一種基于軸向超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于軸向超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡，主要涉及熒光顯微鏡領(lǐng)域。通過(guò)在激發(fā)光路中設(shè)置光束光路快速變焦裝置，用于快速調(diào)制光的焦點(diǎn)位置；和快速光強(qiáng)調(diào)制裝置，用于快速調(diào)制光強(qiáng)；發(fā)明了一種在不改變光片厚度的條件下，可以增加并且調(diào)節(jié)掃描范圍的光片顯微鏡。這項(xiàng)新技術(shù)能夠提供亞微米級(jí)的z軸分辨率，在深層組織中(大于500μm)170×170μm2大小的視野以及高達(dá)1毫秒的時(shí)間分辨率。2P3A-DSLM解決了小型模式生物體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及活體動(dòng)態(tài)過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間成像問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】一種基于軸向超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于軸向超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡，主要涉及熒光 顯微鏡【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】

【背景技術(shù)】 [0002] ：
[0003] 最近出現(xiàn)的光片突光顯微鏡技術(shù)（light-sheet fluorescent microscopy,LSFM) 已經(jīng)給生物三維成像技術(shù)帶來(lái)了革命性變化。LSFM具有高時(shí)間分辨率以及很小的光損傷等 特點(diǎn)，使得通過(guò)熒光成像對(duì)小型模式生物或組織的長(zhǎng)時(shí)間觀察成為可能。
[0004] 光片顯微鏡使用一層光束從樣品側(cè)面激發(fā)熒光樣品，通過(guò)照相設(shè)備檢測(cè)成像，其 入射照明光路和照相設(shè)備接收突光光路互相垂直。傳統(tǒng)光片顯微鏡分類：從激光光源講： 分為連續(xù)光光片顯微鏡和雙光子光片顯微鏡。前者的好處是造價(jià)低，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是：穿 透能力很弱，不適合深層組織成像。后者的好處是成像深度深，可以做活體組織成像。從系 統(tǒng)構(gòu)架來(lái)講：分為水平構(gòu)架，垂直構(gòu)架和倒置構(gòu)架三種。水平構(gòu)架中，光片照明的物鏡和信 號(hào)接收的物鏡都是水平放置，即整個(gè)光路平面與水平面垂直，而樣本固定在一個(gè)瓊脂糖柱 里堅(jiān)直放置。這種構(gòu)架的好處是，系統(tǒng)穩(wěn)定，樣本可以360度自由移動(dòng)。缺點(diǎn)是樣本制備相 對(duì)繁瑣。垂直構(gòu)架中，接收信號(hào)的物鏡垂直放置，與普通的正置顯微鏡相同。而激發(fā)光片的 物鏡水平放置，使得產(chǎn)生的光片與水平面平行。優(yōu)點(diǎn)是可以與現(xiàn)有的傳統(tǒng)正置顯微鏡兼容。 缺點(diǎn)是激發(fā)光物鏡的光片厚度較厚，無(wú)法進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。倒置構(gòu)架中，激發(fā)物鏡和發(fā) 射物鏡成垂直的V字形倒置在樣本之上，形成的光片和成像面都與水平面成45度并互相垂 直。該構(gòu)架的好處是可以與傳統(tǒng)的樣本制備標(biāo)準(zhǔn)兼用。劣勢(shì)是結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，并且樣本不 能隨意轉(zhuǎn)動(dòng)。從光片形成方式來(lái)講，分為柱面鏡式和掃描式。柱面鏡式是通過(guò)一個(gè)柱面鏡 讓一束激光在一個(gè)方向上聚焦，而另一個(gè)方向上保持準(zhǔn)直而形成光片。這種方法的好處是 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，劣勢(shì)是單位面積下的光功率較低，不適合做多光子掃描顯微鏡。掃描式是通過(guò)掃 描器件，將一束準(zhǔn)直的高斯光束在y軸方向上快速掃描，進(jìn)而在照相機(jī)一次曝光時(shí)間內(nèi)形 成均勻的片狀光。優(yōu)點(diǎn)是單位時(shí)間內(nèi)的光功率強(qiáng)，可以做雙光子成像。缺點(diǎn)是結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù) 雜。
