Cu納米材料的制備方法及癌細(xì)胞檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料制備和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種透明質(zhì)酸修飾的Cu包覆的鍍鎳ZnO納米材料的制備方法和利用該材料檢測(cè)癌細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是威脅人類(lèi)健康和生命的主要疾病之一，而且發(fā)病率也日益上升。目前，大量臨床事實(shí)證明，癌病變初期的治愈率是相當(dāng)高的。因此，早期診斷對(duì)提高癌癥患者的生存率具有重大意義。這迫切需要尋找一種準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)單的早期診斷方法。
[0003]目前，癌癥檢查方式主要有B超、CT、MR1、活檢等等。B超利用切面聲像圖，能從角度、多方位對(duì)病灶進(jìn)行連續(xù)顯示觀察，有助于了解腫瘤的部位，與周?chē)M織器官的關(guān)系，對(duì)癌癥的診斷和治療有重要幫助，但其適用范圍較小。CT，簡(jiǎn)稱(chēng)電子計(jì)算機(jī)橫斷體層攝影，可用于檢查全身病灶，可以明確癌病灶侵犯的范圍，是否侵犯周?chē)钠鞴?，但CT設(shè)備價(jià)格昂貴費(fèi)用較高，過(guò)度CT會(huì)存在誘發(fā)惡性腫瘤、白血病等危險(xiǎn)。MRI，簡(jiǎn)稱(chēng)核磁共振成像術(shù)，其對(duì)腦深部腫瘤、腦干腫瘤、脊髓腫瘤、縱隔內(nèi)腫瘤、心臟腫瘤等可以明確診斷，但是裝有心臟起搏器、體內(nèi)有彈片殘留、手術(shù)留有金屬銀夾等的患者不能使用?；顧z分為切除活檢和穿刺活檢兩種方式，切除活檢是在手術(shù)過(guò)程中進(jìn)行活檢，可以決定腫瘤切除范圍，幫助檢查腫瘤的潛在擴(kuò)散和實(shí)際擴(kuò)散，確定癌癥分期，從而確定后續(xù)治療方案;穿刺活檢需要在CT、B超等的引導(dǎo)下，將穿刺針穿入病變部位，取活組織作病理診斷，穿刺活檢有導(dǎo)致針道種植、癌腫出血的可能，臨床使用時(shí)需謹(jǐn)慎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供Cu納米材料的制備方法，通過(guò)該方法可獲得透明質(zhì)酸修飾的Cu包覆的鍍鎳ZnO納米材料，所述納米材料兼具磁性納米材料和Cu納米材料的優(yōu)勢(shì)，具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、不發(fā)生團(tuán)聚，分散性好，能輕易的與CD44抗體連接起來(lái)的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的:
[0006]本發(fā)明的Cu納米材料的制備方法，包括以下步驟:
[0007]利用直接沉積法制備棒狀ZnO;
[0008]將Ni鍍?cè)赯nO上，得到鍍鎳的ZnO。
[0009]用Cu包覆鍍鎳的ZnO，即得到Cu包覆的鍍鎳ZnO納米材料；
[0010]采用透明質(zhì)酸對(duì)Cu包覆的鍍鎳ZnO納米擦了進(jìn)行修飾，其包括以下步驟:將透明質(zhì)酸與緩沖液置于水浴中攪拌，使透明質(zhì)酸分散于溶液后再加入Cu包覆的鍍鎳ZnO，持續(xù)攪拌，采用超濾管除去多余的透明質(zhì)酸，從而得到透明質(zhì)酸修飾的Cu包覆的鍍鎳ZnO納米材料。
[0011]金屬Ni是一種具有磁性、制備相對(duì)簡(jiǎn)單、而且生物相容性較好的磁性材料。Cu的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，其納米級(jí)具有生物親和性及獨(dú)特的光譜特性，并且Cu的價(jià)格較金銀價(jià)格低廉，以Cu包覆的磁性納米材料形成納米復(fù)合材料有效克服了磁性納米材料穩(wěn)定性差，容易團(tuán)聚，表面功能基團(tuán)少等缺點(diǎn)，改善了磁性材料的物理化學(xué)性能。ZnO與Cu納米結(jié)合可以提高Cu納米的生物相容性、抗干擾性、電子傳輸速度，以及使其表面更容易被修飾。
[0012]透明質(zhì)酸，又名透明酸或玻尿酸，其特異性受體CD44在多種癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，而正常細(xì)胞表面的CD44受體則處于一種非活躍的沉默狀態(tài)，因此可通過(guò)透明質(zhì)酸與其受體CD44的結(jié)合作用實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的靶向成像分析或定量分析。
