一種猴頭菌的培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌絲體、生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種猴頭菌的培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌絲體、生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物及其用途。該猴頭菌的培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入中藥半枝蓮，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和半枝蓮，每100份的培養(yǎng)基中包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基70～50份，半枝蓮30～50份；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量份的各組分：麥麩490～350份，玉米粉140～100份，谷糠63～45份，白糖7～5份，水400～600份。該生物轉(zhuǎn)化菌絲體是將猴頭菌接入上述培養(yǎng)基經(jīng)菌絲轉(zhuǎn)化培養(yǎng)所得的產(chǎn)物。該生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物是將猴頭菌絲體經(jīng)水提后再減壓濃縮，最后真空冷凍干燥而制備出來的。該生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物具有抗胃腸道癌作用，作用明顯優(yōu)于猴頭菌絲體或半枝蓮的抗胃腸道癌作用，可用于制備抗胃腸道癌藥物。
【專利說明】
-種猴頭菌的培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌竺體、生物轉(zhuǎn)化菌竺體的提 取物及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種猴頭菌的培養(yǎng)基、生物轉(zhuǎn)化菌絲體、 生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 猴頭菌是一種猴頭菌科磨茹(真菌），在中藥用于治療胃腸道疾病已經(jīng)超過2000年 的歷史了，一系列小分子化合物如erinacines，被認為具有神經(jīng)再生，并且可W透過血腦屏 障修復(fù)受損神經(jīng)組織。猴頭菌還有抗?jié)?，抗炎，抗微生物，免疫調(diào)節(jié)，提高肝功能，抗衰老， 降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加屯、臟輸出、和改善備注循環(huán)等作用，包含猴頭菌的 醫(yī)用制劑在中國廣泛使用。
[0003] 猴頭菌絲體中的活性物質(zhì)最重要的是多糖及糖蛋白，目前國內(nèi)外對猴頭多糖的研 究表明，猴頭菌多糖具有多種生物活性和藥理作用，能增強巨隧細胞的吞隧功能，促進溶血 素的形成，抗白細胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突變和抗衰老等。因此，猴頭菌多糖備 受人們關(guān)注，成為近年來分子生物學(xué)、醫(yī)藥、食品科學(xué)等領(lǐng)域研究和開發(fā)應(yīng)用的熱點。《中國 藥典》記載了猴頭菌絲體(參見2015年版一部的第1614-1615頁），本發(fā)明所述的猴頭菌絲體 就是該標準記載的猴頭菌絲體。
[0004] 當(dāng)前，從高等真菌及其培養(yǎng)物中進行篩選和發(fā)現(xiàn)活性成分，應(yīng)用于抗腫瘤、抗病 毒、和治療糖尿病等，不僅成為國家重點研究新藥的發(fā)展方向，也是當(dāng)今世界各國開發(fā)生物 醫(yī)藥的熱點。但是，目前并未見到中藥作為猴頭菌的培養(yǎng)基經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后的新型藥用菌 絲體應(yīng)用于胃腸道癌的報道。
[0005] 半枝蓮(學(xué)名：Scutellaria barbata D.Don)，別稱:半支蓮(植物學(xué)大辭典）、松葉 牡丹、龍須牡丹、金絲杜酷、洋馬齒寬、太陽花、午時花，是馬唇形科黃琴屬多年生草本植物。 半支蓮全草入藥，具有清熱解毒、活血桂疲、消腫止痛、抗癌等功能。性寒味酸，全草含多種 維生素、微量元素及氨基酸等成分。有涼血解毒，散疲止痛，消腫和清熱利濕之功效。半枝蓮 含有生物堿、黃酬類武、醬體W及酪類、較質(zhì)等。其所含的半枝蓮素，系一種黃酬類化合物 (2，5-二徑基-6，7，8-S甲氧基黃酬），此外，還有另兩種黃酬類化合物漢黃等素（5，7-二徑 基-8甲氧基黃酬)和5-徑基-7,8-二甲氧基黃酬。動物實驗證實，半枝蓮對肉瘤180、艾氏腹 水癌、腦瘤22等均有一定抑制作用。