[0005] Truong等人通過(guò)將雙光子技術(shù)和光片顯微鏡結(jié)合起來(lái)實(shí)現(xiàn)了雙光子數(shù)字掃描光 片顯微鏡（2P-DSLM)，該系統(tǒng)能夠在高散射的果蠅胚胎或者快速跳動(dòng)的斑馬魚(yú)心臟中進(jìn)行 深層組織成像[1]。與經(jīng)典的光片熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)相似，雙光子數(shù)字掃描光片顯微鏡使用 一個(gè)低數(shù)值孔徑的物鏡（NA < 0. 1)來(lái)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間均勻照明，然而這導(dǎo)致產(chǎn)生的光片過(guò)厚， 從而降低軸向分辨率和圖像的對(duì)比度。另一方面，Betzig和他的同事利用貝塞爾光束來(lái) 產(chǎn)生一個(gè)纖薄的單光子光片，得到了相當(dāng)不錯(cuò)的軸向分辨率[2]。然而，這樣的系統(tǒng)中，視 野和穿透深度是非常有限的。常規(guī)的LSFM顯微鏡或者雙光子數(shù)字掃描光片顯微鏡還有一 個(gè)非常顯著的問(wèn)題，就是在工作的時(shí)候，其光片的厚度主要是由掃描的數(shù)值孔徑NA決定， 當(dāng)增加掃描范圍的時(shí)候，必然會(huì)增加光片厚度。目前有關(guān)于光片顯微鏡的專利文獻(xiàn)比如 CN102455501A，其利用機(jī)械移動(dòng)的透鏡組進(jìn)行光學(xué)變焦，變焦頻率十分低，導(dǎo)致不能實(shí)現(xiàn)快 速拍照，限制了其實(shí)際產(chǎn)業(yè)方面應(yīng)用范圍；并且其只能通過(guò)改變數(shù)值孔徑來(lái)改變照射區(qū)域 的大小。在其增加掃描范圍的時(shí)候，也不能避免光片厚度的增加。
[0006] 引用文獻(xiàn)：
[0007] l.Truong TV, Supatto ff, Koos DS, Choi JM, Fraser SE. Nat Methods2011 ；8 ： 757-760.
[0008] 2.Gao L，Shao L，Higgins CD et al. Cell 2012 ;151 :1370-1385.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，我們發(fā)明了一種在不改變光片厚度的條件下，可以增 加并且調(diào)節(jié)掃描范圍的光片顯微鏡。為了同時(shí)獲得高軸向分辨率和大視野，我們利用激發(fā) 光路快速變焦裝置和快速光強(qiáng)調(diào)制裝置制作了基于軸向超高速掃描的新型三軸數(shù)字掃描 光片顯微鏡（下文稱2P3A-DSLM)。這項(xiàng)新技術(shù)能夠提供亞微米級(jí)的Z軸分辨率，在深層組 織中（大于500 ii m) 170X 170 ii m2大小的視野以及高達(dá)1毫秒的時(shí)間分辨率。2P3A-DSLM 解決了小型模式生物在體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及動(dòng)態(tài)過(guò)程的活體成像問(wèn)題。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，一種基于軸向超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡包括：激發(fā)光 源，其發(fā)射的光束沿著X軸方向照射到樣品上；成像設(shè)備，其沿著Z方向檢測(cè)樣品上發(fā)射和 /或反射的光，Z方向與X方向基本垂直；掃描儀，用于Y方向形成光片和/或Z方向改變光 片的位置，所述Y方向沿著與X和Z方向基本垂直的方向延伸；其特征在于：激發(fā)光路快速 變焦裝置，用于快速調(diào)制光的焦點(diǎn)位置；快速光強(qiáng)調(diào)制裝置，用于快速調(diào)制光強(qiáng)；所述激發(fā) 光路快速變焦裝置和快速光強(qiáng)調(diào)制裝置處于激發(fā)光路中。
