專(zhuān)利名稱(chēng)：：條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋生物基因技術(shù)的改進(jìn)，尤其是涉及條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其是將許多特定的cDNA基因片段有規(guī)律地排列固定于載體上的技術(shù)，從而獲得所需基因序列及其表達(dá)的大量信息。
背景技術(shù)：
：本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員眾所周知，一個(gè)基因組的所有堿基對(duì)中一般只有很少一部分基因編碼蛋白質(zhì)，絕大部分為非編碼區(qū)，因此，對(duì)基因組直接測(cè)序不是經(jīng)濟(jì)有效的途徑。盡管在高等真核生物中基因組分析的基本策略是對(duì)全基因組和cDNA進(jìn)行測(cè)序，大量的實(shí)驗(yàn)證明以cDNA的形式進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大規(guī)模測(cè)序生成表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)是了解基因組，收集基因組信息以及發(fā)現(xiàn)新基因的有效途徑。采用生物信息學(xué)方法延伸表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)序列，獲得基因部分乃至全長(zhǎng)cDNA序列，將為基因克隆和表達(dá)分析提供空前的動(dòng)力，并為生物信息學(xué)功能的發(fā)展提供廣闊的空間。隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷革新和發(fā)展，生物數(shù)據(jù)日益膨脹。傳統(tǒng)的以雜交或電泳為基礎(chǔ)的基因表達(dá)、測(cè)序、突變檢測(cè)和多態(tài)性分析等研究方法效率太低，無(wú)法適應(yīng)現(xiàn)代研究的要求。近年來(lái)，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)和設(shè)備水平的提高，基因芯片便應(yīng)用而生。基因芯片技術(shù)正逐漸的被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究中。ESTs序列代表了某種特定時(shí)空和生理?xiàng)l件下基因的表達(dá)情況，但基因表達(dá)是動(dòng)態(tài)變化的，在生物體不同時(shí)相、不同發(fā)育時(shí)期或不同生理狀態(tài)下基因表達(dá)的差異對(duì)于生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆、適應(yīng)環(huán)境等具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是完善基因芯片技術(shù)應(yīng)用于海洋生物基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的研究，尤其提供條斑紫菜功能基因序列構(gòu)成的基因芯片。本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案完成的研制了一種條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片。該芯片是在適合的載體面上點(diǎn)制組合有如附表所示的471個(gè)序列點(diǎn)，諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST在國(guó)際基因序列庫(kù)(GeneBank)中的接收號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1——4；列號(hào)1——11；行號(hào)1——11；EST編號(hào)；即，該471個(gè)序列點(diǎn)排布在平行的四個(gè)矩陣單元中，諸矩陣間有四次重復(fù)；該芯片諸矩陣右側(cè)或左側(cè)的兩個(gè)矩陣為起始矩陣；該芯片中的每序列點(diǎn)是以100——3000bp連續(xù)的核苷酸為探針的序列或同源序列或其互補(bǔ)序列。所述的起始矩陣，其第一排2——11個(gè)序列點(diǎn)為質(zhì)控對(duì)照點(diǎn)，前1——10個(gè)是質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，后1——2個(gè)是質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)。所述的質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，其是七個(gè)質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，即3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661。