一種黃連素葡聚糖微膠囊及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種黃連素葡聚糖微膠囊，其特征在于，包括黃連素和葡聚糖，所述葡聚糖形成微膠囊，黃連素被包封在葡聚糖微膠囊內部，所述微膠囊為1～6μm×1～6μm的球體或橢球體。黃連素葡聚糖微膠囊將黃連素包封于葡聚糖內，不僅提高了黃連素的穩(wěn)定性，增強了黃連素的吸收，而且提高了黃連素的腫瘤靶向能力，為臨床提供了胰腺癌靶向治療的藥物備選。
【專利說明】
一種黃連素葡聚糖微膠囊及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。更具體地，涉及一種黃連素新劑型。
【背景技術】
[0002]世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《全球癌癥報告2014》顯示，中國的癌癥新增病例和死亡人數的絕對數值依然位居世界首位。其中包括胰腺癌等惡性消化道腫瘤的威脅最為顯著。胰腺癌，多發(fā)生于胰頭部，惡性程度高，是惡性腫瘤中最常見的，平均生存期不足6個月，五年生存率不足5%，難以治愈，死亡率極高，近年來已逐漸成為被醫(yī)學界稱為“癌中之王”。一般而言，化療是殺傷腫瘤最為常見的有效方式之一，但是在臨床上，胰腺癌對放化療均不敏感而極大地限制了臨床療效的發(fā)揮。其中原因在于胰腺組織，作為腹膜后位器官，“潛藏”在胃的后面，腹部的深處，被大量膠原蛋白及脂肪組織包裹，傳統化療藥物很難滲透進入腫瘤組織及其微環(huán)境，并深達腫瘤內部組織，相反，藥物在其它非腫瘤器官中會大量分布，增加正常組織的毒副作用。所以即便是增加藥物濃度，也會相應增加藥物對其它組織臟器的損害，而腫瘤部位的藥物濃度依舊沒有明顯的提高。因此增加化療藥物的濃度，反而加劇了病人的痛苦和機體的不適。對于胰腺癌而言，給予傳統的化學治療對于胰腺癌的控制與治療并無顯著的提高。
[0003]過去常用的藥物5-氟尿嘧啶(541]，？111(^011作(^1)，但其反應率很少超過25%。吉西他濱在1998年被美國食品藥物管理局(FDA)第一個批準用于胰腺癌治療的一線藥物。因為臨床胰腺癌的治療并沒有真正有效的藥物可用，目前轉移性胰腺癌的一線治療標準是使用單一藥物吉西他濱，建議劑量是1000mg/m2。但吉西他濱并無特別突出的反應率，也不能根治胰腺癌，其主要作用只是在于改善生活品質，顯示出它低毒的特點和減輕疼痛，稍稍延長患者存活期。2005年11月美國食品藥物管理局推薦使用靶向藥物埃羅替尼(特羅凱)與吉西他濱聯用治療晚期胰腺癌，雖然在存活期及反應率方面具有統計學差異，但是治療上并不能發(fā)現其帶來的明顯好處。近年，從一些重要臨床試驗中發(fā)現吉西他濱與其他藥物聯合治療的方案，并沒有體現協同作用等臨床意義，包括在2007年ASCO會議上報道的聯合貝伐單抗及西妥昔單抗，都無法看到其聯合治療的優(yōu)勢。此外，2007年ASCO會議上也報道了兩項重要臨床研究，試圖找出除了吉西他濱以外聯合其他一線化療藥，如伊立替康、多西他賽和奧沙利鉑等，均沒有很好的臨床提高與突破。至于臨床胰腺癌二線化療藥物，更缺乏有意義的結果及對胰腺癌患者終末期生活質量的改善。
[0004]綜上所述，胰腺癌化療效果差的根本原因在于，化療藥物通過全身給藥，進入胰腺癌組織的藥物成分太少，而其他非相關組織的藥物含量相對較高，毒副作用較大。如何能夠提高藥物在提高胰腺癌腫瘤組織分布量的同時，減少全身組織臟器的藥物分布和降低毒副作用提高臨床療效的關鍵瓶頸。因此，選擇合適的藥物載體，實現各類藥物靶向胰腺癌的輸送與釋放，進而實現對胰腺癌微環(huán)境的協同抑制和逆轉化療耐藥是臨床亟需解決的問題。
