物，更具體地說，通過具有編碼本發(fā)明肽的DNA表達(dá)載體，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從該培養(yǎng)物收集目的肽，可得到本發(fā)明涉及的肽類化合物。
通過選擇該宿主細(xì)胞，可得到在該細(xì)胞內(nèi)，目的肽被?；刃揎椀幕衔铩Ａ硗?，在該肽未被修飾時(shí)，可按照公知的方法，進(jìn)行?；刃揎椃磻?yīng)。在?；磻?yīng)中可使用脂肪酶等酶。
作為編入基因的載體，可列舉例如，大腸桿菌載體(pBR322、pUC18、pUC19等)、枯草桿菌載體(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母載體(YEp型、YRp型、YIp型)、或動(dòng)物細(xì)胞載體(反轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒等)等，其他的載體，只要在宿主細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定地保持基因，都可以使用。該載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。作為將目的基因編入質(zhì)粒的方法或?qū)胨拗骷?xì)胞的方法，可使用例如，MolecularCloninng(Sambrook et al.，1989)中記載的方法。
為了在上述質(zhì)粒中表達(dá)目的肽基因，在該基因上游連接啟動(dòng)子使之具有機(jī)能。
作為在本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子，只要是相對(duì)于表達(dá)目的基因所用的宿主細(xì)胞合適的啟動(dòng)子都可以。例如，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是埃希氏桿菌屬(Escherichia屬)時(shí)，可使用lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子，lpp啟動(dòng)子、λPL啟動(dòng)子，recA啟動(dòng)子等；是芽胞桿菌屬(Bacillus屬)時(shí)，可使用SPO1啟動(dòng)子、SPO2啟動(dòng)子等；是酵母時(shí)，可使用GAP啟動(dòng)子，PHO5啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子等；是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可使用SV40由來的啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒由來的啟動(dòng)子等。
使用含有如上得到的目的基因的載體，將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。作為宿主細(xì)胞，可使用細(xì)菌(例如、埃希氏桿菌屬(Escherichia屬)、芽胞桿菌屬(Bacillus屬)等)、酵母(酵母屬(Saccharomyces屬)、Pichia屬、念珠菌屬(Candida屬)等)、動(dòng)物細(xì)胞(CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等)等。作為培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基是合適的，特別優(yōu)選該培養(yǎng)基中含有培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長發(fā)育所必須的碳源、氮源等?？筛鶕?jù)需要添加維生素類、生長促進(jìn)因子、血清等。
為了直接制造脂肪酸修飾肽，優(yōu)選，具有可在適當(dāng)位置切斷該肽前體多肽的處理·蛋白酶活性，具有酰化該肽中的絲氨酸殘基活性的細(xì)胞。具有這樣的處理·蛋白酶活性和?；z氨酸活性的宿主細(xì)胞，用含有編碼該前體多肽的cDNA的表達(dá)載體，對(duì)該宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過確認(rèn)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生具有Ca提高活性或GH分泌誘導(dǎo)活性的脂肪酸修飾肽，可進(jìn)行選拔。
培養(yǎng)后，可用常規(guī)方法從培養(yǎng)物分離純化本發(fā)明涉及的肽。例如，從培養(yǎng)菌體或細(xì)胞萃取目的物質(zhì)時(shí)，可在培養(yǎng)后，收集菌體或細(xì)胞，將其懸浮于含有蛋白質(zhì)變性劑(鹽酸胍等)緩沖液中，用超聲波等將菌體或細(xì)胞破碎后，進(jìn)行離心分離。然后，從上清液純化目的物質(zhì)，可根據(jù)目的物質(zhì)的分子量、溶解度、電荷(等電點(diǎn))、親和性等，適當(dāng)組合使用凝膠過濾、超濾、透析、SDS-PAGE、各種色譜等分離純化方法進(jìn)行。
本發(fā)明涉及的肽類化合物可用常規(guī)方法化學(xué)合成。例如，通過將帶有保護(hù)基的氨基酸用液相法和/或固相法縮合，延長肽鏈，用酸除去保護(hù)基，將所得粗產(chǎn)物用上述純化方法純化得到。用?；富蝓；D(zhuǎn)移酶可選擇性地將目的位置的氨基酸側(cè)鏈?；?。
關(guān)于肽的制造方法，以前已經(jīng)充分建立各種方法，本發(fā)明的肽類化合物的制造也可按照其本身公知的方法容易地制造。例如，可按照古典的肽合成法，也可按照固相法進(jìn)行。
下面舉例說明，并用重組DNA技術(shù)和化學(xué)合成的本發(fā)明肽類化合物的制造方法。
化學(xué)合成氨基末端肽的活性酯，例如、(1)Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Osu、(2)Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Osu、或(3)Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu，分別與通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的羧基末端肽(4)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR、(5)LSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR、或(6)SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR結(jié)合，即，(1)與(4)、(2)與(5)和(3)與(6)結(jié)合，可得到28個(gè)氨基酸形成的肽類化合物。更具體地說，將XXXXZSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR在大腸菌表達(dá)，用Boc2(O)保護(hù)氨基，得到Boc-XXXXZSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR。然后，將氨基酸Z的羧基末端用選擇性酶切出，轉(zhuǎn)換為NH2-SPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR。將該化合物與Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu在中性至弱堿性水溶液中混合，將所得BocGlySer(Bu)Ser(R10)FLSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR用三氟乙酸處理，可得到目的物。
上述氨基酸的一文字標(biāo)記是按照1997年12月10日，株式會(huì)社牛頓出版社發(fā)行的“細(xì)胞的分子生物學(xué)第3版”的記載。
另外，Boc表示叔丁氧羰基，Osu表示N-羥基琥珀酰亞胺的羥基的脫氫物質(zhì)，Bu表示丁基，R10表示上述本發(fā)明涉及的修飾氨基酸的取代基。
作為本發(fā)明肽類化合物的鹽，優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽，可列舉例如與無機(jī)堿形成的鹽，與有機(jī)堿形成的鹽，與無機(jī)酸形成的鹽，與有機(jī)酸形成的鹽，與堿性或酸性氨基酸形成的鹽。
作為與無機(jī)堿形成的鹽的優(yōu)選例子，可列舉，例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等堿土金屬鹽；以及鋁鹽、銨鹽等。
作為與有機(jī)堿形成的鹽的優(yōu)選例子，可列舉與例如三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環(huán)己基胺、N，N′-二芐基亞乙基二胺等形成的鹽。
作為與無機(jī)酸形成的鹽的優(yōu)選例子，可列舉與例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的鹽。
作為與有機(jī)酸形成的鹽的優(yōu)選例子，可列舉與例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸等形成的鹽。
作為與堿性氨基酸形成的鹽的優(yōu)選例子，可列舉與例如精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等形成的鹽，作為與酸性氨基酸形成的鹽的優(yōu)選例子，可列舉與例如天門冬氨酸、谷氨酸等形成的鹽。
這些鹽中，最優(yōu)選鈉鹽、鉀鹽。
本發(fā)明的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其毒性低，具有GH分泌誘導(dǎo)作用，可直接或與本身公知的藥學(xué)上允許的載體、賦形劑、增量劑等混合對(duì)哺乳動(dòng)物(例如，人、小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、牛、馬、豬、猴等)使用。給藥量為，成人靜脈注射時(shí)1天0.01～5mg/kg，優(yōu)選0.04～1.5mg/kg。該量優(yōu)選1天分1次～3次給藥。本發(fā)明的肽類化合物，與藥學(xué)上可接受的載體混合，可以片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉末劑等固體制劑；或糖漿劑、注射劑等液體制劑的形式口服或非口服給藥。
作為藥學(xué)上可接受的載體，可使用作為制劑原料慣用的各種有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì)，在固體制劑中可混合賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑；在液體制劑中可混合溶劑、溶解助劑、懸浮化試劑、等滲化試劑、緩沖劑、無痛化試劑等。
另外，根據(jù)需要，還可使用防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等制劑添加物。
作為賦形劑的優(yōu)選例子，可列舉，例如乳糖、白糖、D-甘露糖醇、淀粉、結(jié)晶纖維素、輕質(zhì)硅酸酐等。作為潤滑劑的優(yōu)選例子，可列舉，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石、膠體二氧化硅等。
作為粘合劑的優(yōu)選例子，可列舉，例如結(jié)晶纖維素、白糖、D-甘露糖醇、糊精、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
作為崩解劑的優(yōu)選例子，可列舉，例如淀粉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、クロスカルメロ一ス鈉、羧甲基淀粉鈉等。
作為溶劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。
作為溶解助劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸芐基酯、乙醇、三氨基甲烷、膽甾醇、三乙醇胺、碳酸鈉、檸檬酸鈉等。
作為懸浮化試劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，十八烷基三乙醇胺、十二烷基硫酸鈉、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、氯化新潔爾滅、氯化芐甲乙氧銨、單硬脂酸甘油酯等表面活性劑；例如聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等親水性高分子等。
作為等滲化試劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，氯化鈉、甘油、D-甘露糖醇等。
作為緩沖劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖液。
作為無痛化試劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，芐基醇等。
作為防腐劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、芐基醇、苯乙醇、脫氫乙酸、山梨酸等。
作為抗氧化劑的優(yōu)選例子，可列舉例如，亞硫酸鹽，抗壞血酸等。
上述藥物組合物，可得到與GH給藥效果同等以上的效果，并可減低GH給藥引起的各種副作用。
該藥物組合物可適用的疾病或其效果，作為與GH缺損或低下有關(guān)的，可列舉例如、活化侏儒、正常人的成骨細(xì)胞和骨再構(gòu)成，增強(qiáng)GH缺乏癥成人的肌肉量和肌肉力量，提高GH缺乏癥成人的運(yùn)動(dòng)能力，治愈小兒重度燒傷，在誘發(fā)排卵中與促性腺激素并用，預(yù)防強(qiáng)的松給藥引起的蛋白質(zhì)代謝異常，促進(jìn)重度免疫缺損癥中T細(xì)胞“教育”，抑制老年性體重減少，脂肪組織擴(kuò)大和皮膚萎縮等效果，但是并不限于這些。
另外，與GH缺損或低下無直接關(guān)系的疾病或效果，如實(shí)施例7中記載的，由于該藥物組合物具有增加脈動(dòng)量的效果，因此在心臟器質(zhì)性病變等心臟病的治療中是有效的。
該藥物組合物不僅僅對(duì)人有效果。即，對(duì)于動(dòng)物的生長促進(jìn)，食肉中脂肪的降低等，與GH給藥具有同等以上的效果。
另外，如實(shí)施例13中記載的那樣，由于本發(fā)明的藥物組合物通過腦內(nèi)給藥和靜脈給藥，具有增進(jìn)食欲的作用，因此可作為治療食欲不振或絕食癥的食欲增進(jìn)劑使用。
另外，如實(shí)施例14中記載的那樣，本發(fā)明的藥物組合物具有促進(jìn)胃運(yùn)動(dòng)和胃酸分泌的作用，因此可用作非潰瘍性消化不良，突發(fā)性輕度胃張力缺乏、功能性消化不良和逆流性食道炎等胃功能性疾病的治療劑。
另外，如實(shí)施例15中記載的那樣，通過使用本發(fā)明的藥物組合物靜脈給藥，可確認(rèn)對(duì)骨髓、十二指腸和空腸中的細(xì)胞，起增殖促進(jìn)作用，因此可作為腸道粘膜保護(hù)劑、靜脈營養(yǎng)時(shí)小腸粘膜障礙預(yù)防劑和骨質(zhì)疏松治療劑使用。
另外，上述藥物組合物對(duì)以下疾病的治療或改善身體狀態(tài)是有效的。
例如，在高齡者中刺激處理生長激素的釋放，預(yù)防糖質(zhì)腎上腺皮質(zhì)激素的異化副作用，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松，刺激免疫系統(tǒng)，促進(jìn)損傷治愈，促進(jìn)骨折修復(fù)，治療生長遲緩，治療生長遲緩引起的腎衰竭或功能不全，治療與包括缺乏生長激素的兒童的生理學(xué)上不足狀態(tài)和慢性疾病相關(guān)的不足狀態(tài)，治療肥胖和與肥胖相關(guān)的生長遲緩，治療與プラ一ダ一一ヴイリ綜合征和特納氏綜合征相關(guān)的生長遲緩，促進(jìn)燒傷患者的恢復(fù)和減少住院，治療子宮內(nèi)發(fā)育遲緩，骨格形成異常、高腎上腺皮質(zhì)激素癥和柯興氏綜合征，誘導(dǎo)脈動(dòng)性生長激素釋放，代用緊張患者中的生長激素，治療軟骨形成異常，ヌ一ナン綜合征、精神分裂癥、憂郁癥、阿而茨海默氏病，治愈延遲損傷和治療心理社會(huì)的剝奪，治療肺功能不全和呼吸器官依賴癥，減少大手術(shù)后的蛋白質(zhì)異化反應(yīng)，減少癌癥或艾滋病(AIDS)等慢性疾病引起的蛋白質(zhì)損失和惡液質(zhì)，治療包括胰島細(xì)胞癥的高胰島素血癥，為誘發(fā)排卵的佐劑療法，刺激胸腺發(fā)育和預(yù)防隨年齡增長的胸腺功能衰退，治療免疫抑制患者，提高肌肉強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)性，維持高齡者的皮膚厚度、代謝永恒性、腎永恒性，刺激成骨細(xì)胞、骨再造形和軟骨生成等。
另外，在動(dòng)物中可期待以下的效果?？闪信e例如，增加動(dòng)物的生長速度、增加動(dòng)物的產(chǎn)乳或產(chǎn)毛、刺激寵物動(dòng)物的免疫系統(tǒng)、治療寵物動(dòng)物的高齡疾病、促進(jìn)家畜的生長以及促進(jìn)綿羊產(chǎn)毛等。
將本發(fā)明的具有Ca提高活性或GH分泌誘導(dǎo)活性的脂肪酸修飾肽作為抗原的抗體，可用公知的方法獲得。該抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，它們的獲得可使用公知的方法。另外，使用這些抗體的脂肪酸修飾肽的測(cè)定方法和利用該測(cè)定方法的測(cè)定試劑盒的制作也可使用已知的方法。
另外，如實(shí)施例17中記載的那樣，制備相對(duì)于Ghrelin的氨基末端側(cè)和羧基末端側(cè)肽的抗體，利用前者對(duì)修飾3位絲氨酸的脂肪酸的特異性識(shí)別，可分別定量在脂肪酸上修飾的Ghrelin和脫脂肪酸的Ghrelin。
與該Ghrelin氨基末端側(cè)相對(duì)的抗體或與羧基末端側(cè)肽相對(duì)的抗體，可用公知的方法取得，可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
同樣地，對(duì)于氨基末端第3位置具有修飾氨基酸的本發(fā)明的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，可制備特異性地識(shí)別第3位氨基酸殘基側(cè)鏈(優(yōu)選為脂肪酸)與肽的氨基末端側(cè)結(jié)合的抗體。另外，同樣地，對(duì)于本發(fā)明涉及的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，也可制備與具有修飾氨基酸的肽特異性結(jié)合的抗體。
如上所述，包含如下抗體的檢測(cè)試劑盒也包括在本發(fā)明中特異性識(shí)別修飾氨基酸側(cè)鏈的抗體和，識(shí)別修飾氨基酸或/和非氨基酸化合物以外的氨基酸或不含它們的肽的抗體，優(yōu)選針對(duì)于本發(fā)明涉及的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的羧基末端側(cè)肽的抗體。
另外，使用檢查試劑盒，將修飾氨基酸，優(yōu)選具有?；陌被岬谋景l(fā)明肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與，不含修飾氨基酸的本發(fā)明肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽分別檢出的測(cè)定方法，也包括在本發(fā)明中。
關(guān)于上述測(cè)定方法或檢查試劑盒，具體方案如下所述。但是，本發(fā)明并不限于下列方案。
即，作為上述測(cè)定方法，可列舉例如(i)被檢液中本發(fā)明肽類化合物的定量法，其特征在于，使針對(duì)于本發(fā)明肽類化合物等的抗體與被檢液中的被檢物質(zhì)和標(biāo)識(shí)化的本發(fā)明肽類化合物等競(jìng)爭反應(yīng)，測(cè)定與該抗體結(jié)合的標(biāo)識(shí)化的本發(fā)明肽類化合物等的比例，和(ii)被檢液中本發(fā)明蛋白質(zhì)等的定量法，其特征在于，在被檢液和載體上不溶化的本發(fā)明抗體和標(biāo)識(shí)化的其它本發(fā)明抗體同時(shí)或連續(xù)反應(yīng)中，測(cè)定不溶化載體上的標(biāo)識(shí)劑活性或/和不溶化載體上未捕捉的標(biāo)識(shí)劑的活性。在上述(i)和(ii)的定量法中，優(yōu)選為，一種抗體是識(shí)別本發(fā)明蛋白質(zhì)等氨基末端側(cè)的抗體，另外抗體是與本發(fā)明蛋白質(zhì)等羧基末端側(cè)反應(yīng)的抗體。
另外，作為本發(fā)明肽類化合物等的測(cè)定方法，除了使用對(duì)該化合物的單克隆抗體(以下、有時(shí)稱為抗蛋白質(zhì)抗體)定量對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)等以外，也可通過組織染色等進(jìn)行檢測(cè)。
在這些目的中，可使用抗體分子本身，另外，也可使用抗體分子的F(ab’)2、Fab’、或Fab組分。
對(duì)于使用上述抗體的本發(fā)明肽類化合物等的定量法，沒有特別的限制，只要是可通過化學(xué)或物理手段檢測(cè)出與被測(cè)定液中的抗原量(例如，蛋白質(zhì)量)相應(yīng)的抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合體的量，將其通過使用含有已知量抗原的標(biāo)準(zhǔn)液制做的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的測(cè)定方法都可以。優(yōu)選使用例如，腎測(cè)定法、競(jìng)爭法、免疫測(cè)定法和夾心法，但是從靈敏度、特異性方面考慮，特別優(yōu)選使用后述的夾心法。
本發(fā)明測(cè)定方法中使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)的測(cè)定法中，作為使用的標(biāo)識(shí)劑，可使用例如，放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。
作為放射性同位素，可使用例如、125I、131I、3H或14C等。
作為上述酶，優(yōu)選穩(wěn)定的相對(duì)活性大的酶，可列舉例如、β-半乳糖苷酶、β-糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化酶、蘋果酸脫氫酶等。
作為熒光物質(zhì)，可使用例如，熒光胺、異硫氰酸熒光素等。
作為發(fā)光物質(zhì)，可使用例如，魯米諾、魯米諾衍生物、蟲熒光素、光澤精等。
另外，在抗體或抗原與標(biāo)識(shí)劑結(jié)合中，可使用生物素-抗生物素蛋白類。
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。分子生物學(xué)的手法沒有特別限定，依照Molecular Cloninng(Sambrook et al.，1989)。實(shí)施例1.制作表達(dá)GHS-R的細(xì)胞株和測(cè)定Ca提高活性為了測(cè)定由GH分泌誘導(dǎo)因子(GHS)與GHS受體(GHS-R)結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的提高(Ca提高活性)，如下制作表達(dá)大鼠GHS-R的細(xì)胞株。大鼠GHS-R的全長cDNA是以大鼠腦的cDNA為模板，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng))得到的。從公知的大鼠GHS-R堿基序列[K.K.Mckee，et al，Molecular Endocrinology11，415-423(1997).]，合成了以下堿基序列形成的有義和反義引物。
有義引物5’-ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3’反義引物5’-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3’
將擴(kuò)增的cDNA接于載體pcDNAIII(Invitrogen社)，制做表達(dá)載體GHSR-pcDNAIII。用該表達(dá)載體將CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在含有1μg/ml的G418培養(yǎng)基上選擇穩(wěn)定表達(dá)GHS-R的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。選擇的細(xì)胞株CHO-GHSR62對(duì)10-10～10-9M的GHRP-6(促生長激素釋放的六肽(Growth Hormone-Releasing hexapeptide))應(yīng)答。用FLIPR系統(tǒng)(Molecular Device社)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化(Ca提高活性)。測(cè)定前，將4×104的CHO-GHSR62細(xì)胞植入壁面黑色的96孔微量培養(yǎng)板(Corning社)中，培養(yǎng)12～15小時(shí)。將細(xì)胞與4μM的熒光色素Fluo4(Molecular Probe社)一起保持1小時(shí)，用含有20mM Hepes(〔N-2-羥乙基〕-哌嗪-N-〔2-乙磺酸〕)和2.5mM羧苯磺丙胺的Hank’sBSS(Hank’s平衡鹽溶液)洗滌4次，通過添加試樣，測(cè)定熒光的變化，由此測(cè)定Ca提高活性。實(shí)施例2.內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)肽的純化使用實(shí)施例1中記載的CHO-GHSR62細(xì)胞，對(duì)大鼠的各種組織·臟器調(diào)查Ca提高活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大鼠胃的肽萃取物即使是0.5mg時(shí)，也具有強(qiáng)的Ca提高活性。因此，使用多種色譜，從大鼠胃萃取物按照以下方法純化具有Ca提高活性的肽。
