專利名稱：一種由木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種由木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備微生物油 脂的方法。
背景技術(shù)：
生物柴油是近年來(lái)基于環(huán)境惡化和能源危機(jī)發(fā)展起來(lái)的一種可替代化石燃料的可 再生新能源，生物柴油就是一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕鍧嵞茉础Ｄ壳皣?guó)內(nèi)外對(duì) 于生物柴油制備的研究主要集中于植物油或餐飲廢棄油脂方面，但利用植物油為原料 成本高，其成本占到總生產(chǎn)成本的70% 85%，以餐飲廢棄油為原料，也存在原料難以 收集和運(yùn)輸?shù)睦щy，這些都嚴(yán)重地制約了生物柴油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，因此尋找一種廉價(jià) 的原料成為了生物柴油產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。
微生物油脂(microbial oil)又稱單細(xì)胞油脂(single cell oil)，是由酵母、霉 菌、細(xì)菌和藻類(lèi)等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭?作為碳源，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂。生物柴油由各種動(dòng)、植物油脂經(jīng)酯化或轉(zhuǎn)酯化 工藝而得，而大部分微生物油的脂肪酸組成和一般植物油相近，因此微生物油脂可替 代植物油脂生產(chǎn)生物柴油[李小松，余揚(yáng)帆.微生物油脂.食品科 技，1997, (5):8-9. Das UN. Essential fatty acid metabolism in patients with essential hypertension, diabetes mellitus and coronary heart disease. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids, 1995，52(6):387-391.]
木質(zhì)纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)的再生資源。有資料表明，全世界每年的植 物體生成量高達(dá)l. 55X1011噸干物質(zhì)。木質(zhì)生物資源的主要成分是纖維素、半纖維素 和木質(zhì)素。其中，纖維素、半纖維素是可發(fā)酵糖的來(lái)源，含量占66%-79% (纖維質(zhì)原料
的絕對(duì)干重量)。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，若能把大量的農(nóng)業(yè)纖維原料及工業(yè)纖維廢料中 的纖維素經(jīng)濟(jì)地、有效地水解成糖化液，并加以利用，這將有利于改善目前資源日益 緊張，環(huán)境日益惡劣的狀況，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
目前，微生物油脂的研究主要以葡萄糖為原料采用批式發(fā)酵5 — 7天，油脂含量可 達(dá)細(xì)胞干重的20—50%。因此，仍需要開(kāi)發(fā)新的工藝，提高油脂含量、生物量，并采 用廉價(jià)原料為底物，從而降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種一種由木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備微生物油脂的方法，提高 油脂含量、生物量，并采用廉價(jià)原料為底物，從而降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明是由木質(zhì)纖維質(zhì)原料通過(guò)兩步水解法制備水解液，以及水解液經(jīng)兩次補(bǔ)料
發(fā)酵工藝制備微生物油脂的方法。其具體的工藝步驟如下
1、用粉碎機(jī)對(duì)甘蔗渣、玉米芯等木質(zhì)纖維質(zhì)原料進(jìn)行粉碎，然后用l-2。/。的NaOH按 液固比15-25: 1在振蕩器上將原料處理15-20小時(shí)，再用去離子水將原料洗凈后烘干， 將烘干后的原料用1-2%硫酸110-130。C水解，水解體系中液固質(zhì)量比8-10: 1 (均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，水解2-4h后得到水解液。
2、 所得水解液減壓蒸餾去除糠醛，并將水解液濃縮至總糖濃度在30-50g/L，用K0H 調(diào)節(jié)水解液pH為6—7，
3、 離心取上清液，按照C/N=40-50(質(zhì)量比)加入硫酸銨或硝酸鉀以及微量元素溶液， 完全溶解后，12rC滅菌15min。