[0006] 日本學(xué)者在通過體外實驗對800種中藥作抗腫瘤活性篩選時發(fā)現(xiàn)有88種中藥對腫 瘤細胞增殖的抑制率在90% W上，其中半枝蓮對JTc-26瘤細胞體外抑制率達100%，其對正 常細胞的抑制率則僅為50%。在觀察運些中藥的臨床抗腫瘤療效時發(fā)現(xiàn)，即使是對治療乏 術(shù)的晚期腫瘤，亦有改善癥狀、抑制腫瘤增殖和延長患者生命的作用。實驗還證實，用美藍 試管法，半技蓮對急性粒細胞型白血病細胞有輕度抑制作用；用細胞呼吸法，對急性粒細胞 型白血病細胞和抑制率大于75%。半枝蓮制劑還對W256.U14.S186.EAC、ESC等動物腫瘤均 有一定抑制作用。除抗癌作用外，半枝蓮還有抑菌、利尿、止咳、平喘等多種藥理作用。
[0007] 胃腸道癌如肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌是最常見的癌癥之一，據(jù)美國癌癥學(xué)會估計約占 所有癌癥的25%。胃癌在世界上發(fā)病率在癌癥中位于第四位，中國有很高的發(fā)生率和死亡 率(50%的死亡病例發(fā)生在中國），胃腸道癌的治療包括手術(shù)、化學(xué)藥物治療、放射治療與免 疫療法?；瘜W(xué)治療是最常用的方法，雖然無法徹底治療。過去的幾十年里，分子生物學(xué)的發(fā) 展在胃癌的治療上取得了一定的進展，但藥物耐受和毒性依然限制了治療方法的進步。
[0008] 生物轉(zhuǎn)化"菌絲體"是指利用菌絲體(包括真菌）的代謝功能，使有機物分解的生物 化學(xué)反應(yīng)過程。W適宜的培養(yǎng)基為營養(yǎng)，通過菌絲體的生長代謝和生命活動產(chǎn)生豐富的次 生代謝產(chǎn)物。借鑒中醫(yī)藥組方思想，將單味中藥、具有類似或協(xié)同作用的中藥作為部分培養(yǎng) 基進行菌絲體轉(zhuǎn)化，不同菌株誘變"次生"代謝不同的生物活性成分，再實行"定向培養(yǎng)、雙 向轉(zhuǎn)化"生物轉(zhuǎn)化工藝，可獲得不同生物活性物質(zhì)原料，目的是增強功效或者降低藥物毒副 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，跨學(xué)科創(chuàng)新，結(jié)合微生物學(xué)、中藥學(xué)等多學(xué)科， 提供一種新原料(半枝蓮)作為猴頭菌的培養(yǎng)基成分，即本發(fā)明的目的在于提供一種生物轉(zhuǎn) 化菌絲體、生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物及其用途。所述生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物的制備方法 簡單，成本較低，提取物用于制備抗胃腸道癌藥物。
[0010] 基于上述目的，本發(fā)明的一種猴頭菌的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和半枝蓮，每100 份的培養(yǎng)基中包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基70~50份，半枝蓮30~50份;所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量 份的各組分：
[0011] 麥教490~350份，玉米粉140~100份，谷慷63~45份，白糖7~5份，水400~600份。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量份的各組分：
[0013] 麥教420份，玉米粉120份，谷慷54份，白糖6份，水500份。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，每100份的培養(yǎng)基中包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基60份，半枝蓮40份;所述 基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量百分數(shù)的各組分:麥教70%、玉米粉20%、谷慷9%、白糖1%。此為 最佳猴頭菌培養(yǎng)基配比。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種生物轉(zhuǎn)化菌絲體，將猴頭菌類菌株接種至所述的培養(yǎng)基中， 在20~27°C下，培育30~40天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述猴頭菌類菌株為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers。
[0017] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述猴頭菌科真菌猴頭菌化ricium e;rinaceum(Bull. ex 化.化ers.的菌絲體與其附生含有半枝蓮成份的固體培養(yǎng)基的干燥混合物。