所述的質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)，其是兩個(gè)質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)，即DMSO，POLYA。所述的適合的載體是固相載體，其或?yàn)椴Ｆ?，或?yàn)楣杵?，或?yàn)槟猃埬ぃ驗(yàn)橄跛崂w維膜，或?yàn)槟z。所述的核苷酸，其是脫氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。上述EST編號(hào)(序列標(biāo)簽)所組成的基因芯片就是在載體上結(jié)合有如附表中所示的序列或同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于本發(fā)明的基因cDNA芯片具備高通量的優(yōu)勢(shì)，它正被越來(lái)越多的研究人員應(yīng)用于基因表達(dá)檢測(cè)，通過(guò)定量監(jiān)測(cè)大量基因表達(dá)水平，闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶。采用本發(fā)明的基因芯片技術(shù)從整體水平研究功能基因的表達(dá)譜等技術(shù)是一種高通量的進(jìn)行功能基因表達(dá)分析的研究手段。具體講本發(fā)明的基因芯片具有(1)可同時(shí)檢測(cè)除去9個(gè)對(duì)照點(diǎn)以外的包括條斑紫菜功能基因在內(nèi)的462條基因的表達(dá)情況；(2)可用于克隆植物的重要功能基因，如抗病、抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的克??；(3)該基因芯片還可用于動(dòng)植物的育種和植物新品種的產(chǎn)生；(4)該基因芯片還可用于從整體上研究整個(gè)信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，這對(duì)生物體基因調(diào)節(jié)的整體性研究具有重要的科研和實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值；(5)應(yīng)用該基因芯片還可以運(yùn)用突變體研究植物，為發(fā)現(xiàn)植物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據(jù)；總之本發(fā)明的基因芯片可以作為一種商品，廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。當(dāng)然，目前，條斑紫菜基因組學(xué)研究尚處于起步階段，某些功能基因仍舊處于單基因研究階段等。但是，將cDNA芯片技術(shù)應(yīng)用于條斑紫菜功能基因的研究將打破傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)基因的研究，使得從整體水平高通量的研究條斑紫菜基因表達(dá)分析成為可能，大大縮小了與模式生物研究的差距，為下一步的遺傳育種研究提供條件。附圖及其具體實(shí)施方式本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合如下圖1為條斑紫菜cDNA芯片雜交前的矩陣掃描圖。圖2為條斑紫菜cDNA芯片的起始矩陣放大掃描圖。圖3為條斑紫菜cDNA芯片應(yīng)用于基因表達(dá)檢測(cè)中雜交后的掃描圖。參見(jiàn)圖1，2制成的一種條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片。該芯片是在美國(guó)FullMoon公司出品的cDNA基片的載體面上點(diǎn)制組合有如附表所示的471個(gè)序列點(diǎn)，諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST在國(guó)際基因序列庫(kù)(GeneBank)中的接收號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1——4；列號(hào)1——11；行號(hào)1——11；EST編號(hào)；即，該471個(gè)序列點(diǎn)排布在平行的四個(gè)矩陣單元中，諸矩陣間有四次重復(fù)；該芯片諸矩陣右側(cè)或左側(cè)的兩個(gè)矩陣為起始矩陣；如圖1所示圖中的矩陣排布形式為2×2，以平行的4個(gè)矩陣(A、B、C、D矩陣)為單位，矩陣間4次重復(fù)，圖1中的A、B、C、D矩陣為矩陣間的重復(fù)。前兩個(gè)A、D矩陣，如圖1中的大括號(hào)所示的最右一排9個(gè)點(diǎn)為質(zhì)控對(duì)照點(diǎn)。在A矩陣中從右至左分別有第一、二、三、四單個(gè)矩陣。在B、C、D矩陣中也同樣區(qū)分。每個(gè)矩陣(A、B、C、D)中的單個(gè)矩陣形式11×11。該芯片中的每序列點(diǎn)是以100——3000bp連續(xù)的核苷酸為探針的序列或同源序列或其互補(bǔ)序列。