4、 將粘紅酵母，斯達(dá)凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等可產(chǎn)生微生物油脂的酵母 或霉菌接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24—30h，以5% — 10%的(體積百分?jǐn)?shù))接種量接入發(fā)酵 培養(yǎng)基。搖瓶培養(yǎng)溫度25—35'C,搖床轉(zhuǎn)速150—250r/ndn。發(fā)酵罐培養(yǎng)pH=6. 0—7. 0， 通氣量0. 5 — 1. lvvra，攪拌轉(zhuǎn)速300—600r/min。
5、 發(fā)酵培養(yǎng)至菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期24-48h以及發(fā)酵后期60—96h進(jìn)行補(bǔ)料，向培養(yǎng) 基中補(bǔ)加10g/L—20g/L葡萄糖和木糖的混合溶液(木糖葡萄糖=2 2.5: l)或木質(zhì)纖 維質(zhì)水解液等碳源，并以C/N=40同時(shí)進(jìn)行硫酸氨或硝酸鉀等氮源的補(bǔ)加。
6、 發(fā)酵72 — 144h結(jié)束，4°C， 4000—5000 r/min離心菌體，提取微生物油脂進(jìn)行 測(cè)定。
本發(fā)明的有益效果
采用兩步水解法制備木質(zhì)纖維質(zhì)原料水解液可有效除去乙酸和糠醛對(duì)菌體生長(zhǎng)的 毒害，木質(zhì)纖維質(zhì)原料水解液經(jīng)兩次補(bǔ)料發(fā)酵工藝可制備較高含量及產(chǎn)量的微生物油 脂。發(fā)酵底物和流加底物均可采用木質(zhì)纖維質(zhì)原料水解液，充分利用了木質(zhì)纖維質(zhì)資源， 降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種由木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備微生物油脂的方法，工藝包括由木質(zhì)纖 維質(zhì)原料通過(guò)兩步水解法制備水解液，以及水解液經(jīng)兩次補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備微生物油脂 的方法。
下面再舉具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)例一
1. 蔗渣預(yù)處理
取一定重量20 40目烘干恒重的甘蔗渣于錐形瓶中，先用P/。(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaOH 按液固比25: 1在振蕩器上將甘蔗渣處理20小時(shí)，溫度固定為3(TC，振蕩器轉(zhuǎn)速為 140r/min。預(yù)處理結(jié)束后，用去離子水洗滌并抽濾，將洗滌至中性的甘蔗渣在鼓風(fēng)干燥 箱中105'C烘4h，干燥器中冷卻至室溫，置于樣品袋中保存?zhèn)溆?。將烘干后的甘蔗?進(jìn)行稀酸水解。硫酸濃度=1.24%，時(shí)間-2.64h，溫度=123 °C，液固比固定在10: 1 。 所得水解液減壓蒸餾去除糠醛，并將水解液濃縮至總糖濃度在30g/L左右，用KOH調(diào) 節(jié)水解液pH為6, 3000r/min離心。
2. 發(fā)酵
(1) 菌種黏紅酵母(/^0^^0^/0^""/八32.107)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院微生物研究所。
(2) 培養(yǎng)基(D固體斜面培養(yǎng)基
酵母粉10g/L;蛋白胨20g/L;葡萄糖20g/L;瓊脂20 g/L; pH=5。
0種子培養(yǎng)基
葡萄糖15g/L; (NH4)2S04: 2g/L;酵母粉1 g/L; KH2P04: 7g/L; Na2HP04: 2g/L; MgS04: 1.5 g/L; pH=5.5。
③發(fā)酵培養(yǎng)基步驟l中離心所得上清液中加入KN03: 3.8 g/L;酵母粉4 g/L;
KH2P04: 6 g/L; Na2HP04: 2 g/L; MgS04: 2 g/L; pH=6， 115。C滅菌20min。
(3) 發(fā)酵方式將固體斜面培養(yǎng)的菌種接至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后按5%的 接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。500ml搖瓶裝量100ffll，培養(yǎng)溫度 30°C，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。發(fā)酵24h和60h分別補(bǔ)料兩次，加入10g/l木糖和葡萄糖 混合溶液(2.5: 1)，同時(shí)以C/N^40補(bǔ)加硝酸鉀。
(4) 發(fā)酵結(jié)果，
72h發(fā)酵完后，其生物量達(dá)到15.1g/L，油脂含量達(dá)到32.5%。 實(shí)施例二 l.庶渣預(yù)處理