[0011] 激發(fā)光路快速變焦裝置和快速光強(qiáng)調(diào)制裝置在激發(fā)光路中的位置及順序并不限 制，只要能夠?qū)崿F(xiàn)其功能即可。
[0012] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案激發(fā)光路快速變焦裝置選自可調(diào)聲學(xué)梯度折射率指數(shù)透鏡 (TAG)、電控可變焦透鏡、微機(jī)械可變反射鏡（MEMSMIRR0R)中的一種。
[0013] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案快速光強(qiáng)調(diào)制裝置包括電光調(diào)制器，優(yōu)選高速普克爾斯盒。
[0014] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案快速變焦裝置的變焦頻率在IOOHz以上，優(yōu)選IkHz以上，更 優(yōu)選500kHz以上。
[0015] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案快速變焦裝置在所述光片熒光顯微鏡的激發(fā)物鏡后焦面的 共軛范圍內(nèi)。
[0016] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述的共軛范圍是共軛距離的80%到120%。
[0017] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述二維掃描鏡包括單個(gè)二維掃描鏡。
[0018] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述二維掃描鏡包括一組的兩個(gè)一維掃描鏡。
[0019] 其中在發(fā)射光路中，優(yōu)選的技術(shù)方案進(jìn)一步包括發(fā)射光路快速變焦器件，使得成 像物鏡的成像面與三維快速變化的光片位置始終匹配。
[0020] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案在于激發(fā)光路中，用作光片垂直方向掃描的掃描反射鏡與發(fā) 射光路中快速變焦透鏡連用；可以實(shí)現(xiàn)不同成像焦面的快速切換。
[0021] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述快速聲光調(diào)制裝置的調(diào)制頻率是變焦裝置頻率的10倍 以上。
[0022] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述光片顯微鏡用于mt-cpYFP轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)連續(xù)的 三維成像。
[0023] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述快速調(diào)焦裝置是TAG，電光調(diào)制器是高速普克爾斯盒。
[0024] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案當(dāng)激發(fā)物鏡的放大倍數(shù)為40倍，數(shù)值孔徑為0. 8的條件下， 通過(guò)調(diào)節(jié)TAG強(qiáng)度，可以控制XY平面掃描區(qū)域在IOxlOiim2到170 X 170 ii m2的范圍內(nèi)。
[0025] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述所述快速光強(qiáng)調(diào)制裝置的頻率是IOkHz以上，優(yōu)選 IOMHz。
[0026] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案所述激發(fā)光源選自雙光子飛秒激光光源或三光子飛秒激光 光源。
[0027] 在所述超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡，其快速變焦裝置使得光片沿著光 軸方向得到擴(kuò)展，在成像設(shè)備一次曝光時(shí)間內(nèi)；使得光片等效被拉長(zhǎng)；并且根據(jù)不同的樣 本大小實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)光片的長(zhǎng)度。快速變焦裝置與快速光強(qiáng)調(diào)制裝置連用，補(bǔ)償了樣品的吸收 和散射造成的照明光沿著軸向的衰減。快速變焦裝置、快速光強(qiáng)調(diào)制裝置與二維掃描鏡連 用，可以實(shí)現(xiàn)在三維任意形狀、任意位置的光片照射，從而實(shí)現(xiàn)隨機(jī)位置光激活或隨機(jī)位置 光漂白恢復(fù)技術(shù)。其中快速聲光調(diào)制裝置和快速變焦裝置的頻率匹配屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技 術(shù)知識(shí)。