所述的起始矩陣，其第一排2，或9，或11個(gè)序列點(diǎn)為質(zhì)控對(duì)照點(diǎn)，前1，或7，或10個(gè)是質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，后1，或2個(gè)是質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)。如圖2所示所述的質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，其是七個(gè)質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)1，即3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661；或者是一個(gè)質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，即py661(圖中未畫(huà)出)；或者是十個(gè)質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，即3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661，myx0208，3H6，3B9(圖中未畫(huà)出)。如圖2所示所述的質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)2，其是兩個(gè)質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)，即DMSO，POLYA；或者是一個(gè)陰性對(duì)照POLYA(圖中未畫(huà)出)。本發(fā)明的基因芯片所對(duì)應(yīng)的每個(gè)點(diǎn)代表的EST在國(guó)際基因序列庫(kù)(GeneBank)中的接收號(hào)如下附表<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="848">22222222222233333344444513579112468101py363py434py443py464py509py516py528py571py583py587py672py685CX874149CX874212CX874219CX874237CX874277CX874284CX874295CX874333CX874344CX874348CX874418CX87443022222222222233333444444524681013579112py365py440py456py476py514py518py531py579py585py591py680py694CX874151CX874216CX874230CX874248CX874282CX874286CX874298CX874593CX874346CX874351CX874425CX874435</table></tables><tablesid="table5"num="005"><tablewidth="837">矩陣號(hào)列號(hào)行號(hào)EST編號(hào)GeneBank號(hào)矩陣號(hào)列號(hào)行號(hào)EST編號(hào)GeneBank號(hào)222222222222222222222222222555556666677777788888999999357911246810135791124681013沒(méi)57911py705py804pyA6pyC1myx0006myx0022myx0073myx0175myx0212myx03531A41A121B61C121D51D101F41F91G62B32B72C22E82F32F103A43A8CX874446CX874525CX874542CX874552DR907542DR907412DR907440DR907531DR907515DR907424AU186671AU186737AU186827AU186985AU187658AU187935AU188902AU189650AU190696AU193716AU194204AU194423AU197093AV429555AV429828AV431039AV431669222222222222222222222222222555566666677777888888999991046810135791124681013579112468101py713pyA4pyB8pyC2myx0011myx0045myx0081myx0205myx0338myx03731A91B21B91D21D71D121F61F111G92B52B112C42F12F72G23A63B1CX874452CX874540CX874550CX874555DR907405DR907526DR907365DR907519DR907500DR907564AU186716AU186756AU186892AU187528AU187690AU188005AU189323AU190051AU191070AU194164AU194263AU194469AV429442AV429649AV430131AV431386AV431827</table></tables>本發(fā)明的基因芯片在國(guó)際基因序列庫(kù)的接收號(hào)所對(duì)應(yīng)的功能分類(lèi)與注釋表如下本發(fā)明的基因芯片上的462個(gè)克隆序列點(diǎn)的具體實(shí)施方式與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下實(shí)施例1cDNA文庫(kù)的構(gòu)建用Oligo-capping方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)(Maruyama等，1994)。