取一定重量20 40目烘干恒重的甘蔗渣于錐形瓶中，先用1。/。(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaOH 按液固比25: 1在振蕩器上將甘蔗渣處理20小時(shí)，溫度固定為3(TC，振蕩器轉(zhuǎn)速為 140r/min。預(yù)處理結(jié)束后，用去離子水洗滌并抽濾，將洗滌至中性的甘蔗渣在鼓風(fēng)干燥 箱中105t)烘4h，干燥器中冷卻至室溫，置于樣品袋中保存?zhèn)溆谩⒑娓珊蟮母收嵩?進(jìn)行稀酸水解。硫酸濃度=1.24%，時(shí)間=2.6411，溫度=123 。C，液固比固定在10: 1 。 所得水解液減壓蒸餾去除糠醛，并將水解液濃縮至總糖濃度在50g/L左右，用KOH調(diào) 節(jié)水解液pH為6， 3000r/min離心。 3.發(fā)酵
(5) 菌種黏紅酵母(及/wdotorw/"g^/"/As2.107)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院微生物研 究所。
(6) 培養(yǎng)基
①固體斜面培養(yǎng)基
酵母粉10g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L;瓊脂20 g/L; pH=5。
種子培養(yǎng)基
葡萄糖15g/L; (NH4)2S04: 2 g/L;酵母粉lg/L; KH2P04: 7 g/L; Na2HP04: 2 g/L; MgS04: 1.5 g/L; pH=5.5。
③發(fā)酵培養(yǎng)基步驟l中離心所得上清液中加入KN03: 3.8 g/L;酵母粉4 g/L;
KH2P04: 6 g/L; Na2HP04: 2 g/L; MgS04: 2 g/L; pH=6， 115。C滅菌20min。
(7) 發(fā)酵方式將固體斜面培養(yǎng)的菌種接至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后按5%的 接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基,對(duì)菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。1L發(fā)酵罐裝量750ml，培養(yǎng)溫度30'C， 搖床轉(zhuǎn)速550r/min。通氣量1. Ovvra。發(fā)酵36h和96h分別補(bǔ)料兩次，加入總糖濃度為 15g/l蔗渣水解液，同時(shí)以C/N-40補(bǔ)加硝酸鉀。(8) 發(fā)酵結(jié)果，
132h發(fā)酵完后，其生物量達(dá)到17.5g/L，油脂含量達(dá)到52.1%。 實(shí)施例三
1. 玉米芯預(yù)處理
取一定重量20 40目烘干恒重的玉米芯原料于錐形瓶中，先用1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的NaOH按液固比25: 1在振蕩器上將甘蔗渣處理20小時(shí)，溫度固定為3(TC，振蕩 器轉(zhuǎn)速為140r/min。預(yù)處理結(jié)束后，用去離子水洗滌并抽濾，將洗滌至中性的玉米芯 原料在鼓風(fēng)干燥箱中105'C烘4h，干燥器中冷卻至室溫，置于樣品袋中保存?zhèn)溆?。?烘干后的甘蔗渣進(jìn)行稀酸水解。硫酸濃度=1.15%，時(shí)間-lh，溫度=115 °C，液固比固 定在10: 1 。所得水解液減壓蒸餾去除糠醛，并將水解液濃縮至總糖濃度在50g/L左 右，用KOH調(diào)節(jié)水解液pH為6， 3000r/min離心。
2. 發(fā)酵
(1) 菌種黏紅酵母(及/wcfoton/tog^/"/As2.107)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院微生物研 究所。
(2) 培養(yǎng)基
①固體斜面培養(yǎng)基
同實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基
同實(shí)施例1
③發(fā)酵培養(yǎng)基步驟l中離心所得上清液中加入KN03: 3.8g/L;酵母粉4 g/L;
KH2P04: 6g/L; Na2HP04: 2 g/L; MgS04: 2 g/L; pH=6， 115。C滅菌20min。
3. 發(fā)酵方式將固體斜面培養(yǎng)的菌種接至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后按5%的接種 量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。1L發(fā)酵罐裝量750ml,培養(yǎng)溫度30'C， 搖床轉(zhuǎn)速550r/min。通氣量1. Ovvm。發(fā)酵36h和96h分別補(bǔ)料兩次，加入總糖濃 度為15g/l玉米芯水解液，同時(shí)以C/N-40補(bǔ)加硝酸鉀。
4. 發(fā)酵結(jié)果，
132h發(fā)酵完后，其生物量達(dá)到14.5g/L，油脂含量達(dá)到42.5%。
權(quán)利要求