[0018] 進一步的，本發(fā)明還提供了一種生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物，所述提取物通過W下 步驟制備得到：
[0019] (1)將所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體進行水提，50-70°C下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5 小時，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌絲體重量的6~10倍，得到提取液；
[0020] (2)將步驟（1)中的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在50-70°C條件下 抽真空干燥，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物。
[0021 ]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述用水浸泡的溫度為60°C ;將減壓濃縮所得的濃縮液在60 °c條件下抽真空干燥。
[0022] 更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物在制備抗胃腸道癌 藥物中的用途。
[0023] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述胃腸道癌為食管癌、胃癌、結(jié)腸癌或肝癌。
[0024] 本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物采用簡單的處理工藝制備得到，其抗腫瘤效果 就達到預(yù)料不到的技術(shù)效果，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化的"菌絲體"的抗腫瘤效果好于所有的天然植物來 源的中藥材，如果進一步分離純化富集有效成分，其抗腫瘤效果將更好，可用于制備抗胃腸 道癌藥物。
[0025] 猴頭菌是一種藥用真菌，能很好地吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)，徹底轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，產(chǎn)生新的 活性物質(zhì)及代謝物，為此，本發(fā)明將中藥半枝蓮加入到猴頭菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，作為猴頭菌 的培養(yǎng)基成分之一，并對中藥材半枝蓮滲入猴頭菌的培養(yǎng)基的比率進行調(diào)配，最終選擇中 藥材半枝蓮最佳滲入的比率為40%。半枝蓮占40%比率時，菌絲體生長情況較好，總黃酬、 野黃琴巧含量較高。
[0026] 猴頭菌對半枝蓮進行中藥菌絲體轉(zhuǎn)化，得到新的菌絲體。本發(fā)明對所得的生物轉(zhuǎn) 化菌絲體進行提取，得到的生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物進行了體外抗胃腸道腫瘤細胞活性篩 選試驗，水提樣品WIC50值和Emax為評價指標，試驗結(jié)果表明：生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物對 胃腸道腫瘤細胞均有較好的抑制作用，體外抗癌作用由強到弱為:生物轉(zhuǎn)化菌絲體〉半枝蓮 藥材〉猴頭菌絲體 > 猴頭菌絲體+半枝蓮，該生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物抗胃腸道癌作用明顯 優(yōu)于猴頭菌絲體或半枝蓮的抗胃腸道癌作用，而且生物轉(zhuǎn)化菌絲體的IC50值大于單獨半枝 蓮藥材和單獨猴頭菌絲體的IC50值之和，Emax大于單獨半枝蓮藥材和單獨猴頭菌絲體的 Emax之和，運說明猴頭菌中豐富的酶系通過結(jié)構(gòu)修飾或降解作用，把半枝蓮中的活性成分 轉(zhuǎn)化成活性更強的成分，或增強了半枝蓮中的活性成分(如總黃酬）的產(chǎn)量，或把非活性成 分轉(zhuǎn)化成活性成分，活性成分相互促進達到增強抗癌功效的目的；同時進行人胃癌(MGC80- 3)移植裸小鼠體內(nèi)抑瘤試驗，試驗結(jié)果表明：生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物對人胃癌(MGC80-3) 荷瘤裸鼠具有明顯的抑瘤作用。因此，生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物可用于制備抗胃腸道癌藥 物。
[0027] 本發(fā)明低溫水浸泡生物轉(zhuǎn)化菌絲體，在50-70°C下水浸泡，無高溫破壞，既能溶解 有效成分但又不破壞有效成分;50-70°C減壓濃縮，不會破壞有效成分，特別是活性酶類物 質(zhì);為了不影響有關(guān)活性物質(zhì)，本發(fā)明優(yōu)選采用60°C條件下抽真空干燥。