為了使混在其中的蛋白酶失活，將新鮮大鼠胃40g在5倍量的沸騰水中煮沸5分鐘。冷卻后，將煮沸的試樣調(diào)到于1M AcOH-20mMHCl中，用ポリトロン·混合器萃取肽。將萃取液在11,000rpm離心30分鐘，上清液用蒸發(fā)器濃縮至約40ml。向濃縮液中加入丙酮達(dá)到66％，進(jìn)行丙酮沉淀，除去生成的沉淀后，蒸發(fā)上清液中的丙酮。將上清液加到用0.1％TFA(三氟乙酸)平衡化的10g Sep-Pak C18筒(Waters社制)中，用10％CH3CN/0.1％TFA洗凈后，用60％CH3CN/0.1％TFA洗脫。蒸發(fā)洗脫液的溶劑后，進(jìn)行冷凍干燥。將試樣溶解于1M AcOH，吸附于用1M AcOH平衡化的SP-Sephadex C-25(H+型)。通過用1M AcOH、2M吡啶和2M吡啶-AcOH(pH5.0)梯度洗脫，分別得到SP-I、SP-II和SP-III 3個(gè)組分。將SP-III組分放在Sephadex G-50凝膠過濾柱上，對(duì)各個(gè)組分的一部分，使用CHO-GHSR62細(xì)胞測(cè)定Ca提高活性。Sephadex G-50柱色譜的結(jié)果如

圖1所示，將相當(dāng)于分子量約3,000的活性組分(圖1a中，餾分43-48)用TSK CM-2SW柱(4.6×250mm、Tosoh社制)在pH6.4，通過CM-離子交換的HPLC(高效液相色譜)分餾。將用CM-HPLC得到的活性組分，使用同一柱，在pH4.8進(jìn)行二次CM-HPLC分餾(圖1b)。將活性組分(圖1b中、洗脫時(shí)間55-56分)用μBondasphere C-18柱(3.9×150mm、Waters社制)在逆相HPLC純化至單一組分。從40g大鼠純化出16μg具有Ca提高活性的肽，命名為Ghrelin。實(shí)施例3.Ghrelin的結(jié)構(gòu)解析將純化的大鼠的Ghrelin氨基酸序列用肽定序器(ABI 494、AppliedBiosysytems社)測(cè)定。Ghrelin是由Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu HisGln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu GlnPro Arg(Xaa是未鑒定氨基酸)序列形成的28個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽。Xaa在大鼠cDNA的堿基序列中是Ser，了解到在該肽中Ser可接受任何修飾。
因此，用肽合成機(jī)(ABI 433A、Applied Biosystems社)化學(xué)合成氨基末端第3個(gè)絲氨酸未被修飾的非修飾Ghrelin。由于非修飾合成Ghrelin的逆相HPLC的洗脫時(shí)間與天然型Ghrelin有很大差異(圖2a)，因此可知非修飾合成Ghrelin比天然型Ghrelin有顯著的親水性。
從以上結(jié)果可知，天然型Ghrelin氨基末端第3個(gè)絲氨酸(絲氨酸3)是被疏水性殘基修飾的。
為了明確絲氨酸3的修飾基團(tuán)，用電噴離子化質(zhì)譜分析儀(ESI-MS)分析，純化的Ghrelin。觀察的天然型Ghrelin的分子量(3314.9±0.7)比從cDNA堿基序列得到的非修飾Ghrelin肽的分子量(3188.5)大126。從以上結(jié)果可知，天然型Ghrelin是絲氨酸3的羥基被正辛酰(C80)脂肪酸修飾。
為確認(rèn)此事，化學(xué)合成正辛酰(C80)Ghrelin肽，用逆相HPLC調(diào)查洗脫時(shí)間。正辛酰(C80)肽的化學(xué)合成是通過將絲氨酸3的羥基以外的所有官能基被保護(hù)的肽，用肽合成機(jī)(ABI 433A、AppliedBiosystems社)，使用Fmoc固相法合成，絲氨酸3的羥基在4-(二甲基氨基)吡啶存在下，用正辛酸和乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺?；铣?。合成的正辛酰肽與純化的天然型Ghrelin具有同樣的洗脫時(shí)間(圖2a)。而且，將合成正辛酰肽和天然型Ghrelin通過糜蛋白酶處理得到的從氨基末端到第4個(gè)為止的肽片段(Gly 1-Phe 4)，在逆相HPLC中顯示同樣的洗脫時(shí)間。
從以上結(jié)果可得到，大鼠的天然型Ghrelin具有SEQ ID NO.2中記載的氨基酸序列，是絲氨酸3的羥基被正辛酸(辛酸)?；慕Y(jié)構(gòu)(圖2c)的結(jié)論。
另外，從人胃萃取物純化人Ghrelin，可知其結(jié)構(gòu)是具有SEQ IDNO.3記載的氨基酸序列，是從氨基末端第3個(gè)絲氨酸側(cè)鏈的羥基被正辛酸(辛酸)?；慕Y(jié)構(gòu)(圖4a)。
另外，上述大鼠和人的Ghrelin的結(jié)構(gòu)，是圖1b中活性組分中最初的峰組分(洗脫時(shí)間55-56分)純化的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，但是將圖1b其它活性組分純化后，用上述同樣的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果可知，修飾絲氨酸3的脂肪酸除辛酸(C80)以外，還有辛酸的單烯酸(C81)、癸酸(C100)及其單烯酸(C101)、和十二烷酸(C120)及其單烯酸(C121)。
另外，將雞、鱔魚和青蛙的Ghrelin與實(shí)施例2同樣從胃萃取物中純化，進(jìn)一步與實(shí)施例3同樣進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。可知其結(jié)構(gòu)是，雞的Ghrelin具有SEQ ID NO.25記載的氨基酸序列、鱔魚的Ghrelin具有SEQ ID NO.26記載的氨基酸序列、青蛙的Ghrelin具有SEQ ID NO.27記載的氨基酸序列，每一個(gè)都是從氨基末端第3個(gè)的絲氨酸側(cè)鏈的羥基被正辛酸(辛酸)酰化的結(jié)構(gòu)。
另外，將爪蟾屬、鮭屬和狗的Ghrelin與實(shí)施例2一樣從胃萃取物純化，進(jìn)一步與實(shí)施例3同樣進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。
可知其結(jié)構(gòu)是，爪蟾屬的Ghrelin具有SEQ ID NO.28記載的氨基酸序列、鮭屬的Ghrelin具有SEQ ID NO.29和30記載的氨基酸序列、狗的Ghrelin具有SEQ ID NO.31記載的氨基酸序列，每一個(gè)都是從氨基末端第3個(gè)的絲氨酸側(cè)鏈或蘇氨酸側(cè)鏈的羥基被正辛酸(辛酸)?；慕Y(jié)構(gòu)。
另外，從鮭屬可得到SEQ ID NO.29記載的23個(gè)氨基酸殘基形成的Ghrelin-23和，SEQ ID NO.30記載的20個(gè)氨基酸殘基形成的Ghrelin-23。實(shí)施例4.Ghrelin的Ca提高活性天然型Ghrelin和正辛酰修飾的合成Ghrelin具有Ca提高活性，但是非修飾合成Ghrelin沒有顯著的顯示Ca提高活性(圖2b)。另外，由于正辛酸或正辛酸與非修飾的合成Ghrelin的混合物不顯著地顯示Ca提高活性，因此可知天然型Ghrelin的正辛酸基是Ca提高活性的重要結(jié)構(gòu)。以后，Ghrelin是指[O-正辛酰-絲氨酸3]-Ghrelin(圖2c)。
Ghrelin、在CHO-GHSR62細(xì)胞中，比GHRP-6顯示更高的提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性(Ca提高活性)，但是GHRH(GH釋放激素、在圖3a是GRF)不顯示Ca提高活性(圖3b)。從10-11M可確認(rèn)Ghrelin的Ca提高活性，EC50是2.5nM。在GHS-R的特異性拮抗劑[D-Lys 3]-GHRP-6[R.G.Smith，et al.，Science 260，1640-1643(1993)]10-4M的存在下，Ghrelin對(duì)Ca的提高活性被抑制，在高濃度的Ghrelin，無拮抗劑存在下恢復(fù)Ca提高活性(圖3b)。以上結(jié)果顯示，Ghrelin的Ca提高活性被GHS-R的特異性拮抗劑拮抗性抑制。實(shí)施例5.Ghrelin前體cDNA和其在各種臟器的表達(dá)Ghrelin的氨基酸序列都不顯示與公知的任何肽氨基酸序列相同性，但是在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同種性檢索時(shí)，確認(rèn)與大鼠EST(Expressed Sequence Tag)序列的一個(gè)(GenBank受理序號(hào)AI549172)相同。以該EST序列為基礎(chǔ)合成以下的PCR引物。
有義引物5’-TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA-3’反義引物5’-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3’以大鼠胃的cDNA為模板，使用上述2個(gè)引物進(jìn)行RT-PCR。PCR的條件是，1個(gè)周期是在98℃10秒、55℃30秒、72℃1分，進(jìn)行35個(gè)周期。將擴(kuò)增的DNA片段作為探針，篩選大鼠胃cDNA庫。篩選約2×105個(gè)重組噬菌體，得到編碼大鼠由來的Ghrelin全長cDNA。
大鼠GhrelincDNA是由SEQ ID NO.6記載的501堿基形成，編碼由117個(gè)氨基酸(圖4a)形成的前原Ghrelin(prepro-ghrelin)。Ghrelin前體的氨基末端的23個(gè)氨基酸殘基具備信號(hào)肽的性質(zhì)。Ghrelin是從甘氨酸24開始，成熟型Ghrelin的最后2個(gè)氨基酸(Pro-Arg)被蛋白酶切斷的序列。
使用大鼠GhrelincDNA，在低嚴(yán)格條件下篩選人胃cDNA庫，得到全長人GhrelincDNA。人胃cDNA庫是從人胃poly(A)+RNA(Clontech社)，使用cDNA合成試劑盒(Pharmacia社)制做的。所得的全長人Ghrelin cDNA是由SEQ ID NO.7記載的511個(gè)堿基形成，編碼從117個(gè)氨基酸(圖4a)形成的人前原Ghrelin(prepro-ghrelin)。大鼠和人的Ghrelin前體的氨基酸序列顯示82.9％的同一性，由此可判明Ghrelin在生物種間高度保守。
為了弄清Ghrelin的組織間分布，解析從大鼠的各種組織分離的poly(A)+RNA(圖4b)。根據(jù)大鼠組織的Northern印跡分析，在胃中可確認(rèn)0.62kb的Ghrelin前體mRNA。雖然在心室(Ventricle)中也確認(rèn)了2條微弱帶，但它們是6.2kb和1.2kb的mRNA，比胃的mRNA大，推定是與胃不同的mRNA的剪接。從以上的結(jié)果可知，Ghrelin的主要表達(dá)部位是胃。實(shí)施例6.Ghrelin對(duì)下垂體激素分泌的効果在體外和體內(nèi)研究Ghrelin是否具有GH分泌誘導(dǎo)活性。首先，作為體外測(cè)定，調(diào)查Ghrelin對(duì)下垂體前葉初期培養(yǎng)細(xì)胞的効果。從4周齡的雄性SD大鼠采取下垂體前葉，用膠原酶處理分散后，收集細(xì)胞，用含有10％FCS(胎牛血清)和抗生物質(zhì)的DMEM(Dulbecco’smodified Eagle’s Medium)培養(yǎng)基洗滌2次，懸浮于DMEM培養(yǎng)基中，配制下垂體前葉初期培養(yǎng)細(xì)胞。將5×104個(gè)細(xì)胞植入用聚-D-賴氨酸涂層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)3～4天。將培養(yǎng)液用含有0.1ml試樣的DMEM培養(yǎng)基交換，在37℃保持15分鐘。采集培養(yǎng)液的一部分，通過放射免疫測(cè)定，測(cè)定培養(yǎng)液中各種下垂體激素的濃度。下垂體激素中，GH、FSH、LH、PRL、TSH使用Biotrak/Amersham社制的試劑盒，ACTH使用Peninsula Laboratories社制的高靈敏度EIA試劑盒。
如果將Ghrelin添加到下垂體前葉初期培養(yǎng)細(xì)胞中，可確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的提高，非修飾合成Ghrelin雖然弱但可確認(rèn)具有Ca提高活性(圖5a)。該結(jié)果顯示，Ghrelin和非修飾合成Ghrelin對(duì)垂體細(xì)胞直接作用。接著，使用垂體前葉初期培養(yǎng)細(xì)胞調(diào)查Ghrelin的GH分泌誘導(dǎo)活性時(shí)，通過添加10-6M的Ghrelin，培養(yǎng)液中只有GH濃度以濃度依賴性增加，確認(rèn)其它的下垂體激素(FSH、LH、PRL、TSH)的濃度不增加(圖5b)。
在體內(nèi)調(diào)查Ghrelin的GH分泌誘導(dǎo)活性。將合成Ghrelin10μg對(duì)雄性大鼠(250g)靜脈注射后，直到60分鐘為止按時(shí)間采取血樣，通過上述放射免疫測(cè)定來測(cè)定血漿中的垂體激素濃度。垂體激素中，只有GH向血液中釋放，Ghrelin靜脈注射后5～10分鐘達(dá)到最高值。從該結(jié)果可知，從胃釋放到血液中的Ghrelin作用于垂體前葉細(xì)胞，向血液中釋放GH，可確認(rèn)Ghrelin是未鑒定的特異性的內(nèi)在性GH分泌誘導(dǎo)物質(zhì)。實(shí)施例7.大鼠心脈動(dòng)量的增加使用麻醉大鼠，調(diào)查對(duì)心血管系統(tǒng)急性給藥Ghrelin的効果。使用體重220-250g的Wistar系雄性大鼠(ケアリ一)，為研究對(duì)心血管系統(tǒng)急性給藥Ghrelin的効果，將大鼠隨機(jī)分為4組(10，1，0.5，0.2μg給藥組)。Ghrelin用生理鹽水稀釋，對(duì)1只大鼠的給藥量調(diào)整為10、1、0.5、0.2μg，為測(cè)定心輸出量，從插入右總靜脈中的注射管(PE50)急性給藥120μl。
作為動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，測(cè)定全身血壓、心輸出量，進(jìn)一步算出末梢血管抵抗值。將大鼠用戊巴比妥麻醉后，背位固定。為測(cè)定平均血壓，在右大腿動(dòng)脈插入裝滿肝素的聚乙烯插管(PE50)。心輸出量的測(cè)定使用熱稀釋式心輸出量計(jì)(CARDIOTHER M500R)測(cè)定。在右總靜脈插入裝滿生理鹽水的注射管(PE50)，留在右心室內(nèi)。從右總動(dòng)脈插入微型導(dǎo)管，留在大動(dòng)脈起始部位。注入液使用室溫(25℃)的生理鹽水100μl。按下熱稀釋式心輸出量計(jì)的MEASURE開關(guān)的同時(shí)，注入注入液(生理鹽水100μl)，測(cè)定心輸出量。測(cè)定進(jìn)行5次，取其平均值作為心輸出量。測(cè)定Ghrelin給藥前，給藥后1、5、15、30分鐘的平均血壓和心輸出量值。末梢血管抵抗用平均血壓除心輸出量來計(jì)算出。
表1
表中、SEM表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard Error Means)。
表2
表中、SEM表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard Error Means)。
在Ghrelin1μg給藥組(表1)和Ghrelin10μg給藥組(表2)中，在給藥后1分鐘和5分鐘確認(rèn)了心輸出量的增加。實(shí)施例8.各種起源的Ghrelin和Ghrelin-27的分離從大鼠胃萃取物，按照實(shí)施例2記載的方法，以Ca提高活性為指標(biāo)，純化Ghrelin。將二次CM-HPLC的活性組分(圖1b中、洗脫時(shí)間59分鐘)用μBondasphere C-18柱(3.9×150mm、Waters社制)的逆相HPLC純化至單一組分。將該組分用電噴離子化質(zhì)譜分析機(jī)(ESI-MS)分析的結(jié)果，觀測(cè)到分子量(3187.2±0.9)的峰，但是該值比28個(gè)氨基酸形成的辛酸(C8)修飾的天然型Ghrelin小約126。用肽·定序器(ABI 494、Applied Biosysytems社)確定該肽的氨基酸序列時(shí)，為Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg LysGlu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg(Xaa為未鑒定氨基酸)的序列形成的27個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽。即，是28個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ghrelin從氨基末端第13或14谷氨酰胺缺失1個(gè)的氨基酸序列形成的。因該肽的Ca提高活性，如實(shí)施例9所示，與28個(gè)氨基酸的Ghrelin一樣，命名為Ghrelin-27。與大鼠的情況相同，從人的胃萃取物也分離出人·Ghrelin-27，確認(rèn)是SEQ ID NO.11記載的氨基酸序列形成的。另外，將上述用二次CM-HPLC的64-65分鐘的峰組分純化，用電噴離子化質(zhì)譜分析機(jī)(ESI-MS)分析的結(jié)果，觀測(cè)到分子量(3341.4±0.9)的峰。由于該脂肪酸修飾肽是28個(gè)氨基酸形成的，因此可知是從Ghrelin(28個(gè)氨基酸)的氨基末端第3個(gè)的絲氨酸被癸酸(C10)修飾的產(chǎn)物。
編碼Ghrelin27前體的cDNA，可從實(shí)施例5制做的大鼠胃cDNA庫，用實(shí)施例5制做的PCR擴(kuò)增DNA片段作為探針，用噬菌斑雜交法克隆。以確定cDNA的堿基序列，確認(rèn)編碼Ghrelin-27前體的物質(zhì)。所得Ghrelin-27前體cDNA，是由SEQ ID NO.14記載的堿基序列形成的，編碼具有SEQ ID NO.12記載的氨基酸序列的由116個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-27前體。另外，用與上述完全相同的方法，克隆人·Ghrelin-27前體cDNA，可知是由SEQ ID NO.15記載的堿基序列形成的，編碼具有SEQ ID NO.13記載的氨基酸序列的由116個(gè)氨基酸形成的人·Ghrelin-27前體。
編碼豬由來的Ghrelin和Ghrelin-27前體的cDNA，可從豬cDNA庫按照實(shí)施例5記載的方法，使用實(shí)施例5記載的PCR擴(kuò)增DNA片段作為探針，用噬菌斑雜交法克隆。以確定所得cDNA克隆的堿基序列，確認(rèn)編碼豬·Ghrelin前體或豬·Ghrelin-27前體的物質(zhì)。所得豬·Ghrelin前體cDNA是由SEQ ID NO.20記載的堿基序列形成的，編碼具有SEQ ID NO.18記載的氨基酸序列的由118個(gè)氨基酸形成的Ghrelin前體。另外，豬·Ghrelin-27前體cDNA是由SEQ ID NO.21記載的堿基序列形成的，編碼具有SEQ ID NO.19記載的氨基酸序列的由117個(gè)氨基酸形成的Ghrelin-27前體。因此，豬·Ghrelin(28個(gè)氨基酸)和豬·Ghrelin-27(27個(gè)氨基酸)，分別由SEQ ID NO.16和17記載的氨基酸序列形成。
編碼鱔魚、爪蟾屬或鮭屬由來的Ghrelin前體的cDNA，可從各種cDNA庫按照實(shí)施例5記載的方法，使用實(shí)施例5記載的PCR擴(kuò)增DNA片段作為探針，用噬菌斑雜交法克隆。從確定所得cDNA克隆的堿基序列，確認(rèn)編碼Ghrelin前體的物質(zhì)。
所得鱔魚·Ghrelin前體cDNA是由SEQ ID NO.36記載的堿基序列形成的，爪蟾屬·Ghrelin前體cDNA是由SEQ ID NO.37記載的堿基序列形成的，鮭屬·Ghrelin前體cDNA是由SEQ ID NO.38或39記載的堿基序列形成的。
另外，從鮭屬得到編碼SEQ ID NO.38記載的Ghrelin-23前體的cDNA和編碼SEQ ID NO.39記載的Ghrelin-20前體的cDNA。
從上述cDNA的堿基序列可知，鱔魚·Ghrelin前體具有SEQ IDNO.32記載的氨基酸序列，爪蟾屬·Ghrelin前體具有SEQ ID NO.33記載的氨基酸序列，鮭屬·Ghrelin前體具有SEQ ID NO.34或35記載的氨基酸序列。
另外，可知從鮭屬，可得到SEQ ID NO.34記載的Ghrelin-23前體的氨基酸序列和SEQ ID NO.35記載的Ghrelin-20前體的氨基酸序列。
?！hrelin前體cDNA用PCR法克隆。即，將具有大鼠、人和豬由來的Ghrelin和Ghrelin-27的保守氨基酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的堿基序列的合成DNA作為引物，以牛胃cDNA庫為模板進(jìn)行PCR。擴(kuò)增的DNA片段具有SEQ ID NO.24記載的堿基序列，編碼SEQ ID NO.23記載的?！hrelin-27前體的一部分。因此，?！hrelin-27具有SEQID NO.22記載的氨基酸序列。另外，在以牛胃cDNA庫為模板的上述PCR擴(kuò)增的DNA片段中，不是編碼Ghrelin(28個(gè)氨基酸)前體的DNA。
大鼠、人和豬的Ghrelin、和大鼠、人、豬和牛的Ghrelin-27的氨基酸非常近似，特別是從氨基末端到第10個(gè)的氨基酸序列，上述7鐘Ghrelin完全一致。實(shí)施例9.各種Ghrelin衍生物的活性比較通過比較大鼠和人由來的Ghrelin，從用各種蛋白酶部分分解的肽片段、或化學(xué)合成的肽的Ca提高活性，求出Ca提高活性必須的核心·氨基酸序列和修飾脂肪酸的鏈長的最佳值。用顯示Ca提高活性最大值的50％活性的Ghrelin的濃度(EC50，nM)表示。因此，EC50值越低，活性越高。
表3 各種Ghrelin衍生物的活性比較來源 序列編號(hào)氨基酸 脂肪酸修飾 Ca提高活性備注(EC50，nM)人3 1-28酰基(C8)2.6 天然型Ghrelin人3 1-15?；?C8)7.0人3 1-11酰基(C8)15大鼠 2 1-28?；?C8)2.9 天然型Ghrelin大鼠 2 1-15?；?C8)8.6大鼠 2 1-11?；?C8)15大鼠 2 1-10?；?C8)19大鼠 2 1-9 酰基(C8)38大鼠 2 1-8 酰基(C8)100大鼠 2 1-4 ?；?C8)480大鼠 2 16-28 酰基(C8)＞10000大鼠 2 (1-12)+(14-28) ?；?C8)2.8 Ghrelin-27大鼠 2 1-28酰基(C16) 3.1大鼠 2 1-28?；?C10) 2.6大鼠 2 1-28酰基(C6)16大鼠 2 1-28?；?C4)280大鼠 2 1-28酰基(C2)780Ghrelin的Ca提高活性存在于氨基末端側(cè)。從氨基末端到第4個(gè)氨基酸為止的肽具有充分的Ca提高活性，但如果是從氨基末端到第10個(gè)氨基酸為止的肽，由于與天然型Ghrelin接近，具有強(qiáng)的Ca提高活性。另外，對(duì)于修飾脂肪酸的鏈長，即使是C2(乙?；?也具有充分的活性，但是C8(辛?；?的Ca提高活性最高，其后即使脂肪酸的碳原子數(shù)為C10(癸?；?、C16增加，推的Ca提高活性也沒有變化。即，修飾氨基末端第3個(gè)絲氨酸的脂肪酸，如果是碳原子數(shù)8以上的，Ca提高活性最強(qiáng)。實(shí)施例10.各種Ghrelin衍生物化合物的合成(1)肽衍生物合成Fmoc-DSer(C8H17)和Fmoc-Ser(C8H17)以外的氨基酸衍生物和合成試劑從パ一キンエルマ一社、ノバビオケム社或渡邊化學(xué)株式會(huì)社購入。肽鏈的延長主要使用パ一キンエルマ一社制的アプライドバイオシステム433A合成儀，按照Boc法、或Fmoc法構(gòu)建保護(hù)的肽衍生物-樹脂。用Boc法得到的保護(hù)肽樹脂，在p-甲酚存在下，用無水氟化氫(HF)脫保護(hù)，游離肽，用于純化。用Fmoc法得到的保護(hù)肽樹脂，用三氟乙酸(TFA)、或用含有各種清除劑的稀釋TFA脫保護(hù)，純化游離的肽。純化用C4或C18的逆相HPLC實(shí)施。純化品，在逆相HPLC確認(rèn)其純度，用氨基酸組成分析和質(zhì)譜分析確認(rèn)構(gòu)造。
