專利名稱：一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及受激發(fā)射損耗顯微技術，具體涉及一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光 斑的生成方法及裝置。
背景技術：
近年來，隨著受激發(fā)射損耗顯微技術(Stimulated Emission D印letion (STED) microscopy，簡稱STED)的提出，遠場光學顯微成像的分辨率得到極大的改進，可以在活細 胞上看到納米尺度的蛋白質。它是從物理上打破衍射光學極限的遠場熒光顯微技術。其具 體原理為使用一束激光在樣品表面聚焦產(chǎn)生一個實心小光斑，僅激發(fā)一個點的熒光基團 使其發(fā)熒光，然后再用另一束激光在樣品表面相同位置區(qū)域聚焦產(chǎn)生一個面包圈樣的空心 光斑抑制那個點周圍的熒光強度，這樣就只有中間一個小于衍射極限的點發(fā)光并被觀察到 了。為了使STED顯微鏡的分辨能力可以打破遠場衍射光學極限，在相關技術中最為 關鍵的技術是如何形成面包圈樣的空心聚焦光斑抑制觀察點周圍的熒光激發(fā)，該空心聚焦 光斑稱為抑制光斑。文獻Hell 等 Q010)Far-field optical nanoscopy, Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology 96 :365-398]提至Ij了一禾中基于 0 2π渦旋位相板，使用圓偏光形成面包圈樣的空心聚焦光斑的方法。作為經(jīng)典的空心聚焦光 斑形成方法，它被廣泛應用于目前的種種STED顯微鏡產(chǎn)品中。但是，現(xiàn)有方法的缺點在于 0 圓形渦旋位相板制備非常困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法及裝置，基于0/ π 四象限位相板聚焦，結合使用切向偏振光在顯微物鏡的焦點附近得到一個空心聚焦光斑， 作為抑制光斑，用于脈沖或連續(xù)STED顯微鏡中的三維超分辨成像。一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，包括以下步驟(1)將由激光器出射的入射光線調制為切向偏振光；(2)將所述的切向偏振光垂直通過一個0/π四象限位相板表面進行位相編碼，使 所述的切向偏振光產(chǎn)生相對于初始相位的位相延遲，位相延遲的大小由所述的切向偏振光 的圓形橫截面內過特定點所處的迪卡爾坐標象限所決定當處于一、三象限時，位相延遲為 0，當處于二、四象限時，位相延遲為η，與該點到圓心的距離無關；(3)將經(jīng)過步驟( 位相編碼后的切向偏振光進行遠場超分辨聚焦，聚焦后在焦 平面附近形成一個面包圈樣的空心聚焦光斑，為受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑。所述的 空心聚焦光斑為中心點的光強小于中心點附近最大光強的的二維暗斑。其中，步驟(1)中所述的激光器發(fā)射的入射光線可以為波長在380 780nm范圍 內任意波長的可見光，但優(yōu)選波長由STED顯微鏡觀察熒光樣品的熒光吸收與發(fā)射光譜決 定。
步驟(1)中所述的切向偏振光的波面形狀優(yōu)選為均勻平面波，也可以使用其它波 面形狀如基本高斯波、貝塞爾-高斯波(Bessel-Gaussian Beam)等。步驟(1)中將所述的入射光線調制為所述的切向偏振光采用現(xiàn)有技術來實現(xiàn)，如 米用X· L Wang等(2007) Generation of arbitrary vector beams with a spatial light modulator and a common path interferometric arrangement，Optics Letters 32(24) 3549-3551中所記載的由微結構光柵與干涉儀組成的空間光調制器(SLM=Spatial Light Modulator)即可實現(xiàn)；也可以通過切向偏振轉換器將線偏振激光轉換為切向或者切向激 光來實現(xiàn)。其中，步驟(3)中進行遠場超分辨聚焦可以采取將經(jīng)過位相編碼后的切向偏振光 通過用于透射聚焦的透鏡來實現(xiàn)，也可以采取將經(jīng)過位相編碼后的切向偏振光通過用于反 射聚焦的拋物面反射鏡來實現(xiàn)，優(yōu)選采取將經(jīng)過位相編碼后的切向偏振光通過高數(shù)值孔徑 的消復色差透鏡實現(xiàn)。所述的高數(shù)值孔徑NA = 1 1. 4，優(yōu)選為NA = 1. 4。本發(fā)明的工作原理如下將從激光器發(fā)出的入射光線，通過切向偏振轉換器轉換為切向偏振光后，進一步 將切向偏振光進行位相編碼，打破原有的干涉場，使得光線匯報后產(chǎn)生一個空心聚焦光斑。 雖然直接將切向偏振光(Azimuthally Polarized Beam)通過透鏡進行匯聚時，也會在焦點 位置處產(chǎn)生一個中空的面包圈狀匯聚光斑，但是經(jīng)過位相編碼后，空心聚焦光斑中心點附 近的光能量將更加集中于焦點附近的橫向和縱向方向上。由于抑制光對樣品熒光激發(fā)的抑 制能力與其光強正相關，因此，在總輸入能量一定的前提下，與傳統(tǒng)使用0 2 π渦旋位相 板進行位相編碼的方法相比，通過現(xiàn)有方法得到的空心聚焦光斑在橫向和縱向上的熒光抑 制能力得到加強。