【附圖說明】
[002引圖1為皿-4體內(nèi)抗胃癌MGC80-3移植瘤療效和動物毒性圖；
[0029] 圖2為皿-4對人胃癌移植荷瘤裸鼠瘤體抑瘤影響圖；其中，注:給藥后Di〇;A.模型對 照組;B.皿-4低劑量組;C.皿-4中劑量組;D.皿-4高劑量組;E.氣尿喀晚組;F.氣尿喀晚+HB- 4組;G 皿-4(2000mg/kg)組；
[0030] 圖3為皿-4對人胃癌移植荷瘤裸鼠瘤體解剖圖；
[0031] 圖4為皿-4體內(nèi)抗胃癌MGC80-3移植瘤體重下降率的影響結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0032] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合具體實施例，對本發(fā) 明進一步詳細說明。
[0033] 實施例1
[0034] -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0035] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥教490g、玉米粉140g、谷慷63g、白糖7g，W及中藥材半枝蓮粗粉 (半枝蓮)300g，混勻，加入500g水拌勻，即得猴頭菌的培養(yǎng)基。再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在 27 °C條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)40天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體；
[0036] (2)取生物轉(zhuǎn)化菌絲體，60°C水浸泡2次，每次浸泡2小時，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌 絲體重量的6倍，得到提取液；
[0037] (3)將提取后獲得的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽 真空干燥，即得提取物。
[003引實施例2
[0039] -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0040] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥教420g、玉米粉120g、谷慷54g、白糖6g，w及中藥材半枝蓮粗粉 (半枝蓮)400g，混勻，加入500g水拌勻，即得猴頭菌的培養(yǎng)基;再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在 20°C條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)40天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體；
[0041 ] (2)取生物轉(zhuǎn)化菌絲體，60°C水浸泡3次，每次浸泡3小時，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌 絲體重量的8倍，得到提取液；
[0042] (3)將提取后獲得的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽 真空干燥，即得提取物。
[0043] 實施例3
[0044] -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0045] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥教350g、玉米粉lOOg、谷慷45g、白糖5g，W及中藥材半枝蓮粗粉 (半枝蓮)500g，混勻，加入500g水拌勻，即得猴頭菌的培養(yǎng)基;再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在 25 °C條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)30天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體；
[0046] (2)取生物轉(zhuǎn)化菌絲體，60°C水浸泡3次，每次浸泡4小時，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌 絲體重量的10倍，得到提取液；
[0047] (3)將提取后獲得的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽 真空干燥，即得提取物。
[004引實施例4半枝蓮滲入比例試驗