本發(fā)明的肽可用通常的肽合成法制造。例如可用「生化學(xué)実験講座1蛋白質(zhì)的化學(xué)」第4卷第2章、第3章(東京化學(xué)同人)、或「統(tǒng)醫(yī)薬品的開発14肽合成」(廣川書店)等的成書中記載的方法制造。因此，本發(fā)明肽的代表性合成例如下所示。具體地說，是?；牡暮铣衫屯榛牡暮铣衫?。另外，人由來的Ghrelin(以下、簡稱為hGhrelin)或大鼠由來的Ghrelin(以下、簡稱為rGhrelin)用胰蛋白酶、或糜蛋白酶、或兩酶依次作用，制備以下的Ghrelin片段(19.Ghrelin(16-28)、20.hGhrelin(1-15)、21.rGhrelin(1-15)、23.hGhrelin(1-11)、24.rGhrelin(1-11)、25.Ghrelin(1-10)、26.Ghrelin(1-9)、27.Ghrelin(1-8)、30.Ghrelin(1-4))，供于分析用HPLC，測(cè)定分離產(chǎn)物的活性。41.[N-乙酰]-Ghrelin(1-10)是按照常規(guī)方法，將Ghrelin(1-10)用N-乙?；牾啺诽幚碇苽?。化合物序號(hào)2.大鼠Ghrelin使用天然物，10.[Ser3(丁?；?]-rGhrelin、11.[Ser3(己?；?]-rGhrelin、12.[Ser3(癸酰基)]-rGhrelin、13.[Ser3(十二烷酰)]-rGhrelin、14.[Ser3(十六烷酰)]-rGhrelin，用與化合物1hGhrelin的合成中使用的同樣方法合成，用于活性測(cè)定。
〔主要縮寫〕
HMP樹脂；4-羥甲基-苯氧甲基樹脂F(xiàn)moc酰胺樹脂；4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基-乙基樹脂PAM樹脂；苯基乙酰氨基甲基樹脂HBTU；2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸鹽TBTU；2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸鹽HOBt；1-羥基苯并三唑DCC；二環(huán)己基碳化二亞胺DIPCI；二異丙基碳化二亞胺TFA；三氟乙酸DIPEA；二異丙基乙基胺TIPS；三異丙基硅烷Fmoc；芴基甲氧羰基Boc；叔丁氧羰基Trt；三苯甲基But；叔丁基Pmc；2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；鵓rl；丙?；鵓hPrl；苯基丙酰基Bzl；芐基Bom；芐氧甲基Tos；甲苯磺?；鵆l-Z；2-氯-芐氧羰基Pis；2-苯基異丙基Mtt；4-甲基三苯甲基DMF；N，N-二甲基甲酰胺NMP；N-甲基吡咯烷酮DMAP；4-二甲基氨基吡啶HOSu；N-羥基琥珀酰亞胺Adod；2-氨基十二碳酸
Aib；2-氨基異丁酸Ape；5-氨基戊酸Cha；環(huán)己基丙氨酸Dap；2，3-二氨基丙酸Nal；萘基丙氨酸Nle；正亮氨酸〔合成中使用的保護(hù)氨基酸〕Fmoc法Boc-Gly，F(xiàn)moc-Gly，F(xiàn)moc-Ser(But)，F(xiàn)moc-Ser(Trt)，F(xiàn)moc-Glu(OBut)，F(xiàn)moc-His(Boc)，F(xiàn)moc-Gln(Trt)，F(xiàn)moc-Arg(Pmc)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)，F(xiàn)moc-Pro，F(xiàn)moc-Leu，F(xiàn)moc-Ala，F(xiàn)moc-Val，F(xiàn)moc-Phe，F(xiàn)moc-DPhe，F(xiàn)moc-Ser(n-C8H17)，F(xiàn)moc-DSer(n-C8H17)，F(xiàn)moc-Cys(n-C8H17)，F(xiàn)moc-Asp(OPis)，F(xiàn)moc-Ser(Bzl)，F(xiàn)moc-Cys(Trt)，F(xiàn)moc-Dap(辛?；?，F(xiàn)moc-2-LNal，F(xiàn)moc-2-DNal，F(xiàn)moc-Nle，F(xiàn)moc-Lys(Mtt)，F(xiàn)moc-Aib-OH，F(xiàn)moc-Asp(O-C7H15)Boc法Boc-Gly，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Ser(Ac)，Boc-Ser(Prl)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-His(Bom)，Boc-Gln，Boc-Arg(Tos)，Boc-Lys(Cl-Z)，Boc-Pro，Boc-Leu，Boc-Ala，Boc-Val，Boc-Phe，Boc-Cys(n-C8H17)，Boc-Ape Boc-Ser(n-C8H17)〔使用的儀器〕(a)分析用HPLC系統(tǒng)儀器；島津LC-10A系統(tǒng)柱；YMC PROTEIN-RP(4.6mmφ×150mm)柱溫度；40℃洗脫液；在0.1％三氟乙酸中、乙腈濃度在20分鐘從0％到50％直線變化。
流速；1mL/分檢測(cè)；UV(210nm)注入量；10～100μl(b)分取用HPLC系統(tǒng)儀器；Waters 600 Multisolvent Delivery System柱；YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm×250mm)YMC-Pack-PROTEIN-RP(5μm，C4，10mm×250mm)YMC-Pack PROTEIN-RP(5μm，C4，20mm×250mm)YMC PROTEIN-RP(4.6mmφ×150mm)洗脫液；在0.1％三氟乙酸中、直線變化適當(dāng)?shù)囊译鏉舛取?br> 流速；10mL/分(內(nèi)徑20mm柱用)、3mL/分(內(nèi)徑10mm柱用)、1mL/分(內(nèi)徑4.6mm柱用)檢測(cè)；210nm，260nm注入；10～2000μl，2000μL以上用泵注入。
(c)質(zhì)譜分析儀儀器；フイニガンMAT TSQ700離子源；ESI檢測(cè)離子方式；正(positive)噴淋電壓；4.5kVキヤピラリ一溫度；250℃移動(dòng)相；0.2％乙酸·甲醇混合液(1∶1)流速；0.2mL/分掃描范圍；m/z 300～1,500(d)氨基酸序列分析儀器；パ一キンエルマ一社制アプライドバイオ系統(tǒng)477A、492型定序器(e)氨基酸組成分析儀器；日立製作所製L-8500型氨基酸分析計(jì)試樣；沒有特別記載，封管中、用6M鹽酸在110℃、水解24小時(shí)。
(2)具有?；z氨酸或?；K氨酸的衍生物的合成例(Fmoc法、羧基末端羧酸)化合物1 hGhrelinGSS(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR將Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Ser(But)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-樹脂。最后，用DCC/HOBt導(dǎo)入Boc-Gly后，所得保護(hù)肽樹脂(1.3g)用1％TFA-5％TIPS-二氯甲烷溶液(15mL)處理30分鐘。過濾收集肽樹脂，用二氯甲烷(30mL)洗滌數(shù)次后，用5％DIEA(10mL)，接著用二氯甲烷(30mL)洗凈。所得脫Trt肽樹脂(約1.3g)用NMP(10mL)泡脹，在DMAP(61.1mg，0.5mmol)存在下，加入辛酸(144.2mg，1.0mmol)、DIPCI(126.2mg，1.0mmol)反應(yīng)8小時(shí)。過濾收集樹脂，用NMP、二氯甲烷洗凈，減壓干燥，得到3位絲氨酸側(cè)鏈被辛?；谋Ｗo(hù)肽樹脂約1.2g。向該物質(zhì)中，加入88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脫保護(hù)試劑(10mL)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚進(jìn)行沉淀。過濾收集沉淀，干燥，得到粗肽約550mg。將本品200mg溶于水10mL中，加入到Y(jié)MC-PackPROTEIN-RP(C4，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中從乙腈0％到54％進(jìn)行60分鐘的線性梯度洗脫(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到120mg目的物。
(3)具有?；z氨酸或酰化蘇氨酸的衍生物的合成例(Fmoc法、羧基末端酰胺體)化合物3 Ghrelin(1-9)-NH2；GSS(CO-C7H15)FLSPEH-NH2將Fmoc-酰胺樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Ser(But)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(But)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-樹脂。最后，向DCC/HOBt導(dǎo)入Boc-Gly之后，所得保護(hù)肽樹脂(約550mg)用1％TFA-5％TIPS-二氯甲烷溶液(10mL)處理30分鐘。過濾收集肽樹脂，用二氯甲烷(30mL)洗滌數(shù)次后，用5％DIEA(10mL)，接著用二氯甲烷(30mL)洗凈。所得脫Trt肽樹脂(約750mg)用NMP(10mL)泡脹，在DMAP(61.1mg，0.5mmol)存在下，加入辛酸(144.2mg，1.0mmol)、DIPCI(126.2mg，1mmol)反應(yīng)4小時(shí)。過濾收集樹脂，用NMP、二氯甲烷洗凈，減壓下干燥，得到3位絲氨酸側(cè)鏈被辛酰化的保護(hù)肽樹脂約800mg。向該物質(zhì)中加入TFA(10mL)，在室溫?cái)嚢?0分鐘。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚進(jìn)行沉淀。過濾收集沉淀，干燥，得到粗肽250mg。將本品約200mg溶于30％乙酸水10mL中，加入到Y(jié)MC-PackPROTEIN-RP(C4，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，從乙腈0％到54％為止進(jìn)行60分鐘的線性梯度洗脫(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到150mg的目的物。
(4)具有酰化絲氨酸或?；K氨酸的衍生物的合成例(Boc法)化合物9[Ser3(丙?；?]-rGhrelin(1-28)；GSS(CO-CH2CH3)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR通過Boc-Arg(Tos)-Pam樹脂(0.75g，0.5mmol)，用生物化學(xué)構(gòu)建保護(hù)大鼠Ghrelin樹脂(4-28)后，在其半量1.4g中，縮合Boc-Ser(CO-CH2CH3)-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Gly-OH。將所得樹脂1.5g用HF∶p-甲酚(8.5mL∶1.5mL)在0℃處理1小時(shí)后，減壓蒸除HF。向剩余物中加入醚，得到671mg粗肽。將該物質(zhì)溶于50％乙酸(AcOH)中，添加到分取用柱YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm×250mm)中，在10mL/min，用含有0.1％TFA的溶液，乙腈濃度在75分鐘內(nèi)從0至95％為止變化洗脫。將含有目的物的組分冷凍干燥，得到粗肽135.8mg。將其中一部分0.5mg添加到Y(jié)MC-A-302柱(C18，4.6mm×150mm)中，在流速1mL/min，乙腈濃度從15％到19％變化，進(jìn)行洗脫。重復(fù)該純化操作，合并目的組分，得到目的物0.41mg。
下面的具有?；z氨酸或?；K氨酸的肽衍生物，可按照上述化合物3或化合物9的制造方法同樣制造。
下面，匯集具有?；z氨酸或?；K氨酸的肽衍生物的質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析結(jié)果。
化合物1.hGhrelinESI-MS 3371.0(理論值3370.9)，氨基酸組成比Ser；3.53(4)，Glx；5.91(6)，Gly；1.02(1)，Ala；1.00(1)，Val；0.96(1)，Leu；2，Phe；1.06(1)，Lys；3.90(4)，His；0.97(1)，Arg；2.87(3)，Pro；3.87(4)化合物3.Ghrelin(1-9)-酰胺ESI-MS [M+H]；1085.7(理論值1085.2)，氨基酸組成比Ser；2.45(3)，Glx；0.98(1)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)，His；1.08(1)，Pro；0.97(1)化合物4.[Ser2(辛?；?，Ser3]-Ghrelin(1-9)-酰胺ESI-MS [M+H]；1085.8(理論值1085.2)，氨基酸組成比Ser；2.46(3)，Glx；0.98(1)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，His；1.09(1)，Pro；0.97(1)化合物5.[Ser2(辛酰基)]-Ghrelin(1-9)-酰胺ESI-MS [M+H]；1211.7(理論值1211.4)，氨基酸組成比Ser；2.48(3)，Glx；1.00(1)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，His；1.11(1)，Pro；0.98(1)化合物8.[Ser3(乙?；?]-rGhrelinESI-MS 3231.0(理論值3230.7)，氨基酸組成比Ser；3.50(4)，Glx；5.90(6)，Gly；0.98(1)，Ala；2.00(2)，Leu；2，Phe；1.01(1)，Lys；4.97(5)，His；0.99(1)，Arg；1.99(2)，Pro；3.99(4)化合物9.[Ser3(丙酰基)]-rGhrelinESI-MS 3245.0(理論值3242.8)，氨基酸組成比Ser；3.42(4)，Glx；5.93(6)，Gly；1.00(1)，Ala；2.00(2)，Leu；2，Phe；1.10(1)，Lys；4.97(5)，His；0.99(1)，Arg；1.99(2)，Pro；3.83(4)化合物15.[Ser3(3-苯基丙?；?]-hGhrelinESI-MS 3377.0(理論值3376.9)，氨基酸酸組成比Ser；3.06(4)，Glx；5.92(6)，Gly；0.93(1)，Ala；0.98(1)，Val；0.99(1)，Leu；2，Phe；1.13(1)，Lys；4.03(4)，His；1.08(1)，Arg；3.00(3)，Pro；3.76(4)化合物16.[Ser3(3-辛烯?；?]-hGhrelinESI-MS 3369.0(理論值3368.9)，氨基酸組成比Ser；3.59(4)，Glx；5.91(6)，Gly；1.00(1)，Ala；1.02(1)，Val；0.99(1)，Leu；2，Phe；1.15(1)，Lys；3.97(4)，His；0.98(1)，Arg；2.93(3)，Pro；3.88(4)化合物28.Ghrelin(1-8)-酰胺ESI-MS[M+H] 948.5(理論值948.1)，氨基酸組成比Ser；2.45(3)，Glx；0.97(1)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；0.97(1)化合物29.Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS[M+H]819.6(理論值819.0)，氨基酸組成比Ser；2.52(3)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.02(1)，Pro；1.09(1)化合物30.Ghrelin(1-6)-酰胺ESI-MS[M+H]；722.4(理論值721.8)，氨基酸組成比Ser；2.47(3)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)化合物31.Ghrelin(1-5)ESI-MS[M+H]636.5(理論值635.8)，氨基酸組成比Ser；1.78(2)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.02(1)化合物32.Ghrelin(1-5)-酰胺ESI-MS[M+H]635.4(理論值634.8)，氨基酸組成比Ser；1.67(2)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，化合物33-2.Ghrelin(1-4)-酰胺ESI-MS[M+H]522.2(理論值521.6)，氨基酸組成比Ser；1.65(2)，Gly；0.99(1)，Phe；1化合物34.Ghrelin(1-3)-酰胺ESI-MS[M+H]375.2(理論值374.4)，氨基酸組成比Ser；1.66(2)，Gly；1化合物35.[Lys8]-Ghrelin(1-8)-酰胺ESI-MS[M+H]947.9(理論值947.1)，氨基酸組成比Ser；2.70(3)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Lys；0.99(1)，Pro；1.00(1)化合物36.[Arg8]-Ghrelin(1-8)-酰胺ESI-MS[M+H]975.8(理論值975.2)，氨基酸組成比Ser；2.70(3)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Arg；0.99(1)，Pro；1.00(1)化合物37.[Lys6]-Ghrelin(1-6)-酰胺ESI-MS[M+H]763.6(理論值762.9)，氨基酸組成比Ser；1.80(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Lys；1.00(1)化合物38.[Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺ESI-MS[M+H]650.5(理論值649.8)，氨基酸組成比Ser；1.79(2)，Gly；0.99(1)，Phe；1，Lys；0.99(1)化合物39.[DPhe4，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺ESI-MS[M+H]650.5(理論值649.8)，氨基酸組成比Ser；1.79(2)，Gly；0.99(1)，Phe；1，Lys；0.99(1)化合物40.[N-氨基戊?；鵠-Ghrelin(3-7)-酰胺ESI-MS[M+H]774.7(理論值774.0)，氨基酸組成比Ser；1.80(2)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Pro；1.00(1)化合物43.[N-甘氨?；鵠-Ghrelin(3-7)-酰胺ESI-MS[M+H]；732.7(理論值731.9)，氨基酸組成比Ser；1.80(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Pro；1.00(1)化合物44.[Leu2]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS[M+H]；845.7(理論值845.1)，氨基酸組成比Ser；1.80(2)，Gly；1.01(1)，Leu；2，Phe；1.02(1)，Pro；0.99(1)化合物45.[His2]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS[M+H]；869.7(理論值869.0)，用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；1.02(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，His；0.95(1)，Pro；0.99(1)化合物46.[Lys2]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS[M+H]；860.7(理論值860.1)，用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；1.04(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Lys；1.00(1)，Pro；1.00(1)化合物47.[Gly2]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS[M+H]；789.5(理論值788.9)，用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；1.14(2)，Gly；2.01(2)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；1.00(1)化合物59.[Thr3(辛?；?]-hGhrelinESI-MS M；3384.0(理論值3384.9)氨基酸組成比Ala；1.02(1)，Arg；2.99(3)，Glx；5.91(6)，Gly；1.02(1)，His；1.00(1)，Leu；2(2)，Lys；4.05(4)，Phe；1.00(1)，Pro；4.06(4)，Ser；2.66(3)，Thr；0.94(1)，Val；0.96(1)化合物60.[Leu2，Thr3(辛?；?]-hGhrelinESI-MS M；3410.0(理論值3411.0)氨基酸組成比Ala；1.01(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.01(1)，His；1.01(1)，Leu；3(3)，Lys；4.02(4)，Phe；1.01(1)，Pro；4.00(4)，Ser；1.81(2)，Thr；0.96(1)，Val；0.97(1)化合物69.[Ser3(4-甲基戊?；?]-hGhrelinESI-MS M；3343.0(理論值3342.9)氨基酸組成比Ala；1.00(1)，Arg；2.97(3)，Glx；5.86(6)，Gly；1.02(1)，His；1.01(1)，Leu；2，Lys；4.00(4)，Phe；1.01(1)，Pro；3.99(4)，Ser；3.54(4)，Val；0.98(1)化合物75.[Lys7]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS [M+H]；850.5(理論值850.0)，氨基酸組成比Ser；2.67(3)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Lys；1.00(1)(5)氨基末端酰化衍生物的合成例化合物6.[N-辛酰基，Ser3]-Ghrelin(1-9)-酰胺；C7H15CO-GSSFLSPEH-NH2將Fmoc-酰胺樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Gly-Ser(But)-Ser(But)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-樹脂。哌嗪處理后，將所得肽樹脂(550mg)用NMP洗凈，在HOBt(135.1mg，1mmol)存在下，加入DIPCI(126.2mg，1mmol)和辛酸(144.2mg，1.0mmol)反應(yīng)4小時(shí)。過濾收集樹脂，用NMP、二氯甲烷洗凈，減壓干燥，得到氨基末端Gly氨基被辛?；谋Ｗo(hù)肽樹脂約600mg。用TFA(10mL)脫保護(hù)(處理30分鐘)，得到粗肽200mg。全部加入YMC-Pack PROTEIN-RP(5μm，C4，20mm×250mm)，用0.1％三氟乙酸中，從乙腈0％至54％線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/mL)。得到約180mg的目的物。