一、總RNA的提取總RNA提取為UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，購(gòu)自上海生物工程有限公司。材料取自本實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)的條斑紫菜絲狀體，采用改進(jìn)的一步法提取總RNA。具體步驟如下●無(wú)菌水清洗并經(jīng)濾紙吸干后稱(chēng)藻體70mg，于液氮中速凍20分鐘；●液氮充分研磨后藻粉轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5mlEP管中，加入450μlTrizol，劇烈渦旋30s，充分混合；●26-G#針頭剪切2次以形成勻漿液；●勻漿液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mlRNase-freeEP管，加入100μl氯仿/異戊醇，劇烈渦旋30s；●12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，將水相與有機(jī)相分開(kāi)，此時(shí)蛋白質(zhì)及部分酚被抽提至有機(jī)相；●將水相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mlRNase-freeEP管，加入1/3體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，此時(shí)可見(jiàn)明顯的多糖及DNA絮狀沉淀；●將溶液轉(zhuǎn)移至UNIQ-10柱中，22℃保溫2分鐘后8000rpm離心1min。此時(shí)RNA結(jié)合到silicagel膜上；●棄濾過(guò)液，將UNIQ-10柱放回收集管中。向UNIQ-10柱加入500μl緩沖液RPE，10000rpm室溫離心30s，以洗滌RNA；●棄濾過(guò)液，將UNIQ-10柱放回收集管中，重復(fù)上述操作一次。此時(shí)多糖及大部分DNA被去除；●向上述UNIQ-10柱中加入RNase-freeDNase，22℃保溫15分鐘；●重復(fù)洗滌一次，棄收集管，將UNIQ-10柱放到一個(gè)新的1.5mlRNase-freeEP管，室溫離心15s，去除殘留的RPE緩沖液；●將UNIQ-10柱放到一新的1.5mlRNase-freeEP管，加入40μlRNase-freeH2O到UNIQ-10柱的中央，12000rpm離心1.5min；●離心液即總RNA水溶液。分裝置于-70℃保存?zhèn)溆?。二、去磷酸?)去磷酸化流程①在1.5ml離心管里按照下表配制10μl去磷酸化反應(yīng)體系。RNA用量為1-5μg；②用槍頭混勻，短暫渦旋30s，3000rpm離心30s；③50℃溫育1h；④溫育后，短暫離心30s，放在冰上。2)去磷酸化步驟中的RNA沉淀(都用1.5mlRnase-freeEP管)；①加90μlDEPC水和100μl酚氯仿，劇烈渦旋30s以沉降RNA；②12000轉(zhuǎn)離心5min，室溫；③將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中(~100μl)；④加2μl10mg/mlmusselglycogen，10μl3Msodiumacetate，pH5.2，混勻后再加220μl95％ethanol，渦旋30s；⑤干冰冷凍10minutes；⑥12000轉(zhuǎn)離心20min，4℃；⑦去除上清；⑧加500μl70％ethanol洗滌；⑨12000轉(zhuǎn)離心2minutesat+4℃；⑩去除上清后再3000轉(zhuǎn)離心30s；去除乙醇，室溫干燥2min；用8μlDEPC水重溶RNA，取1μl；電泳檢測(cè)完整性。三、去帽(RemovingthemRNACapStructure)1)去帽流程①在1.5ml離心管里按照下表配制10μl去帽反應(yīng)體系DephosphorylatedRNA7μl10XTAPBuffer1μlRNaseOutTM(40U/μl)1μlTAP(0.5U/μl)1μlTotalVolume10μl②用槍頭混勻，短暫渦旋30s，3000rpm離心30s；③37℃溫育1h；④溫育后，短暫離心30s，放在冰上。2)去帽步驟中的RNA沉淀(PrecipitatingRNA)①加90μlDEPC水和100μl酚∶氯仿，劇烈渦旋30s以沉降RNA；②12000轉(zhuǎn)離心5min，室溫；③將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中(~100μl)；④加2μl10mg/mlmusselglycogen，10μl3Msodiumacetate，pH5.2，混勻后再加220μl95％ethanol，渦旋30s；⑤干冰冷凍10minutes；⑥12000轉(zhuǎn)離心20min，4℃；⑦去除上清；⑧加500μl70％ethanol洗滌；⑨12000轉(zhuǎn)離心2minutesat4℃；⑩去除上清后再3000轉(zhuǎn)離心30s去除乙醇，室溫干燥2min。