[0049]基礎(chǔ)培養(yǎng)基投料W干料計，比率固定為:麥教70 %、玉米粉20%、谷慷9%、白糖1 % (不包括水）。本發(fā)明把中藥材半枝蓮作為培養(yǎng)基成分之一，中藥材半枝蓮滲入的比率分別 占猴頭菌培養(yǎng)基總量的30%、40%、50 %，設(shè)計實驗方案，總投料5000g，分別按上述實施例 1、實施例2、實施例3所述的步驟配制培養(yǎng)基，加水500g混勻、滅菌、接種、培養(yǎng)，平行對照，培 養(yǎng)條件完全一致，培養(yǎng)過程中觀察菌絲體生長狀況、生長周期、污染情況、生長速度，挖瓶后 烘干稱重計算收率，檢測樣品中的纖維素酶、麥角醬醇含量(考察轉(zhuǎn)化是否徹底）、總黃酬含 量、野黃琴巧含量，干燥后的樣品分別標注為皿-1、皿-2、皿-3。試驗結(jié)果統(tǒng)計如下表1所示： [(K)加]表1 「AAC 4 I
[0052] 試驗結(jié)果表示:半枝蓮占 50%時污染率高、生長速度慢、生長周期長、纖維素酶麥 角醬醇含量低，生物轉(zhuǎn)化不徹底;而半枝蓮占 30 %時生長速度較快、生長周期短，但總黃酬、 野黃琴巧含量低;半枝蓮占 40 %比率時最為合適，菌絲體生長情況較好，兼顧各優(yōu)勢，為最 佳比率。
[0053] 實施例5體外抗胃腸道腫瘤細胞活性篩選試驗
[0化4] 1.試驗材料
[0化5] 1.1細胞株
[0056]人食管癌細胞6〇曰-109、人胃癌細胞16〔80-3、人結(jié)腸癌細胞1〇￥〇購自于中科院上 海細胞庫，高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株MHCC97-H購自于上海復(fù)祥生物科技有限公司。
[0化7] 1.2供試品
[005引樣品編號:HTJ表示猴頭菌絲體，B化表示半枝蓮中藥材，HTJ+B化表示60%的猴頭 菌絲體+40%半枝蓮中藥材，皿-3、皿-4、皿-5分別表示猴頭菌的培養(yǎng)基中半枝蓮滲入比例 為30 %、40%、50%的生物轉(zhuǎn)化菌絲體。上述樣品平行操作進行如下處理:60°C水浸泡3次， 每次浸泡4小時，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌絲體重量的10倍;將提取后獲得的提取液減壓濃 縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽真空干燥，即得五種提取物，分別編號為HTJ， BZL，HT J+BZL，皿-3，皿-4，皿-5。
[0化9] 1.3陽性對照品
[0060] 注射用順銷(孤P)，由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號：1100331DB;10mg/瓶。
[OOW] 1.4主要試劑
[0062] 高糖DMEM培養(yǎng)基，HyClone公司，批號NXJ0709，500ml/瓶;胎牛血清，HyClone公司， 批號NXC0582，500ml/瓶;嚷挫藍，sigma公司，批號M邸H7489V，Ig/瓶;二甲亞諷，國藥集團化 學(xué)試劑有限公司，批號20120705,500ml/瓶;膜蛋白酶，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，批 號 04D10151，25g/瓶。
[0063] 1.5主要儀器
[0064] CJ-IF型醫(yī)用凈化工作臺（中屯、編號058,蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司）；臺式 低速離屯、機（中屯、編號101，湖南省凱達實業(yè)發(fā)展有限公司）；DMIL型倒置顯微鏡（中屯、編號 027,Leica);3111型C〇2培養(yǎng)箱（中屯、編號147 JhermohMR-QSA酶標儀（中屯、編號007,深圳 邁瑞）；無菌針式過濾器(millipore)。
[00化]2.試驗方法
[0066] 2.1細胞培養(yǎng)與接種
[0067] 6。日-109、]\?^：80-3、]\^〇：97-山1^〇￥〇腫瘤細胞株在37°(：、5%〇)2的飽和濕度環(huán)境下， 含10 %胎牛血清的高糖DMM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代。接種時用0.25 %膜蛋白酶消化液消 化，加細胞培養(yǎng)基吹打成均勻細胞懸液，將細胞制成5 XioVml的細胞懸液，每孔10化1接種 于96孔板中。
[0068] 2.2供試品配制與細胞生長抑制測定
[0069] 稱取一定量供試品，用DMEM完全培養(yǎng)基配制成5000iig/ml的最高濃度工作液，用 0.22皿無菌針式過濾器過濾除菌，然后依次配制成1500、500、150、50、15iig/ml的工作液。 DDP用DMEM完全培養(yǎng)基配制成濃度為50、15、5、1.5、0.75、0.1化邑/1111的工作液。待細胞貼壁 后換用含不同濃度供試品和DDP的工作液，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。分別于加藥后48小時后，每 孔加MTT溶液(培養(yǎng)基配成5mg/ml，過濾后避光保存）2化1，4小時后將上清液吸出，每孔加 MlT溶解液DMSO 15化1，震蕩待化rmazan完全溶解，酶標儀492nm測定OD值。