[0028] 其中所述在發(fā)射光路中，包括光路快速變焦器件，用于快速調(diào)制光的焦點(diǎn)位置，使 得成像物鏡的成像面與三維快速變化的光片位置始終匹配。
[0029] 由上所述，本發(fā)明具備以下突出的特點(diǎn)：
[0030] 在不移動(dòng)樣品的條件下，可以實(shí)現(xiàn)快速的三維掃描。
[0031] 在1毫秒之內(nèi)，當(dāng)激發(fā)物鏡的放大倍數(shù)為40倍時(shí)，可形成170X17011 m2的光片； 當(dāng)激發(fā)物鏡的放大倍數(shù)為20倍時(shí)，可形成680 X 680 ii m2的光片。
[0032] 在相機(jī)速率足夠的情況下，可以達(dá)到1000張每秒的二維掃描速度，或者達(dá)到100 層每秒的三維掃描速度。
[0033] 在光片厚度小于1微米并且基本保持不變的情況下，可以使光片的掃描區(qū)域根據(jù) 變焦的大小相比于常規(guī)的光片熒光顯微鏡擴(kuò)展1-100倍；
[0034] 在不改變光片厚度的前提下，可以任意改變光片的尺寸，面積，大小。同時(shí)，在掃描 的過(guò)程中，可以對(duì)光強(qiáng)的損耗進(jìn)行動(dòng)態(tài)的補(bǔ)償。
[0035] 通過(guò)掃描鏡，可變焦透鏡和電光調(diào)制器的連用，可以補(bǔ)償光沿著入射方向在樣品 中的衰減，使得整個(gè)成像區(qū)域獲得最好的成像質(zhì)量。
[0036] 雙光子和可變焦透鏡的連用，可以使得光片厚度降到最低。從而提高軸向分辨率。
[0037] 相同條件下，2P3A-DSLM的光漂白速度是常規(guī)的2P-LSM的50%左右。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1，常規(guī)的光片顯微鏡基本結(jié)構(gòu)及原理示意圖。
[0039] 圖2,2P3A_DSLM的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0040] 圖3,2P3A-DSLM的光片大小能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TAG調(diào)制強(qiáng)度來(lái)調(diào)整，尺寸范圍從 10x10 i! m2到170 X 170 i! m2,所用條件為：激發(fā)物鏡放大倍數(shù)為40倍，數(shù)值孔徑為0. 8。
[0041] 圖4,普克爾斯盒對(duì)照明的補(bǔ)償能有效克服整個(gè)視野深度的非均勻照明。在補(bǔ)償之 前，照明強(qiáng)度隨著穿透深度的增加而衰退。在用普克爾斯盒動(dòng)態(tài)調(diào)整照明功率之后，光照強(qiáng) 度在整個(gè)穿透深度范圍內(nèi)都變得非常均勻。最右邊的圖表示的是調(diào)制前和調(diào)制后在圖中直 線上的強(qiáng)度分布曲線。比例尺：l〇〇um。
[0042] 圖5,所示的是不同TAG調(diào)制強(qiáng)度（0%?35%)下的光片側(cè)視圖。比例尺：50 iim。
[0043] 圖6,空間分辨率和極限視野深度的關(guān)系。在不同的TAG調(diào)制強(qiáng)度下用900nm的激 光去激發(fā)嵌在瓊脂凝膠的直徑為50nm的綠色熒光小球。沿著軸向IOOnm步進(jìn)收集每個(gè)小 球的熒光圖像。
[0044] 圖7, 2P3A-DSLM與2P-LSM在實(shí)驗(yàn)和理論上的光漂白程度對(duì)比。
[0045] 圖 8, 2P3A-DSLM，2P-DSLM 以及 Static light-sheet 理論上的光損傷對(duì)比。
[0046] 圖9,光片顯微鏡不同的光片厚度所能達(dá)到的分辨率的分析。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 為了本發(fā)明的技術(shù)方案、目的和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本 發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。本發(fā)明中涉及到的光學(xué)顯微鏡部件，除特殊說(shuō)明的以外，均為常規(guī)的 光學(xué)部件。