[0005]黃連素又叫鹽酸黃連素，其分子式為C20H18C1N04(H20)，價格低廉，來源于黃連、黃柏、三顆針等植物，具有顯著的抑菌作用。在臨床上一直作為非處方藥用于治療腹瀉與腸炎，同時現代藥理學進一步研究證實黃連素具有顯著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低膽固醇、抗制血管平滑肌增殖、改善胰島素抵抗、抗血小板、抗炎，降糖，降脂等作用，因而在心血管系統、內分泌系統和神經系統疾病方面將可能有廣泛、重要的應用前景，日益受到重視。用中醫(yī)方面，黃連性味歸經:苦，寒。歸心、胃、肝、大腸經。具有厚腸胃、清熱燥濕，瀉火解毒之功效，用于胃腸濕熱，嘔吐，瀉痢，高熱神昏，心煩不寐，血熱吐衄，瘡瘍腫毒，膿耳，濕瘡，胃火牙痛，心律失常。黃連素是一種已經商業(yè)化的口服藥物，被臨床應用于腸炎等疾病的治療。不僅如此，在體外實驗證實了黃連素對各種腫瘤細胞，如前列腺癌、胰腺癌細胞等具有較強的抑制作用，但是其在腫瘤治療方面的臨床應用與轉化一直沒有獲得開發(fā)，其主要原因在于:黃連素溶解性隨溫度及溶劑極性變化很大，不容易獲得穩(wěn)定藥物體系;黃連素及其衍生物口服利用效率極低，這一點大大限制了其在腫瘤防治中的臨床應用。因此，需要提供一種新的黃連素的劑型，該黃連素的劑型能夠改善了黃連素藥物的穩(wěn)定性、吸收效率和腫瘤靶向能力。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個技術問題在于提供一種黃連素葡聚糖微膠囊，該黃連素的劑型能夠改善了黃連素藥物的穩(wěn)定性，吸收效率和腫瘤靶向能力。
[0007]本發(fā)明解決的第二個技術問題在于提供一種黃連素葡聚糖微膠囊的制備方法。
[0008]本發(fā)明解決的第三個技術問題在于提供一種黃連素葡聚糖微膠囊的應用。
[0009 ]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下述技術方案:
[0010]一種黃連素葡聚糖微膠囊，包括黃連素和葡聚糖，所述葡聚糖形成微膠囊，黃連素被包封在葡聚糖微膠囊內部，所述微膠囊為直徑為I?6μπι的球體或長徑X短徑為I?6μπιΧI?6μηι的橢球體。
[0011]在一個實施方案中，所述微膠囊為直徑為2?4μπι的球體或長徑X短徑為2?4μπιX2?44!11捕球體。
[0012]所述黃連素葡聚糖微膠囊的制備方法，包括如下步驟:配制黃連素在10?100°C的飽和溶液，優(yōu)化溫度為40?700C ;向所述黃連素的飽和溶液中加入葡聚糖微膠囊;孵育，即獲得黃連素葡聚糖微膠囊溶液。
[0013]在溶脹葡聚糖微膠囊的過程中，由于黃連素在葡聚糖膠囊內外的濃度差，致使黃連素分子向葡聚糖微膠囊內部擴散直至達到平衡。所述黃連素和葡聚糖膠囊的質量比為
0.001?50:1，優(yōu)選為0.5?5:1。調整黃連素與微膠囊的比例，可獲得黃連素包封量不同的黃連素葡聚糖微膠囊。
[0014]所述黃連素葡聚糖微膠囊的制備方法進一步包括向黃連素葡聚糖微膠囊溶液中加入乙醇，其中乙醇與溶液體積比不高于20%。
[0015]所述黃連素葡聚糖微膠囊的制備方法進一步包括干燥所述黃連素葡聚糖微膠囊溶液，獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。
[0016]所述干燥的方法為凍干或旋轉蒸干。在凍干或旋轉蒸干的過程中，外圍液體成分消失或減少，藥物被動裝入葡聚糖微膠囊內，進一步增加黃連素藥物進入葡聚糖微膠囊的包封量，當液體成分完全消失后即可獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉末制劑。
[0017]使用上述制備方法可得到黃連素葡聚糖微膠囊的溶液(即液態(tài)制劑)或黃連素葡聚糖微膠囊的干粉制劑，其中所述黃連素葡聚糖微膠囊的干粉制劑在儲存過程中具有更好的穩(wěn)定性。