四、與Oligo連接1)連接反應(yīng)注意0ligo為干粉形式，用前要離心使干粉集中于管底。開(kāi)蓋時(shí)小心防止粉末濺出減少引物的量。①在盛有GeneRacer.RNAOligo(0.25μg)的離心管中加7μlof脫磷酸化的，去帽的RNA用槍頭吸打幾次重懸RNAOligo.短暫離心使液體沉到管底；②65℃溫育5mi；③冰上冷卻2minutes，短暫離心④然后加入下列試劑，并用槍頭輕輕混勻；10XLigaseBuffer1μl10mMATP1μlRNaseOutTM(40U/μl)1μlT4RNAligase(5U/μl)1μlTotalVolume10μl⑤37℃溫育1h；⑥溫育后，短暫離心30s，放在冰上。2)連接反應(yīng)步驟中的RNA沉淀Note本次RNA沉降后用10μl水溶解①加90μlDEPC水和100μl酚∶氯仿，劇烈渦旋30s以沉降RNA；②12000轉(zhuǎn)室溫離心5min；③將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中(~100μl)；④加2μl10mg/mlmusselglycogen，10μl3Msodiumacetate，pH5.2，混勻后再加220μl95％ethanol，渦旋30s；⑤干冰冷凍10minutes；⑥12000轉(zhuǎn)離心20min，4℃；⑦去除上清；⑧加500μl70％ethanol洗滌；⑨12000轉(zhuǎn)離心2minutesat+4℃；⑩去除上清后再3000轉(zhuǎn)離心30s；去除乙醇，室溫干燥2min；用10μlDEPC水重溶RNA。五、反轉(zhuǎn)錄(SuperScript.IIIRTReaction)①將下列藥品加入到上述10μl已經(jīng)與Oligo進(jìn)行連接的RNA；Primers1μldNTPMix1μlSterile，distilledwater1μl；②65℃溫育5minutes；③冰上冷卻2minutes，短暫離心；④然后加入下列試劑5×FirstStrandBuffer4μl0.1MDTT1μlRNaseOut.(40U/μl)1μlSuperScript.IIIRT(200U/μl)1μlTotalVolume20μl⑤用槍頭輕輕混勻；Note如果使用隨機(jī)引物則要在65℃溫育之前，提前25℃溫育5min，以使隨機(jī)引物能充分與模板結(jié)合；⑥短暫離心；50℃溫育30-60min；⑦70℃溫育15minutes滅活反轉(zhuǎn)錄酶。然后于冰上冷卻2min；12000轉(zhuǎn)離心3分鐘；⑧加入1μlofRNaseH(2U)；⑨37℃溫育20min；⑩3000轉(zhuǎn)離心30s。生成的RNA可以立即使用或者在-20℃保存。用于RT-PCR的RNA量可以達(dá)到2μl。六、PCR合成雙鏈1)按照下列組分配制PCR反應(yīng)液OneShotLAPCRMix25μl模板DNA(2.5ng)2μl引物1(10μM)2μl引物2(10μM)2μl滅菌dddH2O19μlTotal50μl2)PCR反應(yīng)條件95℃2min72℃10min總計(jì)時(shí)間3.5h七、cDNA片段大小分級(jí)以及與載體連接并通過(guò)低熔點(diǎn)凝膠電泳回收的辦法分別收集不同分子大小片段(薩姆布魯克等，1992)。按照500bp-1K，1-2K，2K以上三個(gè)范圍分別進(jìn)行了回收。并對(duì)每個(gè)回收范圍分別與pMD-18T進(jìn)行了連接，條件為16℃，連結(jié)過(guò)夜。以保證所構(gòu)建文庫(kù)的覆蓋率。八、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化操作流程①?gòu)?70℃取出2管感受態(tài)細(xì)胞(100μl/管)。握在手心融化細(xì)胞。細(xì)胞一經(jīng)融化立即把EP管冰浴10min；②取4μl連接反應(yīng)物加至100μl感受態(tài)細(xì)胞中；③輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻，冰浴30min；④42℃熱激90s(恰好90s，不可搖動(dòng)試管)；⑤快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，2-3min；⑥每管加入400μlLB液體培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)，37℃，180rpm振蕩45min-1h；⑦每個(gè)90mm平板(LB+AMP+IPTG+X-Gal)加200μl上述混合物，用無(wú)菌玻棒涂均勻；⑧將平板置于室溫下直至液體被吸收；⑨37℃倒置培養(yǎng)12-16h，選擇陽(yáng)性克隆，進(jìn)行保存和培養(yǎng)。實(shí)施例2數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建用0ilgo-capping方法構(gòu)建的條斑紫菜cDNA文庫(kù)作為測(cè)序EST的文庫(kù)來(lái)源。所用通用引物為M13F(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)，自動(dòng)測(cè)序儀為MegaBaceTM1000。