[0048] 圖1是現(xiàn)有的常見(jiàn)光片顯微鏡的結(jié)構(gòu)及功能示意圖，其由X方向的片光源照射xy 平面內(nèi)的物體，檢測(cè)方向基本垂直于片光源的照射方向。如圖1所示，其通常包括光源，柱 面鏡或掃描儀，激發(fā)物鏡，檢測(cè)物鏡，相機(jī)等部件，根據(jù)不同的功能可以選擇不同的部件。透 鏡1和透鏡2用來(lái)進(jìn)行擴(kuò)束。透鏡3和透鏡4進(jìn)行第二次擴(kuò)束，并將掃描儀的掃描角度共 軛到激發(fā)物鏡后焦面上去。聚焦的厚度一般和數(shù)值孔徑NA成反比。當(dāng)需要大的掃描范圍 的時(shí)候，需要小的數(shù)值孔徑。但是隨著聚焦厚度的增加，其降低了 XY平面的分辨率。
[0049] 實(shí)施例1 :
[0050] 圖2是2P3A-DSLM的一個(gè)結(jié)構(gòu)示意圖。如圖所示，在傳統(tǒng)光片顯微鏡的基礎(chǔ)上，在 激發(fā)光路設(shè)置快速變焦裝置，用于快速調(diào)制光的焦點(diǎn)位置；設(shè)置快速光強(qiáng)調(diào)制裝置，用于快 速調(diào)制光強(qiáng)；快速變焦裝置是TAG。反射式擴(kuò)束鏡根據(jù)實(shí)際情況，可以先進(jìn)行一次擴(kuò)束，使 光斑符合TAG孔徑要求，并減小色差。透鏡1和透鏡2用來(lái)將TAG透鏡的變焦平面共軛到 顯微鏡物鏡后焦面上去。透鏡3和透鏡4進(jìn)行第二次擴(kuò)束，并將掃描儀的掃描角度共軛到 激發(fā)物鏡后焦面上去。
[0051] 實(shí)施例2 ：
[0052] 快速變焦裝置是電控可變焦透鏡、微機(jī)械可變反射鏡（MEMSMIRR0R)中的一種。
[0053] 實(shí)施例3 ：
[0054] 快速光強(qiáng)調(diào)制裝置是普克爾斯盒（Conoptics，350-160LA)。
[0055] 實(shí)施例4 ：
[0056] 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，，所述快速變焦裝置是TAG，快速光強(qiáng)調(diào)制裝置是 普克爾斯盒，利用一個(gè)檢流計(jì)掃描振鏡（galvo scanning mirror，GSM)，即掃描器，用來(lái)實(shí) 現(xiàn)激光束與照明物鏡軸向（X軸）垂直的方向（y軸）的掃描。使用雙光子作為光源。
[0057] 實(shí)施例5 ：
[0058] 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，使用TAG作為快速調(diào)焦裝置。TAG使用聲波徑 向激發(fā)一個(gè)充滿液體的圓柱形諧振腔并使液體的折射率產(chǎn)生連續(xù)變化，使得軸向焦平面快 速變化，達(dá)到IOy S。這里我們用它來(lái)實(shí)現(xiàn)飛秒激光（140fs，重復(fù)頻率80MHz，Chameleon Version II，Coherent)沿著光軸方向在照明物鏡（40XNA 0.8, Nikon)前端的快速變焦。 一個(gè)檢流計(jì)掃描振鏡（galvo scanning mirror，GSM)，即掃描器，用來(lái)實(shí)現(xiàn)激光束與照明物 鏡軸向（X軸）垂直的方向（y軸）的掃描。
[0059] 實(shí)施例6 ：
[0060] 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，可以通過(guò)分別以450kHz和IkHz的頻率驅(qū)動(dòng)TAG 和GSM。使用雙光子作為光源，我們就能在Ims內(nèi)得到一個(gè)超薄的雙光子光片。如圖3所 示，光片的尺寸可以通過(guò)調(diào)節(jié)TAG(x方向）的調(diào)制強(qiáng)度以及GSM(y方向）的掃描振幅來(lái)調(diào) 整。這兩個(gè)因素都會(huì)增加光片的照度不勻程度。為了補(bǔ)償照度不勻，我們使用了一個(gè)超高 速普克爾斯盒（Conoptics，350-160LA)來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)照射功率，有效地消除軸向的非均勻照 射。
[0061] 實(shí)施例7 ：
