一種結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的成像方法及裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及光學(xué)顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的成像方法及 裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代的生命科學(xué)研究中，顯微鏡是必不可少的研究工具。然而由于光的衍射，傳統(tǒng) 的光學(xué)顯微鏡存在分辨率的極限，這個(gè)分辨率的極限可以由瑞利判據(jù)（Rayleigh criterion)給出：R = 0.6U/NA，其中λ是光的波長，ΝΑ是顯微物鏡的數(shù)值孔徑。近年來，出現(xiàn) 了各種用于提高光學(xué)顯微鏡分辨率的方法，結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(Structured 11 lumination Microscope，SIM)就是其中之一。與其他的方法相比，如：隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，ST0RM)，光激活定位顯微鏡（Photo Activated Localization Microscopy，PALM)，受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED)，SIM的圖像重構(gòu)過程中所需的原始圖像數(shù)量最少，合成每幀 超分辨圖像所需采集數(shù)據(jù)的時(shí)間最短，此外SIM的原始圖像采集是寬場成像，成像速度受視 場大小影響不大。故SIM是各種超分辨成像方法中最適合觀察活細(xì)胞或?qū)捯晥鲋锌焖俪上?的方法。
[0003] 現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示，采用相干或非相干的準(zhǔn)直寬光 束作為光源1，入射光經(jīng)過光線調(diào)制器件2,被調(diào)制后經(jīng)過由透鏡3、二向色分束器8及物鏡9 組成的成像系統(tǒng)，然后調(diào)制出的圖案投影在照明樣品10上，并在照明樣品10所在的平面上 形成周期性的光強(qiáng)分布。在使用相干光源的情況下，也可以選擇性的加入由透鏡4、空間濾 波器5及透鏡6組成的空間濾波系統(tǒng)，以濾除零級衍射分量，濾波后的光繼續(xù)通過由二向色 分束器8及物鏡9組成的成像系統(tǒng)，在照明樣品10所在的平面處干涉生成結(jié)構(gòu)光照明圖案。 被照明的樣品的光通過由物鏡9、鏡筒透鏡11組成的顯微系統(tǒng)后被探測器13采集。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，通過結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡隨時(shí)間推移生成SIM序列（time-lapse SIM)， 其成像過程如下：
[0005] 在一組結(jié)構(gòu)光照明圖案下，每張結(jié)構(gòu)光照明圖案都拍攝一張?jiān)紙D像，對這一組 原始圖像進(jìn)行圖像重構(gòu)得到一張 S頂超分辨圖像。下一張 S頂超分辨圖像使用下一組結(jié)構(gòu)光 照明下的原始圖像重構(gòu)得到。重復(fù)上述過程，獲得多個(gè)S頂超分辨圖像，構(gòu)成S頂超分辨圖像 的時(shí)間序列。
[0006] 最早的SIM中，用于調(diào)制結(jié)構(gòu)光分布的器件為光柵。不同結(jié)構(gòu)光照明圖案的調(diào)制與 切換是通過平移或旋轉(zhuǎn)光柵實(shí)現(xiàn)的。由于系統(tǒng)中存在機(jī)械運(yùn)動(dòng)的部分，其成像速度相對較 慢。之后的S頂普遍采用空間光調(diào)制器(Spatial Light Modulator，SLM)以及數(shù)字微鏡器件 (Digital Micro-mirror Device，DMD)這兩種光電器件調(diào)制結(jié)構(gòu)光照明圖案。由于SLM和 DMD響應(yīng)速度快，再加上高靈敏度的探測器如電子倍增CCD(EMCCD)、科學(xué)級CMOS(sCMOS)能 夠大幅的縮短曝光時(shí)間，這些都為S頂?shù)母咚俪上裉峁┝擞欣麠l件。
[0007] 若要再進(jìn)一步提升SM的成像速度，需要通過增大照明光強(qiáng)縮短曝光時(shí)間，從而提 高成像的時(shí)間分辨率。然而在熒光成像中，照明光強(qiáng)的增強(qiáng)會(huì)加速熒光分子的光漂白效應(yīng)， 縮短總體的觀察時(shí)間，這在活細(xì)胞成像中是很不利的，需要折中考慮。故在現(xiàn)有光電器件響 應(yīng)速度和探測器靈敏度的條件下，SIM的時(shí)間分辨率很難有大幅的提升。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的成像方法及裝置，以解決現(xiàn)有技術(shù)中結(jié)構(gòu)光 照明顯微鏡成像的時(shí)間分辨率難以進(jìn)一步提升的技術(shù)問題。
[0009] 為此目的，第一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的成像方法，包括：
[0010] 按照預(yù)設(shè)順序循環(huán)切換預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案，N為預(yù)設(shè)常數(shù)；
[0011]獲取待成像樣品在每張結(jié)構(gòu)光照明圖案下的原始圖像，得到所述待成像樣品的原 始圖像序列；