測(cè)定值ESI-MS[M+H]；1085.6(理論值1085.2)、氨基酸組成比Ser；2.47(3)，Glx；0.98(1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.02(1)，His；1.09(1)，Pro；0.96(1)(6)含有側(cè)鏈烷基絲氨酸的衍生物的合成例化合物50.[Ser3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺；GSS(C8H17)FLSP-NH2Fmoc-Ser(C8H17)在冰冷卻下，向Boc-Ser(12.3g，53.9mmol)的DMF(300ml)溶液中加入氫化鈉(3.19g，133mmol)，在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。向其中加入碘化辛烷(11.0ml，60.9mmol)，在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。在冰冷卻下，向反應(yīng)液中滴加入水(40ml)后，減壓蒸除溶劑。所得殘查用硅膠柱色譜(硅膠；Merck社制Art9385、洗脫溶劑；二氯甲烷∶甲醇∶乙酸＝120∶10∶1)純化，得到Boc-Ser(C8H17)6.88g(收率36.2％)，為淡黃色油狀物。在冰冷卻下，向該Boc-Ser(C8H17)(6.88g，21.7mmol)中，加入三氟乙酸(120ml)，在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。減壓蒸除三氟乙酸后，將所得殘查溶解于乙醚(120ml)，加入4N鹽酸-二氧雜環(huán)己烷(22ml)，在冰冷卻下，攪拌1小時(shí)。過濾收集析出的結(jié)晶，得到H-Ser(C8H17)·HCl為無色結(jié)晶，5.23g(收率96.3％)。向該H-Ser(C8H17)·HCl(2.54g，10.0mmol)的10％碳酸氫鈉(50ml)懸浮液中加入三乙胺(1.40ml，10mmol)后，向其中用10分鐘滴加入Fmoc-OSu(5.00g，14.8mmol)的1，2-二甲氧乙烷(20ml)溶液，在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。過濾不溶物，向?yàn)V液中加入二氯甲烷，分離有機(jī)層后，用13％食鹽水洗凈。用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑。所得殘查用硅膠柱色譜(硅膠；富士シリシア社制BW-300、洗脫溶劑；二氯甲烷∶甲醇＝93∶7)純化，得到Fmoc-Ser(C8H17)為無色結(jié)晶2.75g(收率62.6％)。Rf＝0.45(CHCl3∶MeOH＝9∶1，硅膠60F254，MERCK)Fmoc-DSer(C8H17)Rf＝0.45(CHCl3∶MeOH＝9∶1，硅膠60F254，MERCK)將Fmoc-酰胺樹脂(ABI社制、400mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Ser(But)-Ser(C8H17)-Phe-Leu-Ser(But)-Pro樹脂。最后，通過DCC/HOBt導(dǎo)入Boc-Gly后，從所得保護(hù)肽樹脂取出250mg，用TFA(10mL)處理30分鐘。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚進(jìn)行沉淀，得到粗肽約120mg。將本品溶于5％AcOH(10mL)中，添加到Y(jié)MC-Pack-ODS-A(5μm，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，乙腈從0％至60％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到40 mg目的物。
化合物84.[N-氨基戊?；?，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-芐基酰胺；H-Ape-Ser(C8H17)-Phe-Leu-NH-CH2-Ph將肟樹脂(230 mg/0.25mmol、Novabiochem製)裝入帶有玻璃過濾器的反應(yīng)容器中，加入預(yù)先溶于二氯甲烷(DCM)中用MgSO4干燥過的Boc-Leu-OH·H2O(190mg，0.75mmol)、DCC(160mg，0.75mmol)、和DCM 5mL，整夜振蕩。分別用適量的DCM、DCM/EtOH＝1∶1、DCM依次洗滌數(shù)次。導(dǎo)入Leu后，①加入25％TFA/DCM10mL振蕩30分鐘后，用DCM、異丙醇(iPrOH)、DCM、DMF分別洗滌數(shù)次，②在三角燒瓶中，將Boc氨基酸0.75mmol(3當(dāng)量)、TBTU 0.75mmol(3當(dāng)量)、HOBt 0.75mmol(3當(dāng)量)溶解于DMF5mL中，加入DIPEA 1.25mmol(5當(dāng)量)攪拌得到的物質(zhì)裝入反應(yīng)容器振蕩1小時(shí)，重復(fù)該操作，依次縮合氨基酸。最終得到Boc-NH-(CH2)4-CO-Ser(C8H17)-Phe-Leu-肟樹脂370mg。將其懸浮于DMF約5mL中，加入芐胺鹽酸鹽(180mg，1.25mmol)、三乙胺(173μL，1.25mmol)、乙酸72μL(1.25mmol)攪拌。24小時(shí)后，濾除樹脂，減壓蒸除濾液，用1N HCl 10mL析出Boc保護(hù)體。用水洗滌，干燥后，加入TFA 5mL反應(yīng)30分鐘進(jìn)行脫Boc。減壓蒸除TFA，用醚(Et2O)沉淀，得到目的物[N-氨基戊?；?，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-芐基酰胺110mg。用同樣的方法合成來化合物82、83、85。
下面的具有烷基絲氨酸的肽衍生物，除了化合物82～85，可用與上述化合物50的制造方法相同的方法制造。
下面匯集具有烷基絲氨酸的肽衍生物的質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析結(jié)果。
化合物17.[Ser3(辛基)]-hGhrelinESI-MS；3357.0(理論值；3356.9)、氨基酸組成比Ser；2.92(3+1)，Glx；5.94(6)，Gly；1.00(1)，Ala；0.98(1)，Val；0.99(1)，Leu；2，Phe；1.13(1)，Lys；4.04(4)，His；1.09(1)，Arg；3.01(3)，Pro；3.89(4)化合物50.[Ser3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS [M+H]；805.5(理論值805.0)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；0.86(2+1)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.06(1)，Pro；0.95(1)化合物51.[Ser3(辛基)，DPhe4]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS [M+H]；805.4(理論值805.0)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；0.97(2+1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.05(1)，Pro；1.16(1)化合物52.[DSer3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS [M+H]；805.4(理論值805.0)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；1.51(2+1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；1.00(1)化合物53.[DSer3(辛基)，DPhe4]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS [M+H]；805.5(理論值805.0)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；1.51(2+1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；1.01(1)化合物67.[Ser3(Bzl)]-hGhrelinESI-MS M；3335.0(理論值3334.8)氨基酸組成比Ala；1.00(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.00(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；4.00(4)，Phe；1.02(1)，Pro；4.08(4)，Ser；3.58(4)，Val；0.98(1)化合物76.[N-氨基戊?；琒er3(辛基)，Lys5]-Ghrelin(3-5)-酰胺ESI-MS [M+H]；591.5(理論值590.8)，氨基酸組成比Ser；0.45(1)，Phe；1，Lys；1.00(1)化合物77.[N-氨基戊?；珼Ser3(辛基)，DPhe4，Lys5]-Ghrelin(3-5)-酰胺ESI-MS [M+H]；591.5(理論值590.8)，氨基酸組成比Ser；0.45(1)，Phe；1，Lys；1.01(1)化合物78.[Aib1，His2，Ser3(辛基)，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺ESI-MS [M+H]；714.6(理論值713.9)，氨基酸組成比Ser；0.45(1)，Phe；1，His；1.01(1)，Lys；1.00(1)化合物79.[Aib1，His2，DSer3(辛基)，DPhe4，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺ESI-MS [M+H]；714.5(理論值713.9)，氨基酸組成比Ser；0.44(1)，Phe；1，His；1.00(1)，Lys；1.01(1)化合物81.[N-氨基戊?；琒er3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-酰胺ESI-MS [M+H]；576.5(理論值575.8)，氨基酸組成比Ser；0.49(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)化合物82.[N-氨基戊?；?，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-甲基酰胺ESI-MS [M+H]；590.6(理論值589.8)，氨基酸組成比Ser；0.49(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)化合物83.[N-氨基戊?；琒er3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-乙基酰胺ESI-MS [M+H]；604.3(理論值603.8)，氨基酸組成比Ser；0.50(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)化合物84.[N-氨基戊?；?，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-芐基酰胺
ESI-MS [M+H]；666.5(理論值665.9)，氨基酸組成比Ser；0.46(1)，Leu；1，Phe；0.98(1)化合物85.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-氨基乙基酰胺ESI-MS[M+H]；619.6(理論值618.9)，氨基酸組成比Ser；0.47(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)(7)含有側(cè)鏈烷基半胱氨酸衍生物的合成例化合物48.[Cys3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-NH2；GSC(C8H17)FLSP-NH2將Fmoc-酰胺樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Ser(But)-Cys(C8H17)-Phe-Leu-Ser(But)-Pro樹脂。最后，用DCC/HOBt導(dǎo)入Boc-Gly后，將所得保護(hù)肽樹脂(550mg)用TFA(10mL)處理30分鐘。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚進(jìn)行沉淀，得到粗肽120mg。將本品溶于5％乙酸(AcOH)10mL中，添加至YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，乙腈從0％至60％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥、得到44mg目的物。
化合物68.[Cys3(Trt)]-hGhrelin；GSC(C-Ph3)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR將Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Ser(But)-Cys(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP樹脂。最后，用DCC/HOBt導(dǎo)入Boc-Gly后，得到保護(hù)肽樹脂(1.4g)。向其中400mg中，加入TFA(15mL)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過濾除去樹脂，濃縮濾液后，加入醚進(jìn)行沉淀。將約90mg溶于水40mL中，添加到Y(jié)MC-PackPROTEIN-RP(C4，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，乙腈從0％至54％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到60mg目的物。
下面的具有烷基半胱氨酸的肽衍生物，可用與上述化合物48或化合物68同樣的制造方法制造。
下面匯集具有烷基半胱氨酸的肽衍生物的質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析結(jié)果。
化合物18.[Cys3(辛基)]-rGhrelinESI-MS；3317.0(理論值；3316.9)、氨基酸組成比Ser；2.69(3)，Glx；5.90(6)，Gly；1.00(1)，Ala；1.99(2)，Leu；2，Phe；1.02(1)，Lys；4.97(5)，His；0.99(1)，Arg；1.98(2)，Pro；3.87(4)化合物48.[Cys3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS [M+H]；821.7(理論值821.1)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；0.60(2)，Gly；1.08(1)，Leu；1，Phe；1.06(1)，Pro；0.96(1)化合物49.[Cys3(辛基)，DPhe4]-Ghrelin(1-7)-酰胺ESI-MS [M+H]；821.6(理論值821.1)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的氨基酸組成比Ser；0.58(2)，Gly；1.02(1)，Leu；1，Phe；1.06(1)，Pro；0.97(1)化合物68.[Cys3(Trt)]-hGhrelinESI-MS 3503.0(理論值3503.1)，氨基酸酸組成比Ser；2.42(3)，Glx；5.77(6)，Gly；1.00(1)，Ala；1.01(1)，Val；0.94(1)，Leu；2，Phe；0.99(1)，Lys；3.94(4)，His；0.99(1)，Arg；2.92(3)，Pro；3.81(4)(8)含有N-甲基氨基酸的肽衍生物的合成例化合物86.[N-氨基戊?；琒er3(辛基)，MePhe4，MeLeu5]-Ghrelin(3-5)-酰胺；NH2-(CH2)4-CO-Ser(C8H17)-MePhe-MeLeu-NH2將Fmoc-酰胺樹脂(0.40g，0.25mmol)裝入帶有玻璃過濾器的反應(yīng)容器，加入20％哌啶/NMP 15mL，振蕩20分鐘，除去Fmoc基。之后，加入NMP 15mL、Fmoc-MeLeu-OH 1.0mmol(4當(dāng)量)、TBTU 1.0mmol(4當(dāng)量)、HOBt 1.0mmol(4當(dāng)量)、DIPEA 1.0mmol(4當(dāng)量)，振蕩1小時(shí)，縮合Fmoc-MeLeu。之后，用20％哌啶，除去Fmoc基，并在DIPEA 2.25mmol(9當(dāng)量)存在下，通過溴代三吡咯烷基鏻-六氟化磷酸鹽(3當(dāng)量)，縮合Fmoc-氨基酸(3當(dāng)量)，反復(fù)該操作，延長肽鏈。通過將少量樹脂用TFA脫保護(hù)，并通過HPLC和質(zhì)譜分析(MS)，確認(rèn)縮合反應(yīng)的結(jié)束。得到Boc-NH-(CH2)4-CO-Ser(O-C8H17)-MePhe-MeLeu-樹脂后，將其用TFA處理30分鐘，進(jìn)行切出并脫保護(hù)，減壓蒸除TFA，用醚(Et2O)洗凈，得到NH2-(CH2)4-CO-Ser(C8H17)-MePhe-MeLeu-NH2120mg。將其添加到Y(jié)MC-PackODS-A(C18，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至54％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到70mg目的物。將該衍生物用丙酸·鹽酸(50/50)，在150℃水解2小時(shí)后，在氨基酸分析機(jī)上檢出的氨基戊酸的峰面積相對(duì)于氨基戊酸10nmol的面積比，定量肽量。
ESI-MS [M+H]；604.5(理論值603.8)、用丙酸·鹽酸(50/50)在150℃水解2小時(shí)后的檢出氨基酸Ser、Ape(9)混合二硫化物衍生物的合成化合物57.[Cys3(S-庚基)]-hGhrelin；GSC(S-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR向用化合物58的化合物3的制造方法合成得到的肽-HMP樹脂(1g)中，加入從88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脫保護(hù)試劑(15mL)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚，得到粗[Cys3]-hGhrelin粉末約550mg。將其添加到Y(jié)MC-PackODS-A(C18，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至54％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到300mg的[Cys3]-hGhrelin(1-28)。之后，將40mg(11.4μmol)溶解于水(20mL)中，加入4，4’-二硫二吡啶(7.5mg、34.2μmol)的乙腈溶液1mL，放置1小時(shí)。確認(rèn)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液用氯仿洗滌數(shù)次，除去多余的4，4’-二硫二吡啶和吡啶酮衍生物。將含有[硫代吡啶基Cys3]-hGhrelin(1-28)的水層(10mL)，用5％NH3水調(diào)至pH7.4，加入1-庚硫醇(4.5mg、34.2μmol)的乙腈溶液2mL。1小時(shí)后，將反應(yīng)液添加到Y(jié)MC-Pack ODS-A(C18，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至54％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到15mg目的物。
化合物57.[Cys3(S-庚基)]-hGhrelinESI-MS 3391.0(理論值3391.0)，氨基酸酸組成比Ser；2.76(3)，Glx；5.81(6)，Gly；0.99(1)，Ala；1.01(1)，Val；0.95(1)，Leu；2，Phe；0.99(1)，Lys；3.95(4)，His；0.99(1)，Arg；2.93(3)，Pro；3.84(4)(10)3位側(cè)鏈中含有酰胺、逆向酯的衍生物的合成例化合物55.[Asp3(NH-庚基)]-hGhrelin；GSD(NH-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR將Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)，用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，重復(fù)該操作，構(gòu)建Fmoc-Ser(But)-Asp(OPis)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP樹脂。最后，通過DCC/HOBt導(dǎo)入Boc-Gly后，將所得保護(hù)肽樹脂(1.3g)，用4％TFA-二氯甲烷溶液(15mL)處理15分鐘。過濾收集肽樹脂，用二氯甲烷(30mL)洗滌數(shù)次后，用4％DIEA(10mL)、接著用二氯甲烷(30mL)洗凈。
將所得脫P(yáng)is肽樹脂(約1.3g)，用NMP(10mL)泡脹，加入水溶性碳化二亞胺鹽酸鹽(191.7mg，1.0mmol)、HOBt(135.2mg，1.0mmol)、正庚胺(115.2mg，1.0mmol)，反應(yīng)8小時(shí)。
過濾收集樹脂，用NMP、二氯甲烷洗凈，減壓下干燥，得到3位Asp側(cè)鏈被庚基酰胺化的保護(hù)肽樹脂約1.2g。向其中加入88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脫保護(hù)試劑(10mL)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚進(jìn)行沉淀。過濾收集沉淀，干燥，得到粗肽約550mg。
將本品200mg溶于水10mL，將其添加到Y(jié)MC-Pack PROTEIN-RP(C4，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至54％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10mL/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到120mg的目的物。
化合物61.[Lys3(辛?；?]-hGhrelin；GSK(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR將Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-樹脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪處理20分鐘后，依次進(jìn)行用HBTU/HOBt導(dǎo)入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脫Fmoc，反復(fù)該操作，構(gòu)建Boc-Gly-Ser(tBu)-Lys(Mtt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP樹脂。將約300mg的保護(hù)肽樹脂，用1％TFA-5％TIPS-二氯甲烷溶液(15mL)處理60分鐘。
過濾收集肽樹脂，用二氯甲烷(30mL)洗滌數(shù)次后，用10％DIEA(10mL)、然后用二氯甲烷(30mL)洗凈。將所得脫Mtt肽樹脂(約300mg)用NMP(2mL)泡脹，在HOBt(34mg，0.25mmol)存在下，加入辛酸(40μl，0.25mmol)、DCC(52mg，0.25mmol)反應(yīng)一夜。
過濾收集樹脂，用NMP、二氯甲烷洗凈，減壓干燥，得到3位賴氨酸側(cè)鏈被辛酰化的保護(hù)肽樹脂約300mg。向其中，加入88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脫保護(hù)試劑(5mL)，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濾除樹脂，濃縮濾液后，向剩余物中加入醚進(jìn)行沉淀。過濾收集沉淀，干燥，得到粗肽約234mg。
將本品溶于乙酸6mL中，加入到Y(jié)MC-Pack ODS-A(5μm，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至60％為止線性梯度洗脫(流速10mL/min)60分鐘。分取目的組分后，冷凍干燥，得到100mg粉末。將該物質(zhì)溶于2ml 50％乙酸，添加到Y(jié)MC-PackPROTEIN-RP(5μm，C4，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至60％為止線性梯度洗脫(流速10mL/min)60分鐘。分取目的組分后，冷凍干燥，得到52mg的粉末。
下面的化合物，可按照與上述化合物55或化合物61同樣的制造方法制造。
另外，下面匯集了用Fmoc常規(guī)方法合成的肽衍生物的質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析結(jié)果。
化合物54.[Asp3(O-庚基)]-hGhrelin(1-28)ESI-MS 3371.0(理論值3370.9)，氨基酸酸組成比Asx；0.99(1)，Ser；2.70(3)，Glx；5.87(6)，Gly；1.01(1)，Ala；1.01(1)，Val；0.94(1)，Leu；2，Phe；1.00(1)，Lys；4.02(4)，His；1.00(1)，Arg；2.98(3)，Pro；3.84(4)化合物55.[Asp3(NH-庚基)]-hGhrelin(1-28)ESI-MS 3370.0(理論值3369.9)，氨基酸酸組成比Asx；0.88(1)，Ser；2.95(3)，Glx；5.97(6)，Gly；1.21(1)，Ala；1.03(1)，Val；0.98(1)，Leu；2，Phe；1.00(1)，Lys；3.94(4)，His；0.92(1)，Arg；2.91(3)，Pro；3.99(4)化合物56.[Dap3(辛?；?]-hGhrelinESI-MS M；3370.0(理論值3369.9)氨基酸組成比Ala；1.02(1)，Arg；2.94(3)，Glx；5.94(6)，Gly；1.00(1)，His；0.91(1)，Leu；2(2)，Lys；3.93(4)，Phe；0.99(1)，Pro；4.01(4)，Ser；2.88(3)，Val；0.98(1)，Dap；N.D.