[0062] 根據(jù)實(shí)施例5結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，使用雙光子作為光源，40倍放大物鏡，我們研究 了普克爾斯盒對(duì)于整個(gè)視野深度的非均勻照明的補(bǔ)償，如圖4所示，普克爾斯盒對(duì)照明的 補(bǔ)償能有效克服整個(gè)視野深度的非均勻照明。在補(bǔ)償之前，照明強(qiáng)度隨著滲透深度的增加 而衰退。在用普克爾斯盒動(dòng)態(tài)調(diào)整照明功率之后，光照強(qiáng)度在整個(gè)滲透深度范圍內(nèi)都變得 非常均勻。最右邊的圖表示的是調(diào)制前和調(diào)制后在圖中直線上的強(qiáng)度分布曲線。比例尺： 100 U m〇
[0063] 實(shí)施例8 ：
[0064] 根據(jù)實(shí)施例5結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，我們通過(guò)對(duì)異硫氰酸熒光素（FITC)溶液的成像 對(duì)這套系統(tǒng)的性能進(jìn)行了定量分析（圖5)。當(dāng)TAG的調(diào)制強(qiáng)度增加到35%時(shí)，X方向的視 野深度呈直線上升趨勢(shì)，增加到170 um。當(dāng)視野深度在5 iim到170 iim之間時(shí)，光片厚度在 近端和中間都保持在低于I U m。在35 %的TAG調(diào)制強(qiáng)度下，光片厚度在視野深度170 y m 的遠(yuǎn)端增加到I. 5 y m，依然低于普通的光片顯微鏡（2?8 y m)。因?yàn)檎彰魑镧R的校正范圍 是有限的，當(dāng)TAG調(diào)制強(qiáng)度超過(guò)35%時(shí)，光片在z方向上會(huì)突然擴(kuò)展。降低照明物鏡的數(shù)值 孔徑和放大倍率，能夠使視野深度的調(diào)節(jié)范圍更大，但這樣會(huì)增加光片的厚度并且犧牲系 統(tǒng)的空間分辨率。通過(guò)對(duì)FITC溶液的成像，我們定量分析了 2P3A-DSLM在不同視野深度下 所產(chǎn)生的光片厚度。圖5所示的是不同TAG調(diào)制強(qiáng)度（0%?35%)下的光片側(cè)視圖。比 例尺：50 y m。
[0065] 實(shí)施例9 ：
[0066] 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，我們利用測(cè)量嵌在瓊脂糖凝膠中的熒光玻璃小 珠的方法來(lái)評(píng)估在不同TAG調(diào)制強(qiáng)度下的系統(tǒng)軸向（y-z平面）和側(cè)向（x-y平面）分辨率， 如圖6所示。熒光玻璃小珠在不同TAG調(diào)制強(qiáng)度下的側(cè)向半高寬范圍是420nm?450nm，接 近阿貝極限。當(dāng)TAG調(diào)制強(qiáng)度在0%?35%時(shí)，熒光玻璃小珠的的軸向半高寬在激發(fā)場(chǎng)的 近端和中部維持在700nm?800nm。除了 35%的TAG調(diào)控強(qiáng)度之外，軸向分辨率在激發(fā)場(chǎng) 遠(yuǎn)端都保持在I U m以下。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論分析吻合地很好，表明我們的系統(tǒng)比傳統(tǒng)的 光片顯微鏡乃至配有高數(shù)值孔徑的雙光子點(diǎn)掃描顯微鏡都具有更高的分辨率。
[0067] 實(shí)施例10 ：
[0068] 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，，我們通過(guò)活體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)成像測(cè)試了該 系統(tǒng)在生物學(xué)研究方面的性能。線粒體是真核細(xì)胞中關(guān)鍵的細(xì)胞器，其直徑在0. 5?I i! m 之間。在活細(xì)胞中，單個(gè)線粒體產(chǎn)生的超氧化合物瞬時(shí)爆發(fā)現(xiàn)象被稱為"線粒體閃爍"。這 里我們定時(shí)監(jiān)測(cè)3天齡的mt-cpYFP轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)的咽部線粒體動(dòng)態(tài)過(guò)程。在記錄幀 速率為5Hz和像素2048x2048的圖像時(shí)，我們能夠分辨出線粒體閃爍發(fā)生過(guò)程的波峰。另 夕卜，我們成功地對(duì)分離后體外培養(yǎng)的老鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行了二維空間上的鈣火花成像，幀速 率為820Hz，幀尺寸為2048x256像素。