[0012] 將所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D像進(jìn)行圖像重 構(gòu)，得到所述待成像樣品的超分辨圖像序列。
[0013] 可選地，所述將所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D像 進(jìn)行圖像重構(gòu)，得到所述待成像樣品的超分辨圖像序列，具體包括：
[0014] 計(jì)算所述原始圖像序列中每N張?jiān)紙D像中混疊的各空間頻譜分量，得到多個(gè)空 間頻譜分量組，所述N張?jiān)紙D像由所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張 原始圖像組成；
[0015] 根據(jù)所述預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案的空間頻率，將每個(gè)空間頻譜分量組中空間 頻率改變的各空間頻譜分量的空間頻率還原，得到空間頻率還原的各空間頻譜分量；
[0016] 將每個(gè)空間頻譜分量組中空間頻率還原的各空間頻譜分量與空間頻率未改變的 各空間頻譜分量進(jìn)行加權(quán)疊加，得到所述待成像樣品的超分辨圖像序列。
[0017] 可選地，所述根據(jù)所述預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案的空間頻率，將每個(gè)空間頻譜分 量組中空間頻率改變的各空間頻譜分量的空間頻率還原，得到空間頻率還原的各空間頻譜 分量，具體包括：
[0018] 根據(jù)所述預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案的空間頻率，確定每個(gè)空間頻譜分量組中空 間頻率改變的各空間頻譜分量的空間頻率改變量；
[0019] 根據(jù)所述空間頻率改變量，確定各空間頻譜分量組中每個(gè)空間頻率改變量在空間 域內(nèi)對應(yīng)的指數(shù)函數(shù)；
[0020] 在空間域內(nèi)，將每個(gè)空間頻譜分量組中空間頻率改變的各空間頻譜分量與自身的 空間頻率改變量對應(yīng)的指數(shù)函數(shù)相乘，得到空間頻率還原的各空間頻譜分量。
[0021] 可選地，所述拍攝待成像樣品在每張結(jié)構(gòu)光照明圖案下的原始圖像，具體包括：
[0022] 間隔預(yù)設(shè)時(shí)間拍攝待成像樣品在每張結(jié)構(gòu)光照明圖案下的原始圖像。
[0023] 可選地，在計(jì)算所述原始圖像序列中N張?jiān)紙D像中混疊的各空間頻譜分量，得到 多個(gè)空間頻譜分量組之后，所述方法還包括：
[0024] 對每個(gè)空間頻譜分量組中的各空間頻譜分量進(jìn)行反卷積，得到反卷積后的各空間 頻譜分量組；
[0025] 相應(yīng)地，所述根據(jù)所述預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案的空間頻率，將每個(gè)空間頻譜分 量組中空間頻率改變的各空間頻譜分量的空間頻率還原，具體包括：
[0026] 根據(jù)所述預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案的空間頻率，將每個(gè)反卷積后的空間頻譜分 量組中空間頻率改變的各空間頻率譜分量的空間頻率還原。
[0027] 可選地，在所述周期性循環(huán)預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案之前，所述方法還包括：
[0028] 采用光線調(diào)制器件調(diào)制所述結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的入射光；
[0029] 對調(diào)制后的入射光進(jìn)行投影，得到所述預(yù)設(shè)的N張結(jié)構(gòu)光照明圖案。
[0030] 可選地，在所述將所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D 像進(jìn)行圖像重構(gòu)之前，所述方法還包括：
[0031] 對所述待成像樣品在每張結(jié)構(gòu)光照明圖案下的原始圖像進(jìn)行降噪處理，得到降噪 后的原始圖像序列；
[0032] 相應(yīng)地，所述將所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D像 進(jìn)行圖像重構(gòu)，具體包括：
[0033] 將所述降噪后的原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D像進(jìn)行 圖像重構(gòu);或
[0034] 在所述得到所述待成像樣品的超分辨圖像序列之后，所述方法還包括：
[0035]對所述超分辨圖像序列中的每張超分辨圖像進(jìn)行降噪，得到降噪后的超分辨圖像 序列。
[0036] 可選地，在所述將所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D 像進(jìn)行圖像重構(gòu)之前，所述方法還包括：
[0037] 對所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像進(jìn)行圖像內(nèi)插處理，得到像素?cái)U(kuò)展的各原 始圖像；
[0038] 相應(yīng)地，所述將所述原始圖像序列中的每張?jiān)紙D像與其之后的N-1張?jiān)紙D像 進(jìn)行圖像重構(gòu)，具體包括：
[0039] 將所述原始圖像序列中的每張像素?cái)U(kuò)展的原始圖像與其之后的N-1張像素?cái)U(kuò)展的 原始圖像進(jìn)行圖像重構(gòu)。
[0040] 可選地，按照預(yù)設(shè)順