化合物58.[Adod3]-hGhrelin(1-28)ESI-MS M；3355.0(理論值3355.0)氨基酸組成比Ala；1.01(1)，Arg；2.91(3)，Glx；5.95(6)，Gly；1.01(1)，His；0.91(1)，Leu；2(2)，Lys；3.94(4)，Phe；0.99(1)，Pro；4.02(4)，Ser；2.88(3)，Val；0.96(1)化合物61.[Lys3(辛?；?]-hGhrelinESI-MS M；3412.0(理論值3412.0)氨基酸組成比Ala；1.05(1)，Arg；3.05(3)，Glx；6.02(6)，Gly；1.00(1)，His；1.00(1)，Leu；2(2)，Lys；5.11(5)，Phe；0.97(1)，Pro；4.20(4)，Ser；2.68(3)，Val；1.00(1)化合物62.[Trp3]-hGhrelinESI-MS M；3343.0(理論值3343.9)，氨基酸組成比Ala；1.00(1)，Arg；3.03(3)，Glx；5.94(6)，Gly；1.01(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；4.00(4)，Phe；0.99(1)，Pro；3.96(4)，Ser；2.60(3)，Trp；N.D.，Val；0.98(1)化合物63.[Phe3]-hGhrelinESI-MS M；3305.0(理論值3304.8)，氨基酸組成比Ala；0.99(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.86(6)，Gly；1.00(1)，His；1.00(1)，Leu；2(2)，Lys；3.98(4)，Phe；2.01(2)，Pro；3.99(4)，Ser；2.67(3)，Val；0.98(1)化合物64.[Cha3]-hGhrelinESI-MS M；3411.0(理論值3410.9)，氨基酸組成比Ala；1.02(1)，Arg；3.01(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.01(1)，His+Cha；2.01(1+1)，Leu；2(2)，Lys；4.02(4)，Phe；1.01(1)，Pro；4.03(4)，Ser；2.72(3)，Val；0.97(1)化合物65.[2-LNal3]-hGhrelinESI-MS M；3354.0(理論值3354.9)，氨基酸組成比Ala；1.00(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.87(6)，Gly；1.02(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；3.98(4)，Phe；1.01(1)，Pro；3.94(4)，Ser；2.73(3)，Val；0.97(1)，Nal；N.D.(1)化合物66.[2-DNal3]-hGhrelinESI-MS M；3355.0(理論值3354.9)，氨基酸組成比Ala；1.02(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.96(6)，Gly；1.00(1)，His；0.92(1)，Leu；2(2)，Lys；3.94(4)，Phe；0.99(1)，Pro；4.02(4)，Ser；2.91(3)，Val；0.98(1)，Nal；N.D.(2)化合物70.[Leu3]-hGhrelinESI-MS M；3270.0(理論值3270.8)，氨基酸組成比Ala；0.99(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.88(6)，Gly；1.01(1)，His；1.00(1)，Leu；3(3)，Lys；3.96(4)，Phe；1.00(1)，Pro；3.89(4)，Ser；2.65(3)，Val；0.97(1)化合物71.[Ile3]-hGhrelinESI-MS M；3270.0(理論值3270.8)，氨基酸組成比Ala；0.98(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.87(6)，Gly；0.99(1)，His；1.01(1)，Ile；0.98(1)，Leu；2(2)，Lys；3.97(4)，Phe；1.00(1)，Pro；3.97(4)，Ser；2.65(3)，Val；0.98(1)化合物72.[Lys3(辛酰基)]-hGhrelinESI-MS M；3286.0(理論值3285.8)，氨基酸組成比Ala；1.02(1)，Arg；2.94(3)，Glx；5.95(6)，Gly；0.99(1)，His；0.92(1)，Leu；2(2)，Lys；4.92(5)，Phe；0.99(1)，Pro；4.02(4)，Ser；2.91(4)，Val；0.99(1)化合物73.[Nle3]-hGhrelinESI-MS M；3270.0(理論值3270.8)，氨基酸組成比Ala；1.01(1)，Arg；2.98(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.02(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；4.01(4)，Phe；1.01(1)，Pro；4.01(4)，Ser；2.71(3)，Val；0.98(1)，Nle；N.D.(1)化合物74.[Val3]-hGhrelinESI-MS M；3256.0(理論值3256.8)，氨基酸組成比Ala；0.98(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.84(6)，Gly；1.00(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；3.97(4)，Phe；0.99(1)，Pro；3.94(4)，Ser；2.64(3)，Val；1.97(2)化合物80.[Aib1，His2，DNal3，DPhe4，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺；IpamorelinESI-MS [M+H]；712.5(理論值711.9)，氨基酸組成比Phe；1，His；1.00(1)，Lys；1.00(1)實(shí)施例11 Ghrelin衍生物肽類化合物的活性比較對(duì)于實(shí)施例10中合成的Ghrelin衍生物肽類化合物和天然型Ghrelin肽，按照實(shí)施例1所示方法，測(cè)定Ca提高活性。
(1)3位絲氨酸側(cè)鏈的修飾①.辛?；奈恢肎hrelin顯著的結(jié)構(gòu)上特征是3位絲氨酸羥基的辛酰基。首先，調(diào)查辛?；慕z氨酸的位置在3位時(shí)對(duì)表達(dá)活性是否有利。使用表達(dá)大鼠GSH受體的CHO細(xì)胞，將細(xì)胞內(nèi)鈣提高作用作為指標(biāo)。
以EC50值保持在5.4nM的短鏈Ghrelin衍生物Ghrelin(1-9)酰胺為基礎(chǔ)，合成[絲氨酸2(辛酰)，絲氨酸3]-Ghrelin(1-9)酰胺、[絲氨酸2(辛酰)]-Ghrelin(1-9)酰胺、和[Nα-辛酰，絲氨酸3]-Ghrelin(1-9)酰胺，研究細(xì)胞內(nèi)鈣提高活性。
結(jié)果匯集于表4。
表4 Ghrelin衍生物的活性1
如果將人Ghrelin的辛?；鶑?位移至2位絲氨酸，活性降低至約1/200(EC50＝1,100nM)。
2位和3位都有辛?；难苌?，同樣也是活性降低了(EC50＝1,400nM)。
另外，只有氨基末端氨基被N-辛酰化時(shí)，活性變得較弱(EC50＞10,000nM)。
從該結(jié)果可判斷，用辛酰基修飾的氨基酸的位置，特別優(yōu)選在Ghrelin分子的3位。
②.脂肪酸鏈長將除去大鼠Ghrelin3位絲氨酸側(cè)鏈的辛?；拿?辛酰體的細(xì)胞內(nèi)鈣提高活性，從辛酰體的2.6nM降低至3,500nM，因此可知，3位絲氨酸側(cè)鏈的辛?；诒憩F(xiàn)活性中起極其重要的作用。
因此，使用各種飽和脂肪酸，調(diào)查大鼠Ghrelin中的絲氨酸側(cè)鏈酰基的碳原子數(shù)與活性的關(guān)系。即，求出用乙?；?CH3CO-)、丙?；?CH3CH2CO-)、丁酰基(CH3(CH2)2CO-)、己酰基(CH3(CH2)4CO-)、癸酰基(CH3(CH2)8CO-)、十二烷酰基(CH3(CH2)10CO-)、和十六烷酰基(CH3(CH2)14CO-)，將3位絲氨酸羥基酰化的Ghrelin衍生物的細(xì)胞內(nèi)鈣提高活性。
結(jié)果匯集于表5。
表5 Ghrelin衍生物的活性2
表中，n.t.表示未進(jìn)行試驗(yàn)。
脂肪酸鏈長對(duì)活性的影響是，用乙酰基(C2)，EC50值是780nM、用丁?；?C4)，EC50值是280nM，有顯著提高，用己?；?C7)，EC50值是16nM，Ca提高活性進(jìn)一步提高，用辛酰基(Ghrelin)，EC50值是1.5nM，達(dá)到Ca提高活性的高峰。即使用癸?；?C10)，EC50也是1.7nM，Ca提高活性與Ghrelin保持同等水平，進(jìn)一步用十二烷酰基(C12)，EC50值是2.4nM，用十六烷?；?C16)，EC50值是6.5nM，即使延長脂肪酸鏈長，也是保持Ca提高活性。
③.各種?；〈骘柡椭舅?，制作以3-苯基丙酸(HO-CO-CH2CH2Ph)作為芳香族脂肪酸的代表例與3位絲氨酸羥基上形成酯鍵的人Ghrelin衍生物、和與作為不飽和脂肪酸代表例的3-辛烯酸(CH3(CH2)3CH＝CH-CH2COOH)、與作為支鏈狀脂肪酸代表例的4-甲基戊酸((CH3)2CH-CH2CH2CO2H)形成酯鍵的人Ghrelin衍生物，評(píng)價(jià)活性。
④.對(duì)烷基的取代如果將化學(xué)不穩(wěn)定的酯鍵轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的醚、硫醚鍵等，可制成化學(xué)穩(wěn)定的Ghrelin衍生物。但是，不用說，前提條件是保持活性。
因此，對(duì)人Ghrelin的3位絲氨酸被辛基(C8H17)化的人Ghrelin的醚衍生物，和大鼠Ghrelin的3位絲氨酸被半胱氨酸取代，同樣被辛基化的大鼠Ghrelin的硫醚體，進(jìn)行活性調(diào)查。
另外，制備人Ghrelin的3位絲氨酸被芐基化(-CH2Ph)的衍生物，和人Ghrelin的3位絲氨酸被半胱氨酸替代后三苯甲基化(-C(Ph)3)的衍生物。
結(jié)果匯集于表6。另外，對(duì)于人Ghrelin的3位絲氨酸被芐基化(-CH2Ph)的衍生物、和人Ghrelin的3位絲氨酸被半胱氨酸替代后三苯甲基化(-C(Ph)3)的衍生物的Ca提高活性，在表13中作為化合物67、68記載結(jié)果。另外，對(duì)于4-甲基戊酸((CH3)2CH-CH2CH2CO2H)與3位絲氨酸羥基形成酯鍵的人Ghrelin衍生物的Ca提高活性，也在表13中，作為化合物69記載結(jié)果。
表6 Ghrelin衍生物的活性3
即使將作為不飽和脂肪酸的3-辛烯?；鶎?dǎo)入3位絲氨酸的側(cè)鏈，也具有與辛酰基同樣的Ca提高活性(EC50＝1.7nM)。
有趣的是，即使導(dǎo)入苯基丙?；珽C50＝1.4nM，仍然保持Ca提高活性，另外，即使導(dǎo)入相當(dāng)于C6的支鏈脂肪酸4-甲基戊?；?，EC50值是4.4nM，保持了Ca提高活性(表13，化合物69)，因此可知3位絲氨酸側(cè)鏈的?；灰欢ㄊ侵辨溚轷；?br> 另外，可期待化學(xué)安定性的3位絲氨酸或半胱氨酸被辛基化的醚和硫醚體的EC50值，分別保持1.2nM、5.4nM，因此可知，3位氨基酸殘基側(cè)鏈不一定是?；?br> 另外，3位被Ser(Bzl)(人Ghrelin的3位絲氨酸被芐基化(-CH2Ph)的衍生物〕、或Cys(Trt)〔人Ghrelin的3位絲氨酸被半胱氨酸替代后三苯甲基化(-C(Ph)3)的衍生物〕取代的Ghrelin，EC50值分別是7.6nM、20nM，保持了Ca提高活性(表13，化合物67、68)。
(2)活性領(lǐng)域的檢索含有羧基末端部分的Ghrelin(16-28)在細(xì)胞內(nèi)Ca提高活性較低(EC50＞10,000nM)，另一方面，含有氨基末端部分的人Ghrelin(1-15)和大鼠人Ghrelin(1-15)的EC50值分別是7.0nM、8.6nM，保持了細(xì)胞內(nèi)Ca提高活性，因此可知，Ghrelin的活性部位存在于氨基末端部分(表7)。
表7 Ghrelin衍生物的活性4
另外，在Ghrelin(1-15)中，由于人型和大鼠型的活性基本相同，11位和12位的氨基酸殘基(在人中是-精氨酰-纈氨酰-、在大鼠中是-賴氨酰-丙氨酰-)不限于這些氨基酸。
這樣在人Ghrelin、或大鼠Ghrelin得到的結(jié)構(gòu)活性相關(guān)的結(jié)果，分別可適用于大鼠Ghrelin或人Ghrelin。
另外，除去14位的谷氨酰胺的[脫-谷氨酰胺14]-大鼠Ghrelin，確認(rèn)具有與大鼠Ghrelin同等的Ca提高活性(EC50＝1.5nM)，因此，Ghrelin分子中央部分的氨基酸可缺失。
(3)肽鏈長和向羧基末端導(dǎo)入堿性基團(tuán)以活性較強(qiáng)的Ghrelin(1-15)為基礎(chǔ)，制備適當(dāng)缺失羧基末端側(cè)氨基酸殘基的衍生物，評(píng)價(jià)活性。
羧基末端是羧酸的短鏈衍生物和羧基末端是酰胺化的短鏈衍生物的活性如表8所示。
表8 Ghrelin衍生物的活性5
Ghrelin(1-3)酰胺的Ca提高活性較低(EC50＞10,000nM)。用苯基丙氨酸延長的Ghrelin(1-4)的EC50值是480nM、其羧基末端酰胺體是160nM，Ca提高活性顯著提高。
另外，附加了亮氨酸酰胺的Ghrelin(1-5)酰胺體的活性比(1-4)酰胺體的活性提高約26倍(EC50＝6.2nM)，顯示與天然品同水平的Ca提高活性。
在Ghrelin(1-7)酰胺體中看到最強(qiáng)的Ca提高活性，其EC50值是2.6nM，與天然品幾乎相等。
從以上結(jié)果可知，表達(dá)Ghrelin活性必須的結(jié)構(gòu)要點(diǎn)集中在氨基末端部分4個(gè)殘基的序列，但是通過在5位附加亮氨酸等殘基，可大大提高與Ghrelin受體的親和性，或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此優(yōu)選在5位附加亮氨酸等殘基。
另外，如上述結(jié)果表明的那樣，通過將羧基末端羧酸酰的胺化，可看到Ca提高活性的提高傾向。
例如，在Ghrelin(1-9)，通過酰胺化，EC50值從38nM變?yōu)?.4nM，提高Ca提高活性約7倍，在Ghrelin(1-4)，EC50值從480nM變?yōu)?60nM，提高Ca提高活性約3倍。另外，在除去Ghrelin(1-9)酰胺的9位堿性殘基組氨酸殘基的Ghrelin(1-8)酰胺中，EC50值從5.4nM變?yōu)?3nM，降低了Ca提高活性，另一方面，在除去作為酸性氨基酸的8位谷氨酸的Ghrelin(1-7)酰胺中，相反EC50值從13nM變?yōu)?.6nM，提高了Ca提高活性。
酰胺化的効果之一是羧酸的負(fù)電荷被中和，上述結(jié)果顯示，在短鏈衍生物中羧基末端氨基酸的堿性，對(duì)于提高活性起了很大作用。
根據(jù)該結(jié)果，以所得高活性的Ghrelin(1-7)酰胺為中心，制備羧基末端部分附加了堿性殘基的衍生物，調(diào)查其活性。
結(jié)果如表9所示。
表9 Ghrelin衍生物的活性6
向Ghrelin(1-5)的羧基末端部分導(dǎo)入賴氨酸的[賴氨酸6]-Ghrelin(1-6)酰胺的EC50值，從4.8nM變?yōu)?2nM，Ca提高活性有些降低，但是在Ghrelin(1-4)，通過向羧基末端附加賴氨酸，EC50值從480nM變?yōu)?0nM，Ca提高活性提高約50倍。另外，向Ghrelin(1-7)羧基末端部分附加精氨酸或賴氨酸的酰胺衍生物的活性，與Ghrelin(1-7)酰胺(EC50＝2.6nM)相比，都是1.1nM，顯示極強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)鈣提高活性。
在以上，幾乎所有的例子中，通過掩蔽羧基末端部分的酸性和導(dǎo)入堿性基團(tuán)，都可提高活性。
(4)氨基末端甘氨酸和2位絲氨酸殘基以確認(rèn)活性的Ghrelin(1-7)酰胺(EC50＝2.6nM)〔表8化合物29〕、或Ghrelin(1-9)酰胺(EC50＝5.4nM)〔表4化合物3〕為基礎(chǔ)，調(diào)查氨基末端甘氨酸和2位絲氨酸對(duì)活性的影響。
結(jié)果匯集于表10。
表10 Ghrelin衍生物的活性7
氨基末端的氨基被封端的Nα-乙酰基-Ghrelin(1-10)的活性較弱(EC50＞10,000nM)。另外，如前所述，[Nα-辛酰，絲氨酸3]-Ghrelin(1-9)酰胺(表1化合物6)的活性也較弱(EC50＞10,000nM)，因此，在表達(dá)Ca提高活性中，優(yōu)選氨基末端氨基為被封端的。
另一方面，由于氨基末端的甘氨酸和2位絲氨酸被相當(dāng)于2個(gè)殘基長度的5-氨基-正戊酸(NH2-(CH2)4-CO-)取代的Nα-氨基戊酰基-Ghrelin(3-7)酰胺的Ca提高活性基本被保持(EC50＝3.4nM)，且2位絲氨酸缺損的[Nα-甘氨酰]-Ghrelin(3-7)酰胺的Ca提高活性降低(EC50＝380nM)，氨基末端帶有酪氨酸殘基的[N-酪氨酰]-大鼠Ghrelin的Ca提高活性降低(EC50＝120nM)等，因此，為獲得更強(qiáng)的活性，優(yōu)選氨基末端氨基的位置是，從3位的辛?；z氨酸殘基開始，在氨基末端方向存在相當(dāng)于2個(gè)氨基酸殘基的部分。
另外，在Ghrelin(1-7)酰胺中，2位絲氨酸被亮氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸替代的衍生物的EC50值分別是42nM、78nM、35nM、24nM，與Ghrelin(1-7)酰胺相比，Ca提高活性稍微降低。
從該結(jié)果可知，2位絲氨酸殘基-NH-CH(CH2OH)-CO-可被氨基戊酸的部分結(jié)構(gòu)-CH2-CH2-CO-取代，由此至少2位絲氨酸殘基與Ghrelin氨基末端的氨基從3位辛酰基開始保持一定的距離起到間隔區(qū)的作用。另外，用5-氨基戊酸取代保持了活性，這是因?yàn)橥ㄟ^導(dǎo)入烷基胺結(jié)構(gòu)提高氨基末端的堿性。
從上述可認(rèn)為，氨基末端部分的甘氨酸殘基由于具有該氨基，賦予Ghrelin分子的氨基末端堿性，表達(dá)Ghrelin的活性，因此優(yōu)選氨基末端部分的氨基未被封端。
另外，由于考慮到2位絲氨酸殘基與氨基末端氨基從3位辛酰基開始保持一定的距離，起到間隔區(qū)的作用，因此，可被具有相對(duì)體積小的側(cè)鏈的氨基酸或非氨基酸化合物替代。即，在Ghrelin分子中規(guī)定了以氨基末端氨基為基點(diǎn)的辛?；奈恢茫撐恢藐P(guān)系形成Ghrelin活性結(jié)構(gòu)的一部分。
即，2位氨基酸側(cè)鏈，與體積大的結(jié)構(gòu)相比，到不如優(yōu)選像絲氨酸、丙氨酸、正纈氨酸那樣，側(cè)鏈較小的，對(duì)附近殘基的自由度無束縛的氨基酸殘基。另外，由于Nα-氨基戊?；?Ghrelin(3-7)酰胺的Ca提高活性基本被保持(EC50＝3.4nM)，因此2位絲氨酸可被非氨基酸化合物替代。
(5)3位、和4位氨基酸殘基的光學(xué)活性以Ghrelin(1-7)酰胺的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，制備3位絲氨酸和4位苯基丙氨酸分別從L-構(gòu)型轉(zhuǎn)化為D-構(gòu)型的衍生物，研究3位和4位氨基酸的光學(xué)活性對(duì)活性的影響。具體地說，以保持良好活性的[絲氨酸3(辛基)]-Ghrelin(1-7)酰胺(EC50＝5.8nM)〔表11化合物50〕、或[半胱氨酸3(辛基)]-Ghrelin(1-7)酰胺(EC50＝7.4nM)〔表11化合物48〕為基礎(chǔ)，將3位絲氨酸和4位苯基丙氨酸分別替代為其對(duì)應(yīng)的的L-構(gòu)型、D-構(gòu)型，制備衍生物。
結(jié)果匯集于表11。從該結(jié)果可知，3位和4位的氨基酸優(yōu)選都是L-構(gòu)型。
表11 Ghrelin衍生物的活性8
(6)3位側(cè)鏈的結(jié)合方式為了使3位的側(cè)鏈鏈長與Ghrelin鏈長(-CH2-O-CO-C7H15)一樣，將原來的酯鍵用逆向的酯(化合物序號(hào)54)、酰胺(化合物序號(hào)55，56)、二硫化物(化合物序號(hào)57)、亞甲基(化合物序號(hào)58)取代，制備衍生物。同時(shí)，制備β碳原子上具有立體障礙的酯衍生物(化合物序號(hào)59、60)、亞甲基是3個(gè)單元部分延長形的酰胺衍生物(化合物序號(hào)61)。結(jié)果匯集于表12。
表12 Ghrelin衍生物的活性9
3位側(cè)鏈全部被亞甲基取代的化合物58的活性最強(qiáng)，EC50值在1nM以下。另外，根據(jù)鍵的種類不同，活性的高低有些變化，但是可確認(rèn)3位氨基酸側(cè)鏈的結(jié)合方式對(duì)活性沒有很大影響。
(7)3位側(cè)鏈的疏水性將3位的Ser(辛?；?基，以天然氨基酸為中心，用疏水性氨基酸替代，制備衍生物，調(diào)查其活性。結(jié)果匯集于表13。
表13 Ghrelin衍生物的活性10
在3位具有色氨酸、環(huán)己基丙氨酸、萘基丙氨酸等芳香族疏水性氨基酸的衍生物的EC50值分別是31nM，19nM，8.2nM，保持了Ca提高活性。意外的是將苯基丙氨酸導(dǎo)入3位時(shí)，Ca提高活性有些降低，但是將提高疏水性的Ser(Bzl)，Cys(三苯甲基)導(dǎo)入3位，同樣可看到Ca提高活性被保持，因此確認(rèn)，在活性表達(dá)中，更優(yōu)選3位側(cè)鏈?zhǔn)鞘杷缘摹?br> 另一方面，如果在3位導(dǎo)入亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸等脂肪族疏水性氨基酸，與導(dǎo)入芳香族氨基酸的情況相比，雖然稍微低一些，但是全都保持了Ca提高活性。與在3位具有正亮氨酸的化合物73的活性EC50＝2,800nM相比，在正亮氨酸側(cè)鏈中附加了氨基的6-氨基-正亮氨酸(賴氨酸；化合物72)的活性為EC50值是120nM，被提高了，與前述的在羧基末端優(yōu)選堿性的情況相同，確認(rèn)在3位側(cè)鏈中也優(yōu)選帶有堿性。
(8)短鏈Ghrelin衍生物從Ghrelin的活性在氨基末端部分1-4顯著地表達(dá)，通過在5位附加亮氨酸可被增強(qiáng)，優(yōu)選3位氨基酸殘基是具有疏水性側(cè)鏈的，導(dǎo)入堿性殘基可提高活性，和1位和2位的氨基酸殘基被δ-氨基酸等相當(dāng)于2個(gè)殘基長的非氨基酸化合物替代等結(jié)果，制備了如表14或15表的化合物序號(hào)從76到87所示的，以氨基末端部分(1-5)序列為基礎(chǔ)，制備各種短鏈Ghrelin衍生物，調(diào)查其活性。結(jié)果匯集于表14或15。
另外，化合物80是已知的(Ipamorerin K.Raum等、Eur.J.ofEndocrinol.，139卷，552～561頁、1998年)。
表14 Ghrelin衍生物的活性11
已知化合物80的Ca提高活性是2.5nM，很高，調(diào)查在化合物80中3位2-D-萘基丙氨酸被D-辛基絲氨酸替代的化合物79的活性時(shí)，其EC50值是38nM，保持了活性。1位和2位的氨基酸結(jié)構(gòu)不同，但是與化合物79一樣，在3位和4位具有D-辛基絲氨酸和D-苯基丙氨酸的化合物77的活性是1,600nM，降低了，合并考慮這兩方面，與1位和2位對(duì)應(yīng)的氨基酸的序列或結(jié)構(gòu)對(duì)于表達(dá)活性重要的3位和4位的氨基酸側(cè)鏈的立體構(gòu)型有影響。
即，將1，2位用氨基戊酸替代時(shí)，即使將3位的2-D-萘基丙氨酸和4位D-苯基丙氨酸分別用其相應(yīng)的L-氨基酸替代，活性也是34nM，被保持(化合物78)，由此Ghrelin的1位和2位的氨基酸序列Gly-Ser要求3位和4位中是L-立體構(gòu)型，但是通過導(dǎo)入其他的氨基酸序列，例如，導(dǎo)入Aib-His等，3，4位即使是D-立體構(gòu)型，活性也是顯著的?；颍?，2位導(dǎo)入氨基戊酸時(shí)，3，4位是L-，D-中的任一種立體構(gòu)型，都可確認(rèn)表達(dá)活性。
表15 Ghrelin衍生物的活性12
使用Ghrelin的氨基末端部分(1-5)序列為基礎(chǔ)的[N-氨基戊?；?，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)，調(diào)查羧基末端部分的結(jié)構(gòu)活性相關(guān)性。將5位亮氨酸的羧基末端用酰胺、甲基酰胺、乙基酰胺、芐基酰胺修飾時(shí)，活性雖然被保持了，其EC50值分別是11nM，12nM，22nM，98nM，可看到依次遞減的傾向。另一方面，將乙基酰胺換為氨基乙酰胺時(shí)，EC50為3.5nM，活性提高了，因此可知，優(yōu)選Ghrelin分子中的羧基末端部分帶有堿性的物質(zhì)。
這些各種羧基末端酰胺衍生物，在拮抗生物體內(nèi)羧基肽酶類引起的酶分解中也是有用的化合物。同樣地，含有N-甲基氨基酸的化合物86(EC50＝86nM)，在具有酶拮抗性方面也是有用的化合物。實(shí)施例12大鼠中Ghrelin衍生物的GH釋放活性(1)大鼠中各種長鏈Ghrelin衍生物的GH釋放活性對(duì)于戊巴比妥鈉麻醉下的IGS-SD系大鼠(約7周齡)，使用化合物17；[Ser3(辛基)]-hGhrelin 18nmol/kg，化合物18；[Cys3(辛基)]-rGhrelin 30nmol/kg，化合物65；[2-LNal3]-hGhrelin 100nmol/kg，或化合物15；[Ser3(3-苯基丙酰基)]-hGhrelin 18nmol/kg急速靜脈給藥(各n＝3)。給藥15分后，采取血漿，通過放射免疫法(Biotrak/Amersham社)測(cè)定GH濃度。作為對(duì)照，0.2％牛血清白蛋白(BSA)-生理鹽水、和分別給藥6nmol/kg的rGhrelin、hGhrelin、80nmol/kg的Ipamorelin(化合物80)，比較給藥后15分的血漿中GH濃度(各n＝3)。
結(jié)果如表13所示?；衔?7；[Ser3(辛基)]-hGhrelin、化合物18；[Cys3(辛基)]-rGhrelin和化合物15；[Ser3(3-PhPrl)]-hGhrelin都顯示強(qiáng)的GH釋放活性，可看到[2-LNal3]-hGhrelin的GH釋放活性也與細(xì)胞內(nèi)Ca提高活性有良好的相關(guān)性。
表16 各種長鏈Ghrelin衍生物的GH釋放活性
(2)[Cys3(辛基)]-大鼠Ghrein給藥引起的血漿中GH濃度推移對(duì)戊巴比妥鈉麻醉下的Wistar系大鼠雄性(約260～280g)，使用化合物18；[Cys(辛基)]-大鼠Ghrelin 5μg/只靜脈給藥時(shí)，測(cè)定釋放到血中的GH。作為對(duì)照，使用生理鹽水、和大鼠Ghrelin(5μg/只)給藥，與本品比較。
如表17～19所示，[Cys3(辛基)]-大鼠Ghrein的GH分泌促進(jìn)活性，分泌的GH的Cmax與天然型大鼠Ghrelin相同(都約1,100ng/ml)，進(jìn)一步顯示分泌時(shí)間被延長的傾向。本品的細(xì)胞內(nèi)Ca提高活性EC50值是5.4nM。
表17[Cys3(辛基)]-大鼠Ghrein給藥引起的血漿中GH濃度推移
表18 生理鹽水給藥引起的血漿中GH濃度推移
表19 大鼠Ghrelin給藥引起的血漿中GH濃度推移
實(shí)施例13 Ghrelin的食欲增進(jìn)作用(1)腦室內(nèi)給藥引起的食欲增進(jìn)作用使用溶解有各種濃度大鼠Ghrelin的生理鹽水，對(duì)體重從300g到325g的雄性ウイスタ一(Wistar)系大鼠(一組16至20只)，在早晨8點(diǎn)45分進(jìn)行腦室內(nèi)給藥。作為對(duì)照，使用不含Ghrelin的生理鹽水對(duì)腦室內(nèi)給藥。給藥后，使之自由攝餌，測(cè)定給藥后2小時(shí)的攝餌量。如圖6所示，用50pmol腦室內(nèi)給藥可確認(rèn)攝餌量的增加，在200pmol和500pmol可確認(rèn)依存于給藥量的攝餌量的增加，但是用2nmol給藥時(shí)，攝餌量的增加降低。由于通常大鼠在夜間攝餌，因此早晨是吃飽的，基本不攝餌(參見圖6作為對(duì)照的生理鹽水組)、通過Ghrelin腦室內(nèi)給藥，攝餌量增加，顯示Ghrelin有食欲增進(jìn)作用。
(2)靜脈給藥引起的食欲增進(jìn)作用對(duì)于9個(gè)月月齡的雌性SD(Sprague-Dawley)系大鼠(5只)和ウイスタ一系大鼠(4只)，使用大鼠Ghrelin50μg/kg尾靜脈給藥，測(cè)定給藥后2小時(shí)的攝餌量(在傍晚1600～1900評(píng)價(jià))。如表20所示，與對(duì)其他日子的同時(shí)刻、同一個(gè)體調(diào)查的非大鼠Ghrelin給藥時(shí)的攝餌量相比，通過Ghrelin靜脈給藥，攝餌量明顯增加。即，Ghrelin即使通過靜脈給藥，也可顯示食欲增進(jìn)作用。
表20 實(shí)施例14.Ghrelin引起的胃機(jī)能亢進(jìn)為調(diào)查Ghrelin給藥引起的對(duì)胃機(jī)能的効果，進(jìn)行如下試驗(yàn)。使用雄性SD系大鼠(體重200～280g、7～8周齡)，該大鼠在試驗(yàn)前20小時(shí)以上絕食。通過對(duì)大鼠用尿烷(1.25g/kg)腹腔內(nèi)給藥麻醉，使用加溫墊和加溫光進(jìn)行保溫。插入氣管內(nèi)插管，進(jìn)一步將食道用絲線結(jié)扎，實(shí)施下述測(cè)定胃酸分泌或胃運(yùn)動(dòng)用的手術(shù)。覺醒下的試驗(yàn)是，在吸入醚引起的輕度麻醉下，實(shí)施下述測(cè)定胃酸分泌或胃運(yùn)動(dòng)用的手術(shù)。
尿烷麻醉下的胃酸分泌試驗(yàn)是按照Ohno等的方法[Ohno，T.，etal.，Jpn.J.Pharmacol.43，429-439(1987)]進(jìn)行的手術(shù)。即，在仰臥位，將腹部正中切開，露出胃和十二指腸。從胃前部插入聚乙烯管，制作急性胃瘺。將另一根聚乙烯管通過十二指腸的切開部插入胃內(nèi)，結(jié)扎幽門部周圍，固定。胃內(nèi)灌流在注水池內(nèi)調(diào)至pH7.0加熱至37℃的生理鹽水。流速為1.0ml/min。使用pH固定裝置(Hiranuma，Comitite-8)和100mM的NaOH液滴定，使灌流液為pH7.0。確認(rèn)基礎(chǔ)胃酸分泌量穩(wěn)定后，使用被試驗(yàn)藥物靜脈給藥，每隔5分鐘測(cè)定胃酸分泌速度。各組使用4例動(dòng)物。
覺醒下的試驗(yàn)，是在吸入醚引起的輕度麻醉下實(shí)施同樣的手術(shù)后，在側(cè)腹部加個(gè)小切口，將灌流用管導(dǎo)出體外。將露出的胃和十二指腸收回腹腔，縫合開口，將動(dòng)物伏臥位固定于ボ一ルマン型大鼠用固定支架內(nèi)，確認(rèn)從麻醉覺醒后用于試驗(yàn)。另外，雖然食道被結(jié)扎，但是未插入氣管插管。