[0018]黃連素的溶解度隨著溫度的改變而不同，在O?100°C的溫度范圍內，黃連素的溶解度會隨著溫度的升高而提高。配制黃連素飽和溶液，溫度較高時黃連素的溶解度會更高。在O?100°C的溫度范圍內都可以實現連素葡聚糖微膠囊的制備，但是當黃連素溶液濃度高時，黃連素在葡聚糖微膠囊內的包封率會顯著提高，因而在較高溫度下配制黃連素溶液，黃連素飽和溶液中黃連素的濃度較高，能夠獲得良好的包封率。因而本申請采用在40?70 0C下配制黃連素的飽和溶液，黃連素在葡聚糖微膠囊內的包封率大于92%。
[0019]將葡聚糖微膠囊在黃連素飽和溶液中孵育的時間為I小時以上，以實現充分孵育，在孵育過程中，葡聚糖微膠囊發(fā)生溶脹，使得溶液中的黃連素分子充分擴散進入葡聚糖微膠囊內部。
[0020]在一個實施方案中，將葡聚糖微膠囊在黃連素飽和溶液中孵育的時間為0.01?100小時，優(yōu)化為0.5?10小時;在另一個實施方案中，將葡聚糖微膠囊在黃連素飽和溶液中孵育的時間為3?10小時。
[0021]為提高葡聚糖微膠囊中黃連素的負載量，所述制備方法可以進一步包括提高葡聚糖微膠囊外黃連素的濃度。當葡聚糖微膠囊內外黃連素的濃度達到平衡時，葡聚糖微膠囊外的黃連素不再向葡聚糖微膠囊內擴散，當葡聚糖微膠囊外的黃連素濃度提高，平衡被打破時，葡聚糖微膠囊外的黃連素再次向葡聚糖微膠囊內擴散，進而提高葡聚糖微膠囊內的黃連素濃度。
[0022]所述提高葡聚糖微膠囊外黃連素的濃度包括向黃連素葡聚糖微膠囊溶液中再次加入黃連干粉或高濃度黃連素溶液，或者溶解黃連素葡聚糖微膠囊的干粉制劑，并再次凍干或旋轉蒸干黃連素葡聚糖微膠囊溶液，其中溶解黃連素葡聚糖微膠囊的干粉制劑所用溶液的體積小于制備黃連素葡聚糖微膠囊溶液的體積。
[0023]葡聚糖在酵母、靈芝、香菇或谷物等多種作物生物體中廣泛存在，其是一種具有生物活性的碳水化合物，具有通過刺激巨噬細胞活動，激發(fā)機體非特異性防御機制，進而增強機體免疫功能的功效，在腫瘤、感染、創(chuàng)傷、美容等領域中具有潛在的應用價值，因而并被美國FDA認證為綠色安全有效的保健美容產品和免疫增強劑。
[0024]本申請所述的葡聚糖微膠囊來源于真菌的細胞壁。因為用于包封黃連素分子，所以需要保證葡聚糖微膠囊結構的完整性，而不是市面上經破碎后的葡聚糖粉末添加劑。然而所述葡聚糖微膠囊也可以來源于其他國外商業(yè)化制備的具有相同或類似結構的葡聚糖。
[0025]所述黃連素葡聚糖微膠囊作為胰腺癌靶向治療藥物的應用。
[0026]體外實驗結果表明，所述黃連素葡聚糖微膠囊在細胞水平上可以殺死胰腺癌細胞。體內實驗結果表明，所述黃連素葡聚糖微膠囊在動物水平上可以靶向傳輸至胰腺癌腫瘤，進而達到抑制胰腺癌的功效。
[0027]祖國醫(yī)學認為胰腺癌的病機系脾胃虛弱、肝氣郁結致氣滯、血瘀、濕熱為患，久而結成腫塊，即胰腺癌多為濕熱為主。而根據中藥理論，黃連性味歸經:苦，寒。歸心、胃、肝、大腸經。具有厚腸胃、清熱燥濕，瀉火解毒之功效，用于胃腸濕熱，嘔吐，瀉痢，高熱神昏，心煩不寐，血熱吐衄，瘡瘍腫毒，膿耳，濕瘡，胃火牙痛，心律失常，因而黃連素的清熱燥濕符合中醫(yī)胰腺癌的病機辯證治療。
[0028]本申請將黃連素包封于葡聚糖微膠囊內，提高了黃連素的分散穩(wěn)定性和腫瘤靶向及抗腫瘤能力。所述黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑具有安全穩(wěn)定性、可儲存性、便于運輸性。所述的粉狀制劑溶解后可水化后，用于體內抗腫瘤時，由于其具有腫瘤體內靶向能力，而能明顯降低毒副作用，提高其抗癌效果。細胞毒實驗結果顯示，所述黃連素葡聚糖微膠囊對胰腺癌細胞系SW1990在48