而STED顯微鏡通常采用掃描的方式獲取整個觀察區(qū)域的圖像，橫向和縱 向抵制能力的提高意味著在掃描方向上可以得到更小的聚焦光斑，從而獲得更高的分辨能 力。反之，在保證分辨率的情況下，可以降低STED顯微鏡的工作功率。本發(fā)明將光束偏振理 論與高數(shù)值孔徑聚集理論結合起來，可以克服已有技術在STED工作功率過高方面的不足。本發(fā)明還提供了一種用于實現(xiàn)所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方 法的裝置，包括用于產(chǎn)生入射光線的激光器；用于將激光器產(chǎn)生的入射光線調制為切向偏振光的空間光調制器；用于對切向偏振光進行位相編碼的0/ π四象限位相板；用于對經(jīng)過位相編碼后的切向偏振光進行遠場超分辨聚焦的聚焦器件；所述的激光器、空間光調制器、0/ π四象限位相板和聚焦器件位于同軸光路上。其中，所述的激光器為能發(fā)射波長為380 780nm內任意波長的可見光的激光器， 而優(yōu)選的發(fā)射波長由STED顯微鏡觀察樣品的熒光吸收與發(fā)射光譜決定。其中，所述的0/π四象限位相板，對于垂直通過該位相板表面的切向偏振光，當 所述的切向偏振光的圓形橫截面內過特定點所處的迪卡爾坐標處于位相板一、三象限時位 相延遲為0，當所述的切向偏振光的圓形橫截面內過特定點所處的迪卡爾坐標處于二、四象 限時，位相延遲為η。具體位相延遲量Δ α由如下公式?jīng)Q定
權利要求
1.一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，包括以下步驟(1)將由激光器出射的入射光線調制為切向偏振光；(2)將所述的切向偏振光垂直通過一個0/π四象限位相板表面進行位相編碼，使所述 的切向偏振光產(chǎn)生相對于初始相位的位相延遲，位相延遲的大小由所述的切向偏振光的圓 形橫截面內過特定點所處的迪卡爾坐標象限所決定當處于一、三象限時，位相延遲為0， 當處于二、四象限時，位相延遲為η ；(3)將經(jīng)過步驟( 位相編碼后的切向偏振光進行遠場超分辨聚焦，聚焦后在焦平面 附近形成一個面包圈樣的空心聚焦光斑，為受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑。
2.如權利要求1所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的步驟(1)中，入射光線為波長在380 780nm范圍內的可見光。
3.如權利要求1所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的步驟(1)中，切向偏振光的波面形狀為均勻平面波。
4.如權利要求1所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的步驟(3)中進行遠場超分辨聚焦采取將經(jīng)過位相編碼后的切向偏振光通過高數(shù)值孔 徑的消復色差透鏡實現(xiàn)。
5.如權利要求4所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的高數(shù)值孔徑NA= 1 1.4。
6.一種用于實現(xiàn)如權利要求1 5任一所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成 方法的裝置，包括用于產(chǎn)生入射光線的激光器；用于將激光器產(chǎn)生的入射光線調制為切向偏振光的空間光調制器；用于對切向偏振光進行位相編碼的0/ π四象限位相板；用于對經(jīng)過位相編碼后的切向偏振光進行遠場超分辨聚焦的聚焦器件；所述的激光器、空間光調制器、0/π四象限位相板和聚焦器件位于同軸光路上。
7.如權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述的激光器為能發(fā)射波長為380 780nm 內任意波長的可見光的激光器。
8.如權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述的空間光調制器為由微結構光柵與干 涉儀組成的空間光調制器。
9.如權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述的聚焦器件為高數(shù)值孔徑的消復色差 透鏡，所述的高數(shù)值孔徑NA = 1 1. 4。
10.如權利要求9所述的裝置，其特征在于，所述的高數(shù)值孔徑NA=1.4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法及裝置，該方法基于0/π四象限位相板聚焦，結合使用切向偏振光在顯微物鏡的焦點附近得到一個空心聚焦光斑，作為抑制光斑，用于脈沖或連續(xù)STED顯微鏡中的三維超分辨成像。該裝置包括位于同軸光路上的激光器、空間光調制器、0/π四象限位相板和聚焦器件。該裝置結構簡單、成本低、并且在保證分辨率的情況下，可以降低STED顯微鏡的工作功率，避免了過強激光的漂白作用造成的對觀察樣品的損壞。
文檔編號G02B27/48GK102122080SQ201110071090
公開日2011年7月13日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權日2011年3月23日
發(fā)明者劉旭, 匡翠方, 李旸暉, 郝翔 申請人:浙江大學