尿烷麻醉下的胃運(yùn)動(dòng)測(cè)定試驗(yàn)，按照Takeuchi & Nobuhara的方法[Takeuchi，K.and Nobuhara，Y.，Digestive Diseases and Sciences 30，1181-1188(1985)]，使用微型氣球法。即，將填充了水的氣球和支持用導(dǎo)管從前胃部切口插入胃中。橫于胃的腺部分固定，導(dǎo)管的一端與壓力傳感器(壓トランス·デュ一サ一) (日本光電株式會(huì)社制、LPU-0.1-350-0-II)連接。確認(rèn)胃運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后，被試驗(yàn)藥物以60分鐘間隔累積靜脈給藥。胃運(yùn)動(dòng)通過10分鐘間隔，測(cè)定其具有20cmH2O以上振幅的收縮運(yùn)動(dòng)的胃內(nèi)壓振幅和收縮反應(yīng)數(shù)。每組使用4例動(dòng)物。覺醒下的試驗(yàn)，在吸入醚引起的輕度麻醉下實(shí)施同樣的手術(shù)后，縫合切開部分，將動(dòng)物伏臥位固定于ボ一ルマン型大鼠用固定支架內(nèi)，確認(rèn)從麻醉覺醒后用于試驗(yàn)。
將大鼠Ghrelin和組胺2鹽酸鹽溶解于生理鹽水中，從尾靜脈以1ml/kg的容量給藥。為調(diào)查Ghrelin的作用與迷走神經(jīng)活動(dòng)是否相關(guān)，在Ghrelin給藥30分鐘前，皮下給藥硫酸阿托品，或?qū)蓚?cè)的頸部迷走神經(jīng)束切斷。為進(jìn)一步調(diào)查Ghrelin的作用與組胺H2受體的關(guān)系，在Ghrelin給藥30分鐘前，使用フアモチジン(ガスタ一、山之內(nèi)製薬株式會(huì)社制)皮下給藥。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差值表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)解析，使用Dunnett的多重比較法進(jìn)行。P值＜0.05判定為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
如圖7A和表21所示，如果在尿烷麻醉下，以大鼠Ghrelin0.8～20μg/kg的用量靜脈給藥時(shí)，以用量依存方式促進(jìn)胃酸分泌。
在麻醉下，Ghrelin給藥前，幾乎看不到胃的自發(fā)運(yùn)動(dòng)。在該狀態(tài)，如果以大鼠Ghrelin0.8～20μg/kg的用量靜脈給藥，如圖8A、B和表21所示，胃運(yùn)動(dòng)的振幅和頻度都亢進(jìn)?？纱_認(rèn)該反應(yīng)在大鼠Ghrelin給藥后迅速出現(xiàn)。用20μg/kg給藥時(shí)，胃酸分泌增多，20分以內(nèi)達(dá)到最大值后，直到給藥后90分鐘為止慢慢衰減。大鼠Ghrelin20μg/kg引起的胃酸分泌促進(jìn)作用的最大反應(yīng)的最高點(diǎn)，如圖7A、B所示，與使用組胺3mg/kg靜脈給藥時(shí)引起的反應(yīng)基本相當(dāng)。對(duì)于胃運(yùn)動(dòng)振幅的亢進(jìn)作用，各用量都在10分鐘內(nèi)達(dá)到最大反應(yīng)，使用20μg/kg給藥時(shí)，直到50分鐘后才慢慢衰減。
另外，如表21所示，用大鼠Ghrelin 20μg/kg給藥引起的胃酸分泌促進(jìn)作用，通過阿托品或切除兩側(cè)頸部迷走神經(jīng)的前處理，幾乎完全被抑制，對(duì)于作為組胺H2受體拮抗劑的フアモチジン1mg/kg皮下給藥的前處理完全沒有影響。另外，大鼠Ghrelin給藥引起的胃運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)作用，也被阿托品或兩側(cè)頸部迷走神經(jīng)切除術(shù)的前處理完全抑制。由此可確認(rèn)，Ghrelin的胃機(jī)能亢進(jìn)作用，不是組胺類機(jī)序引起的，是由活化迷走神經(jīng)引起的。
另一方面，在覺醒大鼠中，與上述尿烷麻醉下相同，如果用大鼠Ghrelin(4和20μg/kg)靜脈給藥，可促進(jìn)胃酸分泌。另外，覺醒下的大鼠與麻醉下大鼠相比，在被檢藥物給藥前發(fā)生胃的自發(fā)運(yùn)動(dòng)，即使在該狀態(tài)使用大鼠Ghrelin0.8～20μg/kg的用量靜脈給藥，胃運(yùn)動(dòng)在振幅和頻度上都亢進(jìn)。以上的結(jié)果可確認(rèn)，在尿烷麻醉下和覺醒下的任一種情況下，都可確認(rèn)通過Ghrelin靜脈給藥，可引起胃酸分泌的促進(jìn)和胃運(yùn)動(dòng)的亢進(jìn)。
表21
表中記號(hào)如下所示，*1 p＜0.01 *2 p＜0.05 *3 p＜0.01NT 未試驗(yàn)實(shí)施例15.Ghrelin和Ghrelin衍生物的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用為調(diào)查Ghrelin給藥引起的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用，進(jìn)行以下試驗(yàn)。使用大鼠Ghrelin或硫醚型大鼠Ghrelin(化合物18[Cys3(辛基)]-hGhrelin)20μg/kg，對(duì)wistar系雄性大鼠(7.5周齡)的尾靜脈給藥。給藥17小時(shí)后，使用3H-胸腺嘧啶核甙(3H-thymidine)尾靜脈給藥，1小時(shí)后，摘出十二指腸、空腸和骨髓。測(cè)定這些組織中收入DNA組分中的3H-胸腺嘧啶核甙的量，調(diào)查Ghrelin和Ghrelin衍生物的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。將組織切細(xì)后，用聚トロン勻漿器進(jìn)行勻漿，其離心分離上清液用三氯乙酸沉淀，得到DNA組分。用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定DNA組分的放射能。
如表22所示，通過使用大鼠Ghrelin或硫醚型大鼠Ghrelin靜脈給藥，促進(jìn)了這些組織中或臟器中的DNA中3H-胸腺嘧啶核甙的攝取，因此確認(rèn)Ghrelin在十二指腸、空腸和骨髓顯示細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。
Ghrelin靜脈給藥后的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的時(shí)間花費(fèi)，與GHRH(生長激素釋放激素)給藥引起的相同，被認(rèn)為是Ghrelin的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用主要是通過下垂體分泌的GH(生長激素)進(jìn)行的。可認(rèn)為，GH分泌調(diào)節(jié)，使用作為生理因子的Ghrelin擔(dān)當(dāng)，對(duì)于生物體調(diào)節(jié)不是沒有道理的，而且很少有GH引起的副作用。
表22
數(shù)值表示，將比較例(生理鹽水給藥組)的3例的平均值作為基準(zhǔn)時(shí)，放射能的收入量的比率(％)。實(shí)施例16以抗Ghrelin抗體定量Ghrelin
使用大鼠Ghrelin的氨基末端側(cè)和羧基末端側(cè)的肽作為抗原制備抗體，通過放射免疫測(cè)定(RIA)，定量各種生物體組織中的Ghrelin。
以[C-Cys]-大鼠Ghrelin[1-11](具有大鼠Ghrelin氨基末端側(cè)第1至第11的氨基酸序列的肽的羧基末端與半胱氨酸結(jié)合的肽)和[C-Cys]-大鼠Ghrelin[13-28](具有大鼠Ghrelin氨基末端側(cè)第13至第28的氨基酸序列的肽的羧基末端與半胱氨酸結(jié)合的肽)作為抗原，免疫兔子，制備N端側(cè)抗體(抗[C-Cys]-大鼠Ghrelin[1-11]抗體)和C端側(cè)抗體(抗[C-Cys]-大鼠Ghrelin[13-28]抗體)。
如圖9a所示，在放射能標(biāo)識(shí)的大鼠Ghrelin和N端側(cè)抗體的結(jié)合中，大鼠Ghrelin的IC50(半數(shù)抑制量)，每種反應(yīng)液為3.1fmol。該N端側(cè)抗體，與化學(xué)合成的人Ghrelin和大鼠Ghrelin的100％顯示出交差反應(yīng)性，但是與3位絲氨酸被正己?；揎椀恼乎；笫驡hrelin和3位絲氨酸被正癸?；揎椀恼秕；笫驡hrelin，分別只顯示0.3％和20％的交差反應(yīng)性。另外，N端側(cè)抗體與脫脂肪酸的Ghrelin完全不反應(yīng)。
對(duì)于大鼠Ghrelin(28氨基酸)、人Ghrelin(28氨基酸)和從人或大鼠等可看到的Ghrelin-27(27個(gè)氨基酸形成的Ghrelin)，N端側(cè)抗體顯示同等的親和性。因此，可確認(rèn)N端側(cè)抗體對(duì)3位絲氨酸被正辛?；揎椀奶烊恍虶hrelin可特異性識(shí)別。
如圖9b所示，在與放射能標(biāo)識(shí)的大鼠Ghrelin的C端側(cè)抗體相對(duì)的結(jié)合中，正辛?；揎椀奶烊恍痛笫驡hrelin和脫除正辛?；拇笫驡hrelin的IC50，每種反應(yīng)液是44fmol，是相同的。即，可確認(rèn)脂肪酸修飾的Ghrelin與脫除脂肪酸的Ghrelin顯示同等的親和性。
基于以上結(jié)果可判斷，對(duì)于生物體內(nèi)各組織中存在的Ghrelin，通過N端側(cè)抗體，可對(duì)3位絲氨酸被正辛?；揎椀腉hrelin進(jìn)行定量，通過C端側(cè)抗體，可對(duì)脂肪酸修飾的Ghrelin和脫除脂肪酸的Ghrelin兩者進(jìn)行定量。
表23顯示的是，調(diào)查實(shí)際生物體各組織中，脂肪酸修飾的Ghrelin的含量、和脂肪酸修飾的Ghrelin和脫離脂肪酸的Ghrelin兩者含量的結(jié)果。
表23
表中、C-RIA表示的是使用C端側(cè)抗體的放射免疫測(cè)定法得到的定量結(jié)果，N-RIA表示的是使用N端側(cè)抗體的放射免疫測(cè)定法得到的定量結(jié)果。
另外，表中的數(shù)值表示的是“值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。實(shí)施例17通過半合成法的大鼠Ghrelin(1-28)的制造合成路線下面顯示分別通過遺傳學(xué)方法和化學(xué)合成方法制備rGhrelin(6-28)和Ghrelin(1-7)，然后從兩個(gè)Ghrelin片段制造rGhrelin的例子。
具體地說，將具有在β-半乳糖苷酶97S和rGhrelin(6-28)之間有V8蛋白酶和KexII蛋白酶切斷部位的氨基酸序列(-QFE-SRHRR-)的融合蛋白，β-半乳糖苷酶97S-(QFE-SRHRR)-rGhrelin(6-28)在大腸菌中表達(dá)。將該融合蛋白用V8蛋白酶處理，切出SRHRR-rGhrelin(6-28)。然后，將SRHRR-rGhrelin(6-28)的全氨基用Boc基保護(hù)后，用KexII蛋白酶處理，得到新的6位Ser的氨基末端氨基游離的[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)。將該保護(hù)片段和用化學(xué)合成法得到的[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)-Osu，進(jìn)行片斷縮合，通過酸處理所得[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin，制造rGhrelin。
在本實(shí)施例，雖然顯示的是rGhrelin的半合成例，但也可用該方法合成人型的產(chǎn)品。
另外，在本實(shí)施例中實(shí)施的是將(1-5)和(6-28)進(jìn)行片段縮合，但是也可將例如化學(xué)合成的氨基末端片段(1-2)，(1-3)、或(1-7)分別與，通過遺傳工程方法制備的，從28位到3位為止的具有任意長度的Ghrelin的羧基末端片段和融合蛋白質(zhì)形成的羧基末端片段(3-28)、(4-28)、或(8-28)縮合等。在減少化學(xué)合成的工序數(shù)時(shí)，用(1-2)和(3-28)或(1-3)和(4-28)縮合是有利的。另外，從完全防止由于縮合引起的消旋化的觀點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選，利用7位Pro的(1-7)和(8-28)的縮合。
表達(dá)載體pG97s rGR的構(gòu)建和Ghrelin(6-28)融合蛋白的表達(dá)基于大鼠Ghrelin的cDNA基因序列，使用全合成寡聚體的退火法，得到在前期領(lǐng)域中具有氨基酸序列QFE-SRHRR的rGhrelin(6-28)的DNA片段。
為將該DNA片段插入pG97SnPPH34(特開平9-296000)，首先，將pG97SnPPH34用SalI和SmaI處理，使得人甲狀旁腺激素前體基因缺失。將該物質(zhì)用堿性磷脂酶處理后，與預(yù)先用SalI處理，然后激酶處理過的rGhrelin衍生物基因片段通過T4連接酶連接。連接成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到質(zhì)粒pG97s rGR。
將所得pG97s rGR轉(zhuǎn)化大腸菌M25(ompT)株，所得轉(zhuǎn)化株在3個(gè)200ml的Terrific Bloth液體培養(yǎng)基(1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.4％葡萄糖)中接種，在37℃振蕩培養(yǎng)。在菌體濃度達(dá)到OD660＝0.8時(shí)，添加異丙基1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，達(dá)到最終濃度2mM，表達(dá)rGhrelin(6-28)融合蛋白質(zhì)。進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)后，離心分離，回收菌體。大鼠Ghrelin(6-28)融合蛋白質(zhì)的構(gòu)成如下所示。
大鼠Ghrelin6-28融合蛋白(β-半乳糖苷酶-97S)-QFE-SRHRR-rGhrelin(6-28)rGhrelin6-28融合蛋白質(zhì)的處理和[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的純化將所得菌體20ml懸浮于TE緩沖液中后，通過French Press將菌體破碎。之后，在3000rpm、離心分離15分鐘，回收包涵體，再次懸浮于10ml TE緩沖液和去離子水，通過離心分離將包涵體洗凈。用去離子水稀釋包涵體達(dá)到OD660的值為50.0，加入Tris-HCl(pH8.2)使最終濃度達(dá)到50mM，通過尿素(最終濃度3.5M)將包涵體溶解。向在30℃保溫的該溶液中，加入rV8蛋白酶衍生物V8D5(以下記為V8D5)(特開平9-47291)達(dá)到最終濃度10μg/ml，在30℃用酶處理20分鐘。加入3％乙酸(AcOH)停止反應(yīng)。
向含有切出的[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的V8D5酶反應(yīng)停止液中，加入1.5倍量的去離子水，用5N NaOH調(diào)至pH5.0，沉淀β半乳糖苷酶衍生物片段，在5000rpm離心分離10分鐘除去。
將含有[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的上清液，添加到用0.1％TFA平衡化的TSK-ODS 80Ts柱(粒徑20μm、50mmI.D.x 100mm、TOSOH社制)中。使用從緩沖液A
100％到緩沖液B[50％乙腈、0.095％TFA]100％的濃度梯度，用5柱容量完成程序，進(jìn)行洗脫。分取含有目的肽[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的組分(約50mg)。-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)的制備向含有約50mg(15μmol)[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的50％乙腈水溶液中，加入二碳酸二叔丁基酯6當(dāng)量摩爾(19.2mg，6×15μmol)，用三乙胺調(diào)至pH9，在室溫放置15分鐘。向反應(yīng)液中加入乙酸，使最終濃度達(dá)到0.5％，蒸除乙腈后，將其加入到用含有0.1％TFA的10％乙腈平衡化的EMPORE-辛基(C8)HD 4mm/1ml藥筒(cartridge)中，用平衡化液洗凈后，用含有0.095％TFA的90％乙腈，洗脫出[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)。蒸除乙腈，得到含約30mg的目的物溶液6mL。
從質(zhì)譜分析結(jié)果可知，與Boc化前(測(cè)定分子量＝3396、理論分子量＝3398)相比，Boc化后主要存在分子量多500的物質(zhì)(測(cè)定分子量3395)和、多600的物質(zhì)(測(cè)定分子量＝3995)兩種。
用Kex2蛋白酶將[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)切出和純化向所得[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)水溶液(30mg，6mL)中加入氯化鈣溶液、Tris-HCl pH8.2，分別使最終濃度達(dá)到0.3mM、20mM。添加Kex2蛋白酶(特開平10-229884)溶液，使其達(dá)到1×105unit/ml后，在30℃用蛋白酶處理60分鐘。
在HPLC上，[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)的峰消失，[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)的峰在更具疏水性的一側(cè)出現(xiàn)，并可觀察到與Boc-SRHRR相對(duì)應(yīng)的親水性峰。
確認(rèn)原料消失后，反應(yīng)液用乙酸水調(diào)至pH3.5，添加至用含有1％乙酸的1.0％乙腈平衡化的逆相色譜柱ODS-80Ts(1.66cc柱容積、粒徑20um，TOSOH社制)中。用5柱容積的平衡化液洗凈后，使用從含有1％乙酸的1.0％乙腈到90.0％乙腈的濃度梯度洗脫，進(jìn)行5柱容積完成程序，洗脫出[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)。將主組分冷凍干燥，得到目的保護(hù)肽6.2mg。
片段縮合和脫保護(hù)向Ghrelin(1-5)(190mg，0.0301mmol，化合物31)的三氟乙醇(TFE)溶液(6.00ml)中加入三乙胺(51.0μl，0.366mmol)、二碳酸二叔丁基酯(78.0mg，0.0356mmol)的TFE溶液(4.00ml)，在室溫?cái)嚢?3小時(shí)。減壓蒸除溶劑，向所得殘?jiān)屑尤朊?20.0ml)，得到[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)180.5mg。
然后，向[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)(22.0mg，0.0301mmol)的DMF(1.00ml)溶液中加入HOSu(5.20mg，0.0452mmol)后，在-30℃浴中加入DIPCI(7.30μl，0.0466mmol)。在-30℃浴攪拌1小時(shí)，在室溫?cái)嚢?8小時(shí)后，減壓蒸除溶劑，所得殘查用醚形成粉末，得到[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)的琥珀酰亞胺酯體[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)-Osu 14.1mg。
然后，向通過重組法制備的[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)(6.10mg，2.18μmol)的DMF(0.6ml)溶液中，加入[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)-OSu(3.3mg，3.96μmol)、三乙胺(2.5μl，17.9μmol)，在室溫?cái)嚢?4小時(shí)。減壓蒸除溶劑，向所得殘查中，在冰冷卻下，直接加入TFA(2.00ml)，在室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。減壓蒸除TFA后，向殘?jiān)屑尤朊眩玫胶衦Ghrelin(1-28)的粗肽6.2mg。
將本品溶于5％乙酸(AcOH)2ml中，添加到Y(jié)MC-Pack-ODS-A(5μm，20mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從0％至95％為止線性梯度洗脫60分鐘(流速10ml/min)。分取目的組分后冷凍干燥，再添加至YMC-Pack PROTEIN-RP(C4，10mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從7.5％至21.3％為止線性梯度洗脫30分鐘(流速4.7ml/min)。
分取目的組分后，冷凍干燥，進(jìn)一步添加至YMC-PackPROTEIN-RP(C4，10mm×250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈從7.5％至21.3％為止線性梯度洗脫30分鐘(流速4.7ml/min)。分取目的組分后，冷凍干燥，得到rGhrelin(1-28)2.1mg。得到rGhrelin(1-28)2.1mg。該物質(zhì)與在分析用HPLC中的標(biāo)準(zhǔn)品rGhrelin(1-28)保留時(shí)間一致，細(xì)胞內(nèi)鈣提高活性是EC50＝1.5nM，與天然品相同。
ESI-MS 3315.0(理論值3314.8)，氨基酸組成比Ser；3.74(4)，Glx；5.69(6)，Gly；1.18(1)，Ala；2.05(2)，Leu；2，Phe；0.98(1)，Lys；4.98(5)，His；1.03(1)，Arg；1.96(2)，Pro；4.01(4)化合物87[Dleu5]-rGhrelin(1-28)另外，作為[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)的琥珀酰亞胺酯化、或片段縮合時(shí)的副反應(yīng)物，得到[Dleu5]-rGhrelin(1-28)0.8mg。該物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)鈣提高活性是EC50＝220nM。
ESI-MS 3315.0(理論值3314.8)，氨基酸組成比Ser；3.80(4)，Glx；5.92(6)，Gly；1.23(1)，Ala；2.07(2)，Leu；2，Phe；0.97(1)，Lys；4.92(5)，His；1.02(1)，Arg；1.97(2)，Pro；4.11(4)
D2O/DCl水解后的亮氨酸的GC-MS分析L-Leu；1.17(1)，D-Leu；0.83(1)產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的新肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，通過對(duì)人或動(dòng)物給藥，誘導(dǎo)GH的分泌，不伴有實(shí)質(zhì)的副作用，作為改善小兒生長促進(jìn)和成人的GH欠缺引起的代謝機(jī)能缺損的藥物，以及其抗體在GH欠缺引起的疾病的診斷和作為學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域的研究工具，可達(dá)到優(yōu)秀的作用效果。
序列表<110>寒川賢治(Kangawa，Kenji)<120>新的肽(New Peptides)<130>DS03F216(CN)<150>JP 11-210002<151>1999-7-23<150>JP 11-338841<151>1999-11-29<150>JP 2000-126623<151>2000-4-26<160>39<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<223>生長激素促分泌素內(nèi)源肽的核心區(qū)的氨基酸序列<400>1Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro1 5<210>2<211>28<212>PRT<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<223>生長激素促分泌素的大鼠內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>2Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25<210>3<211>28<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<223>生長激素促分泌素的人內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>3Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25<210>4<211>117<212>PRT<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<223>生長激素促分泌素的大鼠內(nèi)源肽的前原形式的氨基酸序列<400>4Met Val Ser Ser Ala Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu1 5 10 15Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln50 55 60Ala Glu Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr Gln Gln His Gly Arg85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asn Lys115<210>5<211>117<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<223>生長激素促分泌素的人內(nèi)源肽的前原形式的氨基酸序列<400>5Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115<210>6<211>501<212>cDNA<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(31)...(381)<223>編碼生長激素促分泌素的大鼠內(nèi)源肽前原形式的cDNA堿基序列<400>6tccagatcat ctgtcctcac caccaaggcc atg gtg tct tca gcg act 48Met Val Ser Ser Ala Thr1 5atc tgc agt ttg cta ctc ctc agc atg ctc tgg atg gac atg gcc atg 96Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu Trp Met Asp Met Ala Met10 15 20gca ggt tcc agc ttc ttg agc cca gag cac cag aaa gcc cag cag aga 144Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg25 30 35aag gaa tcc aag aag cca cca gct aaa ctg cag cca cga gct ctg gaa 192Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu Glu40 45 50ggc tgg ctc cac cca gag gac aga gga caa gca gaa gag gca gag gag240Gly Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln Ala Glu Glu Ala Glu Glu55 60 65 70gag ctg gaa atc agg ttc aat gct ccc ttc gat gtt ggc atc aag ctg288Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu75 80 85tca gga gct cag tac cag cag cat ggc cgg gcc ctg gga aag ttt ctt336Ser Gly Ala Gln Tyr Gln Gln His Gly Arg Ala Leu Gly Lys Phe Leu90 95 100cag gat atc ctc tgg gaa gag gtc aaa gag gcg cca gct aac aag381Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Lys Glu Ala Pro Ala Asn Lys105 110 115taaccactga caggactggt ccctgtactt tcctcctaag caagaactca catccagctt 441ctgcctcctc tgcaactccc agcactctcc tgctgactta caaataaatg ttcaagctgt 501<210>7<211>511<212>DNA<220><221>CDS<222>(34)...