1、一種由木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備微生物油脂的方法，其特征在于，工藝包括由木質(zhì)纖維質(zhì)原料通過(guò)兩步水解法制備水解液，以及水解液經(jīng)兩次補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備微生物油脂。
2、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述由木質(zhì)纖維質(zhì)原料通過(guò) 兩步水解法制備水解液的工藝步驟包括(1) 水解前用粉碎機(jī)對(duì)甘蔗渣、玉米芯等木質(zhì)纖維質(zhì)原料進(jìn)行粉碎，然后用1-2%的NaOH按液固比15-25: 1在振蕩器上將木質(zhì)纖維質(zhì)原料處理15-20小時(shí)， 再用去離子水將原料洗凈后烘干，將烘干后的原料用1-2%硫酸110-13(TC水解， 水解體系中液固質(zhì)量比8-10: 1，水解2-4h后得到水解液。(2) 所得水解液減壓蒸餾去除糠醛，并將水解液濃縮至總糖濃度在30 — 50g/L，用K0H調(diào)節(jié)水解液pH為6_7。
3. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述木質(zhì)纖維質(zhì)原料水解液經(jīng) 兩次補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備微生物油脂的工藝步驟為(1) 離心取上清液，按照C/N=40-50質(zhì)量比加入硫酸銨或硝酸鉀以及微量 元素溶液，完全溶解后，12rC滅菌15min(2) 將粘紅酵母，斯達(dá)凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉可產(chǎn)生微生物油脂 的酵母或霉菌接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24—30h，以5% — 10%的體積百分?jǐn)?shù)接種量 接入發(fā)酵培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)溫度25 — 35'C，搖床轉(zhuǎn)速150—250r/min;發(fā)酵罐培 養(yǎng)pH=6. 0—7. 0，通氣量0. 5 — 1. l兩，攪拌轉(zhuǎn)速300—600r/min;(3) 發(fā)酵培養(yǎng)至菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期24—48h以及發(fā)酵后期60—96h進(jìn)行補(bǔ) 料，向培養(yǎng)基中補(bǔ)加10g/L—20g/L葡萄糖和木糖的混合溶液或木質(zhì)纖維質(zhì)原料 水解液碳源，并以C/N=40—50質(zhì)量比同時(shí)進(jìn)行硫酸氨或硝酸鉀氮源的補(bǔ)加；(4) 發(fā)酵72 — 144h結(jié)束，4。C， 4000—5000r/min離心菌體，提取微生物油 脂進(jìn)行測(cè)定。
4. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述用于生產(chǎn)微生物油脂的 菌株包括斯達(dá)凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉可產(chǎn)生微生物油脂的酵母或霉菌。
5. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的木質(zhì)纖維質(zhì)原料包括 甘蔗渣、玉米芯、高梁桿或秸稈。
6. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的木糖葡萄糖=2 — 2. 5:
全文摘要
一種由木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備微生物油脂的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。工藝包括由木質(zhì)纖維質(zhì)原料通過(guò)兩步水解法制備水解液，以及水解液經(jīng)兩次補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備微生物油脂的方法。采用該工藝，可利用木質(zhì)纖維質(zhì)原料制備較高含量及產(chǎn)量的微生物油脂。發(fā)酵底物和流加底物均可采用木質(zhì)纖維質(zhì)原料水解液，充分利用了木質(zhì)纖維質(zhì)資源，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C11B1/04GK101294171SQ20081011461
公開(kāi)日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2008年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日
發(fā)明者劉宏娟, 周玉杰, 張建安, 建 李, 武敏敏, 程可可 申請(qǐng)人:清華大學(xué)