去除序列中的載體序列并修正3`端測(cè)出的模糊堿基后，將片段長(zhǎng)度小于100的序列視為無(wú)效序列，對(duì)其余的序列利用ESTAnalysisPipelineSystemTM協(xié)助進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定功能和降低冗余度。該程序組合了生物信息學(xué)分析的常用工具，包括BLAST，Phred，Pfam，Crossmatch，Phrap，Cap3等。得到469條代表不同基因的EST序列，通過(guò)相似性檢索工具BLAST在NCBI中的非冗余蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)以及SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)非冗余基因進(jìn)行同源性檢索。即將拼接好的疊連群和未能拼接的EST與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，然后通過(guò)BLASTX對(duì)各非冗余基因進(jìn)行蛋白質(zhì)功能域分析或功能注釋。實(shí)施例3芯片的制備一、對(duì)目的克隆進(jìn)行擴(kuò)增及純化處理對(duì)獲得的代表不同基因的表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，采用的引物序列為，正向引物5`CAGGAAACAGCTATGAC3`，反向?yàn)橐?`GTTTTCCCAGTCACGAC3`。每100μl體系包括10×Buffer10μl，25mMMgCl210μl，10mMdNTP2μl，50pmol/μl的正反向引物各0.4μl，質(zhì)粒模板為50ng。PCR擴(kuò)增流程94℃預(yù)變性5min，每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物處理。加入等量的異丙醇室溫放置30min，4℃12000rpm/min離心20min，棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌，干燥后溶解于20μl水中。二、芯片制備將點(diǎn)樣液溶于50％的DMSO中，使每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)終濃度為250ng/μl，用GeneMachine公司的OmniGrid100點(diǎn)樣儀點(diǎn)制芯片。片基是美國(guó)FullMoon公司的cDNA基片，樣品點(diǎn)與片基結(jié)合的方式是多聚賴(lài)氨酸結(jié)合。點(diǎn)樣后經(jīng)過(guò)紫外交聯(lián)處理。單個(gè)矩陣形式11×11，矩陣排布形式2×2，以平行的4個(gè)矩陣為單位，矩陣間4次重復(fù)，以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。實(shí)施例4檢測(cè)不同世代條斑紫菜表達(dá)差異基因一、總RNA抽提(Trizol法)使用Trizol試劑(Gibco公司)分別提取條斑紫菜絲狀體和葉狀體組織總RNA，溶于無(wú)RNA酶的DEPC水中，用瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA較完整，測(cè)定A值后于-70℃保存。二、熒光探針制備反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈時(shí)摻入熒光素Cy32-dUTP或Cy5-dUTP制備熒光標(biāo)記探針。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為總RNA(10g/L)10μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，70℃10min，加5×第一鏈緩沖液5μl，Cy3-dUTP或Cy5-dUTP(25nmol/L，Sigma公司)1μl，Oligo(dT)15(0.5g/L)4μl(大連寶生物公司)，4μl10×低dTTP的dNTPs(dGTP、dATP、dCTP，各25μmol/L，10μmol/LdTTP)，DTT(0.1mol/L)1μl42℃孵育2min，SuperscriptIIreverseRNaseH-reversetranscripase(200U/μl，GIBCO)1.5μl，42℃孵2h。反應(yīng)結(jié)束后加1mol/LNaOH5μl，65℃孵育1h以消化RNA。最后乙醇沉淀熒光標(biāo)記探針，并進(jìn)行紫外分光光度分析以確定合成的cDNA的量及摻入的熒光核苷酸的百分比。三、雜交將熒光標(biāo)記探針溶于8μl1×UniHybTM雜交液(TeleChem公司)，96℃4min變性，與預(yù)處理的cDNA芯片在雜交盒(TeleChem公司)中65℃雜交16h。兩種組織的熒光標(biāo)記探針?lè)謩e與cDNA芯片等量混合后與同一陣列同時(shí)雜交。雜交后用1×SSC/0.2％SDS洗5min，0.1×SSC/0.2％SDS洗5min，0.1×SSC漂洗，空氣中干燥。