[0013]進(jìn)一步，所述將Ni鍍?cè)赯nO上，其包括以下步驟:將ZnO在二氯化錫和鹽酸的溶液中敏化，再放入到二氯化鈀和鹽酸溶液中活化，活化后的ZnO用去離子水清洗，然后再將ZnO放入到含有硫酸鎳、次磷酸鈉、氯化銨、檸檬酸鈉、丁二酸和乳酸的化學(xué)鍍池中進(jìn)行化學(xué)鍍，最后將鍍過(guò)鎳的ZnO過(guò)濾并用去離子水洗滌并烘干，即得到鍍鎳的ZnO。
[0014]進(jìn)一步，所述用Cu包覆鍍鎳的ZnO，其包括以下步驟:將制備的鍍鎳ZnO移入去離子水中，加入聚乙二醇，在超聲條件下分散得到鍍鎳ZnO的懸濁液;將氧化亞銅粉末移入去離子水中充分溶解，得到氧化亞銅懸濁液;將氧化亞銅懸濁液與鍍鎳ZnO懸濁液混合，經(jīng)過(guò)靜置、過(guò)濾、水洗、醇洗后烘干，即得到Cu包覆的鍍鎳ZnO納米材料。
[0015]本發(fā)明的目的之二是提供Cu納米材料的癌細(xì)胞檢測(cè)方法，通過(guò)該方法檢測(cè)，只需采集患者的血液，且在極少的樣本中就能夠識(shí)別癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)患病初期能夠準(zhǔn)確、靈敏、無(wú)創(chuàng)傷的診斷癌癥。
[0016]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的:
[0017]本發(fā)明的一種癌細(xì)胞檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0018]a)熒光素標(biāo)記，將所述的Cu納米材料溶解在去離子水中，加入異硫氰酸熒光素進(jìn)行標(biāo)記；
[0019]b)癌細(xì)胞的培養(yǎng)，將傳代后達(dá)到80%?90%匯合的癌細(xì)胞，接種于孔板，孵化24h后，用堿性磷酸鹽溶液洗滌，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的透明質(zhì)酸修飾的Cu納米材料溶液，并采用多聚甲醛溶液固定后，用堿性磷酸鹽溶液洗滌，加入等量的2%亞鐵氰化鉀溶液和2 %氯化氫混合液后靜置，避光孵化18?30min，洗去染色液，核固紅復(fù)染，去除上清液，用堿性磷酸鹽溶液再次洗滌;采用50%、75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水各1次，二甲苯透明2次，每次10?15min;中性樹(shù)膠封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)有陽(yáng)性熒光染色，可根據(jù)染色數(shù)量定量檢測(cè)出癌細(xì)胞的數(shù)量。
[°02°] 進(jìn)一步，所述透明質(zhì)酸修飾的Cu納米材料的粒徑范圍為40-60nm，透明質(zhì)酸在Cu包覆的鍍Ni的ZnO納米材料表面的載量為0.4?0.5mmol/g。
[0021]進(jìn)一步，所述癌細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞或胃癌細(xì)胞中的一種。
[0022]本發(fā)明的有益效果:(l)Cu納米材料兼具磁性納米材料和Cu納米材料的優(yōu)勢(shì)，具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、不發(fā)生團(tuán)聚，分散性好等優(yōu)勢(shì)；(2)用透明質(zhì)酸對(duì)Cu納米材料進(jìn)行表面修飾，不僅可以提高其穩(wěn)定性，而且使其表面功能化，能更輕易的與CD44抗體連接起來(lái)；(3)利用透明質(zhì)酸修飾的Cu納米材料檢測(cè)癌細(xì)胞的方法只需采集患者的血液進(jìn)行體外檢測(cè)，且在極少的樣本中就能夠識(shí)別癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)患病初期能夠準(zhǔn)確、靈敏、無(wú)創(chuàng)傷的診斷癌癥。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下將通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述:
[0024]實(shí)施例lCu納米材料的制備方法
[0025]本發(fā)明