[0070] 3.試驗結(jié)果
[0071 ]如下表2中見，各樣品對4種腫瘤細胞均有較好的抑制作用，W皿-4號效果最佳。
[0072] 表2不同HTJ培養(yǎng)物體外抗胃腸道腫瘤細胞活性篩選結(jié)果
[0073]
[0074] 從表2中可W看出，體外抗癌活性由強到弱為:生物轉(zhuǎn)化菌絲體〉半枝蓮藥材〉猴頭 菌絲體 > 猴頭菌絲體+半枝蓮，而且生物轉(zhuǎn)化菌絲體的IC50值大于單獨半枝蓮藥材和單獨 猴頭菌絲體的IC50值之和，Emax大于單獨半枝蓮藥材和單獨猴頭菌絲體的Emax之和，結(jié)合 實施例4的結(jié)果說明猴頭菌中豐富的酶系可能通過結(jié)構(gòu)修飾或降解作用，把半枝蓮中的活 性成分轉(zhuǎn)化成活性更強的成分，或增強了半枝蓮中的活性成分(如總黃酬）的產(chǎn)量，或把非 活性成分轉(zhuǎn)化成活性成分，活性成分相互促進達到增強抗癌功效的目的。
[0075] 實施例6皿-4號樣品提取物對人胃癌(MGC80-3)移植裸小鼠體內(nèi)抑瘤試驗
[0076] 1.實驗材料
[0077] 1.1 藥品 [007引1.1.1供試品
[0079] 皿-4號樣品提取物，規(guī)格：126. Ig/袋;批號：20150723,由湖南新匯制藥股份有限 公司提供。
[0080] 1.1.2陽性對照品
[0081] 氣尿喀晚注射液(批號:FA150603,上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品），臨用時用 0.9 %氯化鋼配制。
[0082] 1.2實驗動物
[0083] 雄性BALB/c-nu裸小鼠，90只，SPF級，體重12~15g，由湖南斯萊克景達實驗動物有 限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2014-0003;在湖南省藥物安全評價研究中 屯、屏障環(huán)境B區(qū)實驗室飼養(yǎng)，實驗動物質(zhì)量合格證號:N043004700004931，實驗動物使用許 可證號:SYXK(湘)2014-0008。實驗期間環(huán)境溫度20 °C~26 °C，濕度40 %~70 %。
[0084] 1.3細胞株
[0085] 人胃癌細胞(MGC80-3)購于中科院細胞庫，在湖南省藥物安全評價研究中屯、細胞 室內(nèi)傳代培養(yǎng);DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：041012-UY，Corning公司產(chǎn)品）；胎牛血清（批號： NYL1009 ,HyClone 公司產(chǎn)品）。
[00化]1.4主要儀器
[0087] AUY-220分析天平（日本島津）；數(shù)顯游標卡尺(永康正豐五金）。
[0088] 2.研究內(nèi)容
[0089] 2.1前期試驗結(jié)果
[0090] 皿-4號提取物單次灌胃給予ICR小鼠最大濃度0.15g/ml，最大體積40ml/kg(相當(dāng) 于6g/kg)，當(dāng)日1次，未見明顯急性毒性反應(yīng)。
[0091 ] 2.2. HTJ-4對人移植胃癌荷瘤裸鼠模型的影響
[0092] 2.2.1人胃癌細胞(16〔80-3)的培養(yǎng)
[0093] 用DMM培養(yǎng)基加10%新生牛血清，并加入青鏈霉素各50U/ml，在5%C02的細胞培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按1:4的比例進行傳代，傳代時細胞進入對數(shù)生長期，長滿瓶底70~80%。
[0094] 2.2.2造模分組
[00M]取對數(shù)生長期的人胃癌(MGC80-3)細胞，用PBS洗涂2次，再用無血清DMEM重懸后計 數(shù)，調(diào)整細胞濃度為IX IO7個/ml的細胞液接種于90只裸小鼠右側(cè)蔽窩下，每只裸鼠接種 0.2ml (即2 X IO6個細胞/只），制備荷瘤裸小鼠。觀察瘤體生長情況，用游標卡尺測量瘤體的 長(a)和寬(b)，按瘤體積公式V= 1/2 Xa X b2計算瘤體體積，選擇腫瘤瘤體體積達到200皿3 W上且無潰破的荷瘤裸小鼠，按瘤體體積兼顧體重進行隨機分組，分為7組，分組給藥見表 3。模型對照組灌胃給予蒸饋水，給予體積為0.2ml/10g，氣尿喀晚組動物腹腔注射給藥，注 射體積0.1 mlAOg，其余各組灌胃給予相應(yīng)體積藥液。
[0096] 表3動物分組及劑量設(shè)計
[0097]
[009引 3.結(jié)果評價
[0099] 3.1動物生存質(zhì)量及存活時間評價
[0100] 試驗期間每天觀察動物的飲食、飲水、行為活動和瘤體的狀況，詳細記錄各組動物 的體重變化及死亡情況。
[0101] 3.2瘤體體積、體重的測定
[0102] 在試驗過程中，從分組、給藥開始，每周用游標卡尺測量2次并記錄腫瘤長(a)、寬 化）、體重;計算腫瘤體積并比較各組間腫瘤生長曲線的差異，分析體重變化趨勢。