四、信號(hào)掃描與分析使用ScanArrayTM4000共聚焦熒光掃描儀。Cy3激發(fā)波長(zhǎng)為532nm，Cy5激發(fā)波長(zhǎng)633nm，激光強(qiáng)度設(shè)為95％，光管度值設(shè)為90％信號(hào)分析標(biāo)準(zhǔn)為背景亮度值均設(shè)為0，同一克隆對(duì)照標(biāo)本的亮度分別是待測(cè)標(biāo)本對(duì)應(yīng)點(diǎn)亮度的2倍以上方可確信此克隆代表的基因在這兩種樣本中有明顯的表達(dá)差異。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)圖3所示的基因芯片雜交后的掃描圖)本發(fā)明的基因芯片上462個(gè)克隆中有384個(gè)克隆是在兩個(gè)世代中共同表達(dá)，在76個(gè)差異表達(dá)的克降中，有9個(gè)克隆在葉狀體中表達(dá)量明顯下調(diào)，有23個(gè)克隆在葉狀體中表達(dá)量明顯上調(diào)，推測(cè)是與葉狀體條斑紫菜生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1.一種條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其特征在于該芯片是在適合的載體面上點(diǎn)制組合有如附表所示的471個(gè)序列點(diǎn)，諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST在國(guó)際基因序列庫(kù)(GeneBank)中的接收號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1——4；列號(hào)1——11；行號(hào)1——11；EST編號(hào)；即，該471個(gè)序列點(diǎn)排布在平行的四個(gè)矩陣單元中，諸矩陣間有四次重復(fù)；該芯片諸矩陣右側(cè)或左側(cè)的兩個(gè)矩陣為起始矩陣；該芯片中的每序列點(diǎn)是以100——3000個(gè)連續(xù)的核苷酸為探針的序列和/或同源序列和/或其互補(bǔ)序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的起始矩陣，其第一排2——11個(gè)序列點(diǎn)為質(zhì)控對(duì)照點(diǎn)，前1——10個(gè)是質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，后1——2個(gè)是質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，其是七個(gè)質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照序列點(diǎn)，即3C8，3C9，3E3，3E11，3F3，3H3，py661。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)，其是兩個(gè)質(zhì)控陰性對(duì)照序列點(diǎn)，即DMSO，POLYA。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的適合的載體是固相載體，其或?yàn)椴Ｆ?，或?yàn)楣杵驗(yàn)槟猃埬?，或?yàn)橄跛崂w維膜，或?yàn)槟z。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，其特征在于所述的核苷酸，其是脫氧核糖核酸，和/或核糖核酸，和/或多聚寡核苷酸。全文摘要本發(fā)明是一種條斑紫菜功能基因構(gòu)成的基因芯片，是在適合的載體面上點(diǎn)制組合有如附表所示的471個(gè)序列點(diǎn)，諸序列點(diǎn)所對(duì)應(yīng)代表的EST在國(guó)際基因序列庫(kù)(GeneBank)中的接收號(hào)及其對(duì)應(yīng)的矩陣號(hào)1—4；列號(hào)1—11；行號(hào)1—11；EST編號(hào)；在平行的四個(gè)矩陣單元中，諸矩陣間有四次重復(fù)；該芯片諸矩陣右側(cè)或左側(cè)的兩個(gè)矩陣為起始矩陣；該芯片中的每序列點(diǎn)是以100—3000bp連續(xù)的核苷酸為探針的序列或同源序列或其互補(bǔ)序列。該芯片具備高通量的優(yōu)勢(shì)，它正被應(yīng)用于基因表達(dá)檢測(cè)，通過(guò)定量監(jiān)測(cè)大量基因表達(dá)水平，闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶，從整體水平研究功能基因的表達(dá)譜；總之該芯片廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。文檔編號(hào)C12N15/29GK1757722SQ20051004427公開(kāi)日2006年4月12日申請(qǐng)日期2005年8月14日優(yōu)先權(quán)日2005年8月14日發(fā)明者茅云翔,周曉君,隋正紅,徐民俊申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)