[0069] 實(shí)施例11 ：
[0070] 由于染色體尺寸太小，通常都需要使用一個(gè)高數(shù)值孔徑、高放大倍率的物鏡在 單細(xì)胞或者胚胎發(fā)育的早期觀察細(xì)胞分裂過(guò)程中的染色體分離。根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的 2P3A-DSLM，，我們利用2P3A-DSLM，能夠同時(shí)觀察3天齡的斑馬魚(yú)心臟的數(shù)百個(gè)細(xì)胞核，并 且清晰地看到一些分裂期細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)。這主要得益于這一新型成像技術(shù)產(chǎn)生的纖薄 光片，從而得到低背景噪音和高對(duì)比度的熒光圖像。
[0071] 實(shí)施例12 ：
[0072] 低曝光量是對(duì)生物樣本長(zhǎng)時(shí)間成像的關(guān)鍵。通過(guò)對(duì)mt-cpYFP轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線 蟲(chóng)連續(xù)的三維成像。根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，我們對(duì)比了 2P3A-DSLM和常規(guī)2P-LSM 的光漂白效應(yīng)。經(jīng)過(guò)15分鐘的記錄，我們的系統(tǒng)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的漂白，這與已經(jīng)被漂白超 過(guò)50%的2P-LSM形成鮮明對(duì)比。這主要是因?yàn)樵谕瑯拥狞c(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)軸向?qū)挾群托盘?hào)速率 條件下，2P3A-DSLM需要的照明數(shù)值孔徑更小，能有效減少激發(fā)光的峰值強(qiáng)度以及二階光損 傷
[0073] 實(shí)施例13 ：
[0074] 根據(jù)實(shí)施例5結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，進(jìn)一步包括發(fā)射光路快速變焦器件，使得成像物 鏡的成像面與三維快速變化的光片位置始終匹配
[0075] 實(shí)施例14 ：
[0076] 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)構(gòu)的2P3A-DSLM，，我們計(jì)算了光片顯微鏡不同的光片厚度所能達(dá) 到的分辨率的對(duì)比。如圖7所示，所有光片顯微鏡都要用到兩個(gè)正交的物鏡。因此，探測(cè)系 統(tǒng)中的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)由激發(fā)強(qiáng)度分布g(x，y，z)和探測(cè)物鏡的模糊函數(shù)d(x，y，z)所決定：
[0077] P(x, y, z) = g(x, y, z)d(x, y, z) (3. I)
[0078] x, y, z三個(gè)方向的定義與正文中的相同。我們可以通過(guò)計(jì)算橫向（x, y)和軸向 (z)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的半高寬來(lái)理論地估計(jì)系統(tǒng)的光學(xué)分辨率。
[0079] 橫向的照明是均勻的，因此g(x，y) = 1。因此，X和y方向上的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)被 dlateal(x，y) P隹一決定。艾里公式給出了探測(cè)物鏡焦平面的徑向模糊函數(shù)：

【權(quán)利要求】