[0103] 按照W下公式計算腫瘤體積:V=1/2X長(a)X寬(b)2
[0104] 3.3根據(jù)腫瘤體積進行療效評價
[0105] 按照W下公式計算相對腫瘤體積(RTV)和相對腫瘤增殖率T/C%:
[0106] RTV = VtAo
[0107] Vt:每天測量腫瘤體積，Vo:初始瘤體積(給藥前）
[010引 T/C% =給藥組的RTV平均值/對照組的RTV平均值X 100%
[0109] 相對腫瘤抑制率= 100%-相對腫瘤增殖率(T/C%)
[0110] 如果相對腫瘤抑制率<60%，為無效;如果相對腫瘤抑制率>60%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理 P<0.05為有效。
[0111] 3.4根據(jù)腫瘤重量進行療效評價
[0112] 試驗結(jié)束后，實驗結(jié)束時處死動物，剝離瘤體，稱重并拍照。根據(jù)瘤重計算抑制率。 腫瘤生長抑制率=(模型對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型對照組平均瘤重X 100 %，腫瘤生長抑制率<40 %為無效;腫瘤生長抑制率>40 %，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P<0.05為有 效。
[0113] 3.5統(tǒng)計方法
[0114] 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料均采用均數(shù)±標準差(X±s)表示，統(tǒng) 計學(xué)資料采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理。多組間比較方差齊時用單因素方差分析，兩兩 比較，采用t檢驗。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.Ol表示所檢驗的差別有非常顯著性意義。
[0115] 4.結(jié)果
[0116] 4.1皿-4提取物抗荷MGC80-3胃癌移植瘤鼠的活性
[0117] 裸鼠連續(xù)灌胃19天，氣尿喀晚聯(lián)合皿-4組有1只動物出現(xiàn)死亡，其余裸鼠的外觀體 征、行為活動及動物的一般狀況未見明顯異常，經(jīng)大體解剖肉眼觀察未見明顯的異常臟器， 如圖1所示。
[0118] 4.2皿-4提取物對人胃癌荷瘤裸鼠瘤體體積的影響
[0119] 如表4和圖1所示，皿-4提取物低劑量、氣尿喀晚能明顯降低給藥后D4、Dio~化術(shù)瘤 裸鼠瘤體體積，與模型對照組比較有顯著性差異(P<〇. 05或P<0.0 l);皿-4提取物高劑量能 明顯降低給藥后D4、Di3~化9荷瘤裸鼠瘤體體積(P<0.05);氣尿喀晚聯(lián)合皿-4能明顯降低給 藥后Dio~Di6荷瘤裸鼠瘤體體積(P<0.05);皿-4提取物（2000mg/kg)能明顯降低給藥后〇4、 Dio、Di6荷瘤裸鼠瘤體體積(P<0.05)。
[0120] 如表5和圖2所示，圖2為給藥后D10,皿-4對人胃癌移植荷瘤裸鼠瘤體的影響圖。 皿-4提取物低、中、高劑量、氣尿喀晚及氣尿喀晚聯(lián)合皿-4提取物、皿-4提取物(2000mg/kg) 給藥期間相對腫瘤抑制率分別為：〇4相對腫瘤抑制率45.8 %、27.2 %、62.3 %、62.7 %、 43.4%、58.9% ;D7相對腫瘤抑制率31.6%、16.1%、53.0%、38.3%、38.4%、36.0%;〇1〇相 對腫瘤抑制率46.1%、31.9%、50.0%、58.1%、44.7%、50.4%;〇13相對腫瘤抑制率36.9%、 16.2%、39.8%、49.9%、37.2%、31.4% ;Di6相對腫瘤抑制率33.8%、16.0%、39.6%、 61.2%、47.4%、45.1% ;Di9相對腫瘤抑制率40.9%、36.1%、41.2%、44.3%、45.7%、 36.2%。
[0121]
[0122] 表5HTJ-4對胃癌荷瘤裸鼠相對腫瘤抑制率的影響（之±S)
[0123]
[0124] 4.3皿-4提取物對人胃癌荷瘤裸鼠瘤體重量的影響
[0125] 如表6和圖3所示，皿-4提取物低、中、高劑量、氣尿喀晚組、氣尿喀晚聯(lián)合皿-4提取 物組、HB-4提取物（2000mg/kg)腫瘤生長抑制率分別為20.6%、9.7%、6.4%、27.0%、 20.7%、1.3%。
[0126] 如表7和圖4所示，皿-4提取物低、中、高劑量、氣尿喀晚組、氣尿喀晚聯(lián)合皿-4提取 物組、皿-4 提取物(2000mg/kg)最大腫瘤移植率為 46.1%、36.1%、62.3%、32.7%、47.4%、 58.9%。模型對照組、皿-4提取物低、中、高劑量、氣尿喀晚組、氣尿喀晚聯(lián)合皿-4提取物組、 皿-4 提取物(2000mg/kg)最大體重下降率分別為 3.4%、3.4%、5.0%、3.8%、8.9%、5.8%、 3.7%。
[0127] 表細TJ-4對胃癌荷瘤裸鼠瘤重的影響（
[012 引
[01巧]注:與模型對照組比較，作<0.05，^P<0.0 l。
[0130] 表7HTJ-4體內(nèi)抗胃癌MGC80-3移植瘤療效和動物毒性 「01311