(384)<213>智人(Homo sapiens)<223>編碼生長激素促分泌素的人內(nèi)源肽前原形式的cDNA的堿基序列<400>7gcaggcccac ctgtctgcaa cccagctgag gcc atg ccc tcc cca 45Met Pro Ser Pro1ggg acc gtc tgc agc ctc ctg ctc ctc ggc atg ctc tgg ctg gac ttg93Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu Trp Leu Asp Leu5 10 15 20gcc atg gca ggc tcc agc ttc ctg agc cct gaa cac cag aga gtc cag 141Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Set Pro Glu His Gln Arg Val Gln25 30 35cag aga aag gag tcg aag aag cca cca gcc aag ctg cag ccc cga gct 189Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala40 45 50cta gca ggc tgg ctc cgc ccg gaa gat gga ggt caa gca gaa ggg gca237Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln Ala Glu Gly Ala55 60 65gag gat gaa ctg gaa gtc cgg ttc aac gcc ccc ttt gat gtt gga atc285Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile70 75 80aag ctg tca ggg gtt cag tac cag cag cac agc cag gcc ctg ggg aag333Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln Ala Leu Gly Lys85 90 95 100ttt ctt cag gac atc ctc tgg gaa gag gcc aaa gag gcc cca gcc gac381Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala Pro Ala Asp105 110 115aag tgatcgccca caagccttac tcacctctct ctaagtttag aagcgctcat 434Lysctggcttttc gcttgcttct gcagcaactc ccacgactgt tgtacaagct caggaggcga 494ataaatgttc aaactgt 511<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列<223>生長激素促分泌素內(nèi)源肽的核心區(qū)的氨基酸序列<400>8Gly Ser Ser Phe1<210>9<211>10<212>PRT<213>人工序列<223>生長激素促分泌素內(nèi)源肽的核心區(qū)的氨基酸序列<400>9Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln15 10<210>10<211>27<212>PRT<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<223>生長激素促分泌素的大鼠內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)的氨基酸序列<400>10Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25<210>11<211>27<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<223>生長激素促分泌素的人內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)的氨基酸序列<400>11Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25<210>12<211>116<212>PRT<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<223>生長激素分泌素的大鼠內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的氨基酸序列<400>12Met Val Ser Ser Ala Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu1 5 10 15Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln35 40 45Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln Ala50 55 60Glu Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp65 70 75 80Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr Gln Gln His Gly Arg Ala85 90 95Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Lys Glu Ala100 105 110Pro Ala Asn Lys115<210>13<211>116<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<223>生長激素促分泌素的人內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的氨基酸序列<400>13Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln35 40 45Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln Ala50 55 60Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp65 70 75 80Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln Ala85 90 95Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala100 105 110Pro Ala Asp Lys115<210>14<211>498<212>cDNA<213>褐鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(31)...(378)<223>編碼生長激素促分泌素的大鼠內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的cDNA堿基序列<400>14tccagatcat ctgtcctcac caccaaggcc atg gtg tct tca gcg act 48Met Val Ser Ser Ala Thr1 5atc tgc agt ttg cta ctc ctc agc atg ctc tgg atg gac atg gcc atg 96Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu Trp Met Asp Met Ala Met10 15 20gca ggt tcc agc ttc ttg agc cca gag cac cag aaa gcc cag aga aag 144Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys25 30 35gaa tcc aag aag cca cca gct aaa ctg cag cca cga gct ctg gaa ggc 192Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu Glu Gly40 45 50tgg ctc cac cca gag gac aga gga caa gca gaa gag gca gag gag gag 240Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gln Ala Glu Glu Ala Glu Glu Glu55 60 65 70ctg gaa atc agg ttc aat gct ccc ttc gat gtt ggc atc aag ctg tca 288Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser75 80 85gga gct cag tac cag cag cat ggc cgg gcc ctg gga aag ttt ctt cag 336Gly Ala Gln Tyr Gln Gln His Gly Arg Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln90 95 100gat atc ctc tgg gaa gag gtc aaa gag gcg cca gct aac aag 378Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Lys Glu Ala Pro Ala Asn Lys105 110 115taaccactga caggactggt ccctgtactt tcctcctaag caagaactca catccagctt 438ctgcctcctc tgcaactccc agcactctcc tgctgactta caaataaatg ttcaagctgt 498<210>15<211>508<212>DNA<220><221>CDS<222>(34)...(381)<213>智人(Homo sapiens)<223>編碼生長激素促分泌素的人內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的cDNA的堿基序列<400>15gcaggcccac ctgtctgcaa cccagctgag gcc atg ccc tcc cca 45Met Pro Ser Pro1ggg acc gtc tgc agc ctc ctg ctc ctc ggc atg ctc tgg ctg gac ttg93Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu Trp Leu Asp Leu5 10 15 20gcc atg gca ggc tcc agc ttc ctg agc cct gaa cac cag aga gtc cag 141Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln25 30 35aga aag gag tcg aag aag cca cca gcc aag ctg cag ccc cga gct cta 189Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg Ala Leu40 45 50gca ggc tgg ctc cgc ccg gaa gat gga ggt caa gca gaa ggg gca gag 237Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln Ala Glu Gly Ala Glu55 60 65gat gaa ctg gaa gtc cgg ttc aac gcc ccc ttt gat gtt gga atc aag 285Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys70 75 80ctg tca ggg gtt cag tac cag cag cac agc cag gcc ctg ggg aag ttt 333Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln Ala Leu Gly Lys Phe85 90 95 100ctt cag gac atc ctc tgg gaa gag gcc aaa gag gcc cca gcc gac aag 381Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala Pro Ala Asp Lys105 110 115tgatcgccca caagccttac tcacctctct ctaagtttag aagcgctcat431ctggcttttc gcttgcttct gcagcaactc ccacgactgt tgtacaagct caggaggcga 491ataaatgttc aaactgt 508<210>16<211>28<212>PRT<213>豬(Sus scrofa)<223>生長激素促分泌素的豬內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>16Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg20 25<210>17<211>27<212>PRT<213>豬(Sus scrofa)<223>生長激素促分泌素的豬內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)的氨基酸序列<400>17Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg20 25<210>18<211>118<212>PRT<213>豬(Sus scrofa)<223>生長激素促分泌素的豬內(nèi)源肽前原形式的氨基酸序列<400>18Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu1 5 10 15Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu20 25 30His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys35 40 45Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp Ser Gly50 55 60Glu Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro65 70 75 80Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser Asp Gln His Gly85 90 95Gln Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Thr100 105 110Glu Ala Pro Ala Asp Lys115<210>19<211>117<212>PRT<213>豬(Sus scrofa)<223>生長激素促分泌素的豬內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的氨基酸序列<400>19Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu1 5 10 15Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu20 25 30His Gln Lys Val Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu35 40 45Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp Ser Gly Glu50 55 60Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Cys65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser Asp Gln His Gly Gln85 90 95Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Val Thr Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115<210>20<211>494<212>DNA<220><221>CDS<222>(9)...(362)<213>豬(Sus scrofa)<223>編碼生長激素促分泌素的豬內(nèi)源肽的前原形式的cDNA的堿基序列<400>20ctgaggcc atg ccc tcc acg ggg acc att tgc agc ctg ctg ctc ctc 47Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu1 5 10agc gtg ctc ctc atg gca gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttc ttg95Ser Val Leu Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu15 20 25agc ccc gaa cac cag aaa gtg cag cag aga aag gag tcc aag aag cca 143Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro30 35 40 45gca gcc aaa ctg aag ccc cgg gcc ctg gaa ggc tgg ctc ggc cca gaa 191Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu50 55 60gac agt ggt gag gtg gaa ggc acg gag gac aag ctg gaa atc cgg ttc 239Asp Ser Gly Glu Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe65 70 75aac gcc ccc tgt gat gtt ggg atc aag ttg tca ggg gct cag tcc gac 287Asn Ala Pro Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser Asp80 85 90cag cac ggc cag ccc ctg ggg aaa ttt ctc cag gac atc ctc tgg gaa 335Gln His Gly Gln Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu95 100 105gag gtc act gag gcc ccg gcc gac aag tgattgtccc tgagaccagc 382Glu Val Thr Glu Ala Pro Ala Asp Lys110 115cacctctgtt ctcccagcct cctaagggct cacctggctt ccaggacgct tccactatca 442cacccagctc tgagggatgc tagcctggga ggtgaataaa cattcagact gg 494<210>21<211>491<212>DNA<220><221>CDS<222>(9)...(359)<213>豬(Sus scrofa)<223>編碼生長激素促分泌素的豬內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的cDNA的堿基序列<400>21ctgaggcc atg ccc tcc acg ggg acc att tgc agc ctg ctg ctc ctc 47Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu1 5 10agc gtg ctc ctc atg gca gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttc ttg95Ser Val Leu Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu15 20 25agc ccc gaa cac cag aaa gtg cag aga aag gag tcc aag aag cca gca 143Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala30 35 40 45gcc aaa ctg aag ccc cgg gcc ctg gaa ggc tgg ctc ggc cca gaa gac 191Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp50 55 60agt ggt gag gtg gaa ggc acg gag gac aag ctg gaa atc cgg ttc aac 239Ser Gly Glu Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn65 70 75gcc ccc tgt gat gtt ggg atc aag ttg tca ggg gct cag tcc gac cag 287Ala Pro Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser Asp Gln80 85 90cac ggc cag ccc ctg ggg aaa ttt ctc cag gac atc ctc tgg gaa gag 335His Gly Gln Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu95 100 105gtc act gag gcc ccg gcc gac aag tgattgtccc tgagaccagc 379Val Thr Glu Ala Pro Ala Asp Lys110 115cacctctgtt ctcccagcct cctaagggct cacctggctt ccaggacgct tccactatca 439cacccagctc tgagggatgc tagcctggga ggtgaataaa cattcagact gg 491<210>22<211>27<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<223>生長激素促分泌素的牛內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)的氨基酸序列<400>22Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Glu Leu Gln Arg Lys Glu1 5 10 15Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg20 25<210>23<211>89<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<223>生長激素促分泌素的牛內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形的部分氨基酸序列<400>23Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Glu15 10 15Leu Gln Arg Lys Glu Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg20 25 30Thr Leu Glu Gly Gln Phe Asp Phe Glu Val Gly Ser Gln Ala Glu Gly35 40 45Ala Glu Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Phe Phe Asn Ile Gly50 55 60Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gln Ser Leu Gln His Gly Gln Thr Leu Gly65 70 75 80Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu85<210>24<211>267<212>DNA<220><221>CDS<222>(1)...(267)<213>牛(Bos taurus)<223>編碼生長激素促分泌素的牛內(nèi)源肽(27個(gè)氨基酸)前原形式的cDNA的堿基序列<400>24gac ttg gcc atg gcg ggc tcc agc ttt ctg agc ccc gaa cat cag gaa 48Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Glu1 5 10 15ctg cag aga aag gaa gct aag aag cca tca ggc aga ctg aag ccc cgg 96Leu Gln Arg Lys Glu Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg20 25 30acc ctg gaa ggc cag ttt gac ccg gag gtg gga agt cag gcg gaa ggt 144Thr Leu Glu Gly Gln Phe Asp Phe Glu Val Gly Ser Gln Ala Glu Gly35 40 45gca gag gac gag ctg gaa atc cgg ttc aac gcc ccc ttt aac att ggg 192Ala Glu Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Phe Phe Asn Ile Gly50 55 60atc aag cta gca ggg gct cag tcc ctc cag cat ggc cag acg ttg ggg 240Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gln Ser Leu Gln His Gly Gln Thr Leu Gly65 70 75 80aag ttt ctt cag gac atc ctc tgg gaa 267Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu85<210>25<211>24<212>PRT<213>雞(Gallus domesticus)<223>生長激素促分泌素的雞內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>25Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys1 5 10 15Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg20<210>26<211>21<212>PRT<213>Anguilla japonica<220><221>酰胺化<222>21<223>生長激素促分泌素的鰻內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>26Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys1 5 10 15Lys Pro Pro Arg Val20<210>27<211>28<212>PRT<213>Rana cafesbeiana<223>生長激素促分泌素的青蛙內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>27Gly Leu Ser Phe Leu Ser Pro Ala Glu Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg1 5 10 15Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Arg20 25<210>28<211>27<212>PRT<213>爪蟾(Xenopus laevis)<223>生長激素促分泌素的爪蟾內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>28Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg1 5 10 15Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met20 25<210>29<211>23<212>PRT<21 3>Oncorhynchus mykiss<220><221>酰胺化<222>23<223>生長激素促分泌素的虹鱒魚內(nèi)源肽(23個(gè)氨基酸)的氨基酸序列<400>29Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly1 5 10 15Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val20<210>30<211>20<212>PRT<213>Oncorhynchus mykiss<220><221>酰胺化<222>20<223>生長激素促分泌素的虹鱒魚內(nèi)源肽(20個(gè)氨基酸)的氨基酸序列<400>30Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys1 5 10 15Pro Pro Arg Val20<210>31<211>28<212>PRT<213>Canis familiaris<223>生長激素促分泌素的狗內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>31Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25<210>32<211>108<212>PRT<213>Anguilla japonica<223>生長激素促分泌素的鰻內(nèi)源肽的前原形式的氨基酸序列<400>32Met Lys Arg Thr Ala Tyr Ile Ile Leu Leu Val Cys Val Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Met Asp Ser Val Gln Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln20 25 30Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg Arg Asp35 40 45Ser Asp Gly Ile Leu Asp Leu Phe Met Arg Pro Pro Leu Gln Asp Glu50 55 60Asp Ile Arg His Ile Thr Phe Asn Thr Pro Phe Glu Ile Gly Ile Thr65 70 75 80Met Thr Glu Glu Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Glu Val Met Gln Lys Ile85 90 95Met Gln Asp Leu Leu Met Asp Thr Pro Ala Lys Glu100 105<210>33<211>114<212>PRT<213>爪蟾(Xenopus laevis)<223>生長激素促分泌素的爪蟾內(nèi)源肽的氨基酸序列<400>33Met Asn Phe Gly Lys Ala Ala Ile Phe Gly Val Val Leu Phe Cys Leu1 5 10 15Leu Trp Thr Glu Gly Ala Gln Ala Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala20 25 30Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His35 40 45Gly Asn Met Asn Arg Arg Gly Val Glu Asp Asp Leu Ala Gly Glu Glu