1. 一種基于軸向超高速掃描的三軸數(shù)字掃描光片顯微鏡包括： 激發(fā)光源，其發(fā)射的光束沿著X軸方向照射到樣品上； 成像設(shè)備，其沿著Z方向檢測(cè)樣品上發(fā)射和/或反射的光，Z方向與X方向基本垂直； 掃描儀，用于Y方向形成光片和/或Z方向改變光片的位置，所述Y方向沿著與X和Z 方向基本垂直的方向延伸； 其特征在于： 激發(fā)光路快速變焦裝置，用于快速調(diào)制光的焦點(diǎn)位置； 快速光強(qiáng)調(diào)制裝置，用于快速調(diào)制光強(qiáng)； 所述激發(fā)光路快速變焦裝置和快速光強(qiáng)調(diào)制裝置位于激發(fā)光路中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的光片顯微鏡，其特征在于激發(fā)光路快速變焦裝置選自可調(diào)聲 學(xué)梯度折射率指數(shù)透鏡（TAG)、電控可變焦透鏡、微機(jī)械可變反射鏡（MEMSMIRROR)中的一 種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的光片顯微鏡，其特征在于快速光強(qiáng)調(diào)制裝置包括電光調(diào)制 器。優(yōu)選高速普克爾斯盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的光片顯微鏡，其特征在于快速變焦裝置的變焦頻率在 100HZ以上，優(yōu)選1KHZ以上，更優(yōu)選500kHZ以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的光片顯微鏡，其特征在于快速變焦裝置在所述光片熒光顯 微鏡的激發(fā)物鏡后焦面的共軛范圍內(nèi)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的光片顯微鏡，其特征在于共軛范圍是共軛距離的80%到 120%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的光片顯微鏡，其特征在于所述二維掃描鏡包括單個(gè)二維掃 描鏡。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的光片顯微鏡，其特征在于所述二維掃描鏡包括一組的兩個(gè) 一維掃描鏡。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的光片顯微鏡，其特征在于在發(fā)射光路中，進(jìn)一步包括發(fā)射 光路快速變焦器件，使得成像物鏡的成像面與三維快速變化的光片位置始終匹配。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的光片顯微鏡，其特征在于激發(fā)光路中，用作光片垂直方向 掃描的掃描反射鏡與發(fā)射光路中快速變焦透鏡連用；可以實(shí)現(xiàn)不同成像焦面的快速切換。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的光片顯微鏡，其特征在于所述快速聲光調(diào)制裝置的調(diào)制 頻率是變焦裝置頻率的10倍以上。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的光片顯微鏡，其特征在于所述光片顯微鏡用于mt-cpYFP 轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)連續(xù)的三維成像。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的光片顯微鏡，其特征在于所述快速調(diào)焦裝置是TAG，電光調(diào) 制器是高速普克爾斯盒。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的光片顯微鏡，其特征在于當(dāng)激發(fā)物鏡的放大倍數(shù)為40倍， 數(shù)值孔徑為〇. 8的條件下，通過(guò)調(diào)節(jié)TAG強(qiáng)度，可以控制XY平面掃描區(qū)域在10x10 y m2到 170X170iim2的范圍內(nèi)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14所述的光片顯微鏡，其特征在于所述所述快速光強(qiáng)調(diào)制裝置的 頻率是10kHz以上，優(yōu)選10MHz以上。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15所述的光片顯微鏡，其特征在于所述激發(fā)光源優(yōu)選自雙光子飛 秒激光光源或三光子飛秒激光光源。
【文檔編號(hào)】G02B26/10GK104407436SQ201410460425
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】陳良怡, 宗偉健, 孫育杰, 陳宣楊 申請(qǐng)人:北京大學(xué)