[0132] W上結(jié)果表明，皿-4即培養(yǎng)基中半枝蓮滲入比例為40%的生物轉(zhuǎn)化菌絲體對人胃 癌(MGC80-3)荷瘤裸鼠具有明顯的抑瘤作用。皿-4提取物采用簡單的處理工藝制備得到，其 抗腫瘤效果就達到預(yù)料不到的技術(shù)效果，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化的"菌絲體"的抗腫瘤效果好于所有的 天然植物來源的中藥材，如果進一步分離純化富集有效成分，其抗腫瘤效果將更好，可用于 制備抗胃腸道癌藥物。
[0133] 所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：W上任何實施例的討論僅為示例性的，并非 旨在暗示本公開的范圍（包括權(quán)利要求)被限于運些例子;在本發(fā)明的思路下，W上實施例 或者不同實施例中的技術(shù)特征之間也可W進行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面 的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)， 所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種猴頭菌的培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和半枝蓮，每100份的培養(yǎng)基中 包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基70~50份，半枝蓮30~50份;所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量份的各組分： 麥麩490~350份，玉米粉140~100份，谷糠63~45份，白糖7~5份，水400~600份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴頭菌的培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量 份的各組分： 麥麩420份，玉米粉120份，谷糠54份，白糖6份，水500份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴頭菌的培養(yǎng)基，其特征在于，每100份的培養(yǎng)基中包括基礎(chǔ) 培養(yǎng)基60份，半枝蓮40份;所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括如下重量百分數(shù)的各組分:麥麩70 %、玉米 粉20%、谷糠9%、白糖1 %。4. 一種生物轉(zhuǎn)化菌絲體，其特征在于，將猴頭菌類菌株接種至如權(quán)利要求1-3任一項所 述的培養(yǎng)基中，在20~27°C下，培育30~40天，取出菌絲體，烘干，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體，其特征在于，所述猴頭菌類菌株為猴頭菌科 真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull. ex Fr.)Pers〇6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體，其特征在于，所述猴頭菌科真菌猴頭菌 Hericium erinaceum(Bull · ex Fr · )Pers ·的菌絲體與其附生含有半枝蓮成份的固體培養(yǎng) 基的干燥混合物。7. -種生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物，其特征在于，所述提取物通過以下步驟制備得到： (1) 將如權(quán)利要求4-6任一項所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體進行水提，50-70°C下用水浸泡2-3 次，每次浸泡2-5小時，水的重量為生物轉(zhuǎn)化菌絲體重量的6~10倍，得到提取液； (2) 將步驟（1)中的提取液減壓濃縮，將減壓濃縮所得的濃縮液在50-70°C條件下抽真 空干燥，即得生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物，其特征在于，所述用水浸泡的溫度 為60°C ;將減壓濃縮所得的濃縮液在60°C條件下抽真空干燥。9. 權(quán)利要求7或8所述的生物轉(zhuǎn)化菌絲體的提取物在制備抗胃腸道癌藥物中的用途。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述胃腸道癌為食管癌、胃癌、結(jié)腸癌或 肝癌。
【文檔編號】A61K36/07GK106064993SQ201610605434
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】何述金, 周代俊, 周邦維
【申請人】湖南新匯制藥股份有限公司