50 55 60Ile Gly Val Thr Phe Pro Leu Asp Met Lys Met Thr Gln Glu Gln Phe65 70 75 80Gln Lys Gln Arg Ala Ala Val Gln Asp Phe Leu Tyr Ser Ser Leu Leu85 90 95Ser Leu Gly Ser Val Gln Asp Thr Glu Asp Lys Asn Glu Asn Pro Gln100 105 110Ser Gln<210>34<211>82<212>PRT<213>Oncorhynchus mykiss<223>生長激素促分泌素的虹鱒魚內(nèi)源肽(23個(gè)氨基酸)的前原形式的氨基酸序列<400>34Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala Lys Ser Val Ser1 5 10 15Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln20 25 30Gly Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg Arg Asp Ile Glu Ser Phe35 40 45Ala Glu Leu Phe Glu Gly Pro Leu His Gln Glu Asp Lys His Asn Thr50 55 60Ile Lys Ala Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser Glu Glu Glu Phe65 70 75 80Gln Glu<210>35<211>99<212>PRT<213>Oncorhynchus mykiss<223>生長激素促分泌素的虹鱒魚內(nèi)源肽(20個(gè)氨基酸)的前原形式的氨基酸序列<400>35Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala Lys Ser Val Ser1 5 10 15Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly20 25 30Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg Arg Asp Ile Glu Ser Phe Ala Glu Leu35 40 45Phe Glu Gly Pro Leu His Gln Glu Asp Lys His Asn Thr Ile Lys Ala50 55 60Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser Glu Glu Glu Phe Gln Glu Tyr65 70 75 80Gly Ala Val Leu Gln Lys Ile Leu Gln Asp Val Leu Gly Asp Thr Ala85 90 95Thr Ala Glu<210>36<211>503<212>DNA<220><221>CDS<222>(66)...(389)<213>Anguilla japonica<223>編碼生長激素促分泌素的鰻內(nèi)源肽的前原形式的cDNA的堿基序列<400>36tccaagaggc actgggtttc ctcttaaagt gcaaaactcc actgtgagct tcagacatga 60ggcag atg aaa cgc acc gca tac atc atc ctg ctg gtc tgc gtc ctg 107Met Lys Arg Thr Ala Tyr Ile Ile Leu Leu Val Cys Val Leu1 5 10gcg ctg tgg atg gac tct gtc cag gct ggc tcc agc ttc ctc agc ccc155Ala Leu Trp Met Asp Ser Val Gln Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro15 20 25 30tca cag aga ccg cag ggg aag gat aag aag cct ccc agg gtt ggc aga203Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg35 40 45cga gac tca gat ggg atc ctg gac ctg ttt atg agg ccc cca ttg cag251Arg Asp Ser Asp Gly Ile Leu Asp Leu Phe Met Arg Pro Pro Leu Gln50 55 60gat gaa gac atc aga cac att acg ttt aac act cct ttt gag atc ggg299Asp Glu Asp Ile Arg His Ile Thr Phe Asn Thr Pro Phe Glu Ile Gly65 70 75atc acc atg act gag gag ctg ttc cag caa tat gga gaa gtg atg cag347Ile Thr Met Thr Glu Glu Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Glu Val Met Gln80 85 90aag atc atg cag gat ttg ctg atg gac aca cct gcc aaa gag389Lys Ile Met Gln Asp Leu Leu Met Asp Thr Pro Ala Lys Glu95 100 105tgacaagagt ggatatgatc tggacttcat aaaaccctgc gtcccatata ttcctgcatt 449attgcatgca taattcaacc aattgttaaa catttaataa aattttgcaa acgc503<210>37<211>484<212>DNA<220><221>CDS<222>(47)...(388)<213>爪蟾(Xenopus laevis)<223>編碼生長激素促分泌素的爪蟾內(nèi)源肽的前原形式的cDNA的堿基序列secretagogue<400>37tttcactttt atctcgcagg cggcaccggt gaccaggacc ttcagg 46atg aat ttt ggt aaa gcc gcc arc ttt ggg gtt gtc ttg ttc tgc ctg94Met Asn Phe Gly Lys Ala Ala Ile Phe Gly Val Val Leu Phe Cys Leu1 5 10 15ctg tgg acg gag ggg gcc cag gct ggc ttg acc ttc ctg agt cca gcc 142Leu Trp Thr Glu Gly Ala Gln Ala Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala20 25 30gac atg cag aag att gcg gag agg caa tca cag aat aag ctg aga cac 190Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His35 40 45ggc aat atg aat cgc agg ggt gtg gag gat gac ctg gcc ggg gag gag 238Gly Asn Met Asn Arg Arg Gly Val Glu Asp Asp Leu Ala Gly Glu Glu50 55 60atc ggg gtg acc ttc cct ctg gat atg aag atg acg cag gag cag ttc286Ile Gly Val Thr Phe Pro Leu Asp Met Lys Met Thr Gln Glu Gln Phe65 70 75 80cag aag cag agg gct gcg gtg cag gac ttc ctg tac tcc tcc ctc ctc334Gln Lys Gln Arg Ala Ala Val Gln Asp Phe Leu Tyr Ser Ser Leu Leu85 90 95tct ctc ggg tca gtg cag gat aca gaa gac aag aat gaa aat cct cag382Ser Leu Gly Ser Val Gln Asp Thr Glu Asp Lys Asn Glu Asn Pro Gln100 105 110agc caa tgagaatgat gaaaatccgc tcgtctctga tgcccctccc cgatctgtgt 438Ser Glngtctttatta tctctgtgta acccagaaat aaatcttatt tatggc 484<210>38<211>462<212>DNA<220><221>CDS<222>(12)...(257)<213>Oncorhynchus mykiss<223>編碼生長激素促分泌素的虹鱒魚內(nèi)源肽(23個(gè)氨基酸)的前原形式的cDNA的堿基序列<400>38tcacaggtct c atg ata ctg atg ctg tgt act ctg gct ctg tgg gcc47Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala1 5 10aag tca gtc agt gct ggc tcc agc ttc ctc agc ccc tcc cag aaa cca 95Lys Ser Val Ser Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro15 20 25cag gta aga cag ggt aaa ggg aag ccc cct cga gtt ggt cgg cga gac143Gln Val Arg Gln Gly Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg Arg Asp30 35 40att gag agc ttt gct gag ctg ttt gag ggt ccc ctt cac cag gaa gac191Ile Glu Ser Phe Ala Glu Leu Phe Glu Gly Pro Leu His Gln Glu Asp45 50 55 60aaa cac aat acg atc aag gct cct ttt gag atg ggc atc acc atg agt 239Lys His Asn Thr Ile Lys Ala Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser65 70 75gag gag gag ttc cag gag tatggtgccg tgctgcagaa gatcctgcag 287Glu Glu Glu Phe Gln Glu80gacgtcctgg gagacactgc cactgcagaa tgatcacaac ttggcataga cacggaatac347aaagaacctc cattccctgt tctccaactt tcctttctca acttgtctta tacccaatgt407actgtgtgaa catcgtttga attgtaaaag atgaataaaa taaccgcggc cgcta 462<210>39<211>453<212>DNA<220><221>CDS<222>(12)...(308)<213>Oncorhynchus mykiss<223>編碼生長激素促分泌素的虹鱒魚內(nèi)源肽(20個(gè)氨基酸)的前原形式的cDNA的堿基序列<400>39tcacaggtct c atg ata ctg atg ctg tgt act ctg gct ctg tgg gcc 47Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala1 5 10aag tca gtc agt gct ggc tcc agc ttc ctc agc ccc tcc cag aaa cca95Lys Ser Val Ser Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro15 20 25cag ggt aaa ggg aag ccc cct cga gtt ggt cgg cga gac att gag agc 143Gln Gly Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg Arg Asp Ile Glu Ser30 35 40ttt gct gag ctg ttt gag ggt ccc ctt cac cag gaa gac aaa cac aat 191Phe Ala Glu Leu Phe Glu Gly Pro Leu His Gln Glu Asp Lys His Asn45 50 55 60acg atc aag gct cct ttt gag atg ggc atc acc atg agt gag gag gag 239Thr Ile Lys Ala Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser Glu Glu Glu65 70 75ttc cag gag tat ggt gcc gtg ctg cag aag atc ctg cag gac gtc ctg 287Phe Gln Glu Tyr Gly Ala Val Leu Gln Lys Ile Leu Gln Asp Val Leu80 85 90gga gac act gcc act gca gaa tgatcacaac ttggcataga cacggaatac 338Gly Asp Thr Ala Thr Ala Glu95aaagaacctc cattccctgt tctccaactt tcctttctca acttgtctta tacccaatgt398actgtgtgaa catcgtttga attgtaaaag atgaataaaa taacactgct tcctt 45權(quán)利要求
1.肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述肽是具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的肽，其至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代。
2.權(quán)利要求1記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸序列，該氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列或(b)具有該序列中至少從氨基末端第4至第10個(gè)氨基酸的序列，且在該氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求2記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23記載的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.25、26、29、30、31、32、34和35記載的氨基酸序列。
5.肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，是具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性和誘導(dǎo)生長激素分泌的活性的肽，(a)其構(gòu)成氨基酸被修飾或不被修飾，且(b)至少一個(gè)氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代。
6.權(quán)利要求1或5記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有SEQ ID NO.27、28和33記載的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有氨基酸序列，該氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.2記載的氨基酸序列或(b)具有該序列中至少從氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在從氨基酸末端第4至第10氨基酸的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一個(gè)氨基酸。
8.權(quán)利要求7記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23記載的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求7記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有一個(gè)選自SEQ ID NO.25、26、29、30、31、32、34和35記載的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1或5記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中相當(dāng)于氨基末端第1至第4氨基酸的序列的部分，如下式所示，A-B-C-D-A氨基酸、非氨基酸化合物或無；B氨基酸、非氨基酸化合物或無；(其中，A+B的分子鏈長相當(dāng)于二肽的長度)C或D可相同或不同，表示(a)修飾的氨基酸、(b)具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸，或(c)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸。
11.權(quán)利要求10記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，C是修飾的氨基酸，其向氨基酸α碳原子導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫醚、酰胺或二硫化物鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈；D是具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸。
12.肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，在一個(gè)由選自SEQ IDNO.2、3、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30和31記載的氨基酸序列形成的氨基酸序列中，相當(dāng)于氨基末端的第1至第4氨基酸的序列部分是權(quán)利要求10或11記載的肽類化合物。
13.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中修飾的氨基酸是氨基末端的第3個(gè)氨基酸。
14.權(quán)利要求13記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于修飾的氨基酸中的氨基酸是絲氨酸或半胱氨酸。
15.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，含有修飾的氨基酸，其向氨基酸α碳原子導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、或脲鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)H或具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈。
16.權(quán)利要求1、2、4、5、6、7、9、10或12記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中修飾的氨基酸是這樣的一種氨基酸其向氨基酸的α碳導(dǎo)入了(a)經(jīng)由或不經(jīng)由具有1個(gè)以上碳原子的亞烷基、經(jīng)由酯、醚、硫酯、硫醚、二硫化物、酰胺、脲或硫脲鍵的具有1個(gè)或多個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基鏈，或(b)具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基鏈。
17.權(quán)利要求1、2、3、5、7或8記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有通過酯鍵修飾的修飾氨基酸。
18.權(quán)利要求1、2、4、5、6、7、9、10、11或12記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有氨基酸側(cè)鏈的官能基是通過形成酯鍵被修飾的修飾氨基酸。
19.權(quán)利要求17記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有其氨基酸側(cè)鏈的羥基與脂肪酸形成酯鍵的氨基酸。
20.權(quán)利要求18記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有脂肪酸與氨基酸側(cè)鏈中的羥基形成酯鍵或與巰基形成硫酯鍵的氨基酸。
21.權(quán)利要求19記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有與具有2至35個(gè)碳原子的脂肪酸鍵合的氨基酸。
22.權(quán)利要求20記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸的碳原子數(shù)是2～35。
23.權(quán)利要求21記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有結(jié)合了選自具有2、4、6、8、10、12、14、16和18個(gè)碳原子的脂肪酸的氨基酸。
24.權(quán)利要求22記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是選自具有2、4、6、8、10、12、14、16和18個(gè)碳原子的脂肪酸。
25.權(quán)利要求23記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是辛酸或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸。
26.權(quán)利要求24記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是辛酸或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸。
27.權(quán)利要求23記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中結(jié)合的脂肪酸是癸酸或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸。
28.權(quán)利要求24記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中脂肪酸是癸酸或其單烯脂肪酸或其多烯脂肪酸。
29.肽類化合物，其特征在于，權(quán)利要求1至28記載的肽類化合物的羧基末端，進(jìn)一步結(jié)合了堿性氨基酸。
30.權(quán)利要求1，2，3，5，7，8，13，14，15，17，19，21，23，25，27項(xiàng)記載的肽類化合物，其特征在于，氨基末端是被具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或?；揎椀暮?或羧基末端羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))。
31.權(quán)利要求1，2，4，5，6，7，9，10，11，12，16，18，20，22，24，26，28，29記載的肽類化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通過導(dǎo)入具有1個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和烴基或酰基被修飾和/或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示藥學(xué)上可接受的陽離子或低級(jí)支鏈或非支鏈烷基，R2和R3可相同或不同，表示選自H和低級(jí)支鏈或非支鏈烷基的基團(tuán))。
32.肽類化合物，其特征在于，在權(quán)利要求30或31記載的肽類化合物的羧基末端酰胺衍生物中，進(jìn)一步導(dǎo)入堿性基團(tuán)。
33.權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有効成分的藥物組合物。
34.治療生長激素欠缺或減少引起的疾病的藥物組合物，其含有權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有効成分。
35.治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的藥物組合物，其含有非起因于生長激素欠缺或減少的疾病所涉及的治療劑和 1至32記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
36.適用于人以外動(dòng)物的權(quán)利要求33至35記載的藥物組合物。
37.生長激素欠缺或減少為起因的疾病的治療方法，其中使用權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物給藥。
38.非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，包括使用非起因于生長激素欠缺或減少的疾病所涉及的治療劑和含有 1至32記載的肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物給藥。
39.適用于人以外動(dòng)物的權(quán)利要求37或38記載的治療方法。
40.DNA，是編碼權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物氨基酸序列的DNA，該DNA具有編碼肽的堿基序列，該肽在所述DNA編碼的氨基酸序列中具有至少一個(gè)氨基酸能被修飾的識(shí)別序列。
41.權(quán)利要求40記載的DNA，其中堿基序列是選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21、24、36、37、38和39記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列。
42.權(quán)利要求40記載的DNA，其中堿基序列是編碼氨基酸的堿基序列，其選自SEQ ID NO.6、7、14、15、20、21、24、36、37、38和39記載的堿基序列中的一個(gè)堿基序列。
43.具有權(quán)利要求40至42記載的DNA的載體。
44.含有權(quán)利要求43記載的載體的細(xì)胞。
45.可產(chǎn)生肽類化合物的細(xì)胞，具有包含權(quán)利要求40至42記載的DNA的載體，且具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽化合物是所述氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸被修飾。
46.與權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物相對(duì)應(yīng)的抗體。
47.權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的測(cè)定方法，其特征在于，通過權(quán)利要求46記載的抗體檢測(cè)權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物。
48.權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，通過權(quán)利要求46記載的抗體檢測(cè)權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物。
49.權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重組技術(shù)制造權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的方法中，通過含有權(quán)利要求40至42記載的DNA的載體，將可修飾所述肽中的至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中采集目的肽類化合物。
50.權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重組技術(shù)制造權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的方法中，通過含有權(quán)利要求40至42記載的DNA的載體將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物采集目的物質(zhì)后，將任意的氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾。
51.權(quán)利要求19至28記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重組技術(shù)制造權(quán)利要求19至28記載的肽類化合物的方法中，使用具有可使脂肪酸與氨基酸側(cè)鏈中的羥基形成酯鍵或與巰基形成硫酯鍵活性的細(xì)胞。
52.權(quán)利要求19至28記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.8記載的氨基酸序列中的絲氨酸側(cè)鏈的羥基與脂肪酸形成酯鍵的絲氨酸?；钚缘募?xì)胞。
53.權(quán)利要求19至28記載的肽類化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.28記載的氨基酸序列中的蘇氨酸側(cè)鏈中的羥基與脂肪酸形成酯鍵的酰化活性細(xì)胞。
54.基因治療用藥物組合物，通過將含有編碼權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的至少具有一個(gè)修飾的氨基酸的肽，以治療生長激素欠缺或減少導(dǎo)致的疾病。
55.生長激素欠缺或減少引起的疾病的治療方法，其特征在于，通過將具有編碼權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入細(xì)胞，得到具有生長激素分泌誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被該DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸能被修飾的識(shí)別序列。
56.治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的基因治療用藥物組合物，通過將具有編碼權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度活性的具有至少一個(gè)氨基酸被修飾的肽。
57.治療非起因于生長激素欠缺或減少的疾病的治療方法，其特征在于通過將具有編碼權(quán)利要求1至32記載的肽類化合物的氨基酸序列的DNA的載體，插入生物體內(nèi)細(xì)胞中，得到具有生長激素誘導(dǎo)活性的肽，該細(xì)胞可產(chǎn)生肽，該肽是具有被所述DNA編碼的氨基酸序列的肽，它具有至少一個(gè)氨基酸能被修飾的識(shí)別序列。
全文摘要
本發(fā)明提供誘導(dǎo)生長激素分泌的新的肽類化合物。肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽,其特征在于,具有提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的活性,至少一個(gè)氨基酸被修飾氨基酸和/或非氨基酸化合物替代。
文檔編號(hào)C07K14/46GK1362968SQ00810440
公開日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2000年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月23日
發(fā)明者寒川賢治, 兒島將康, 細(xì)田洋司, 松尾壽之, 南竹義春 申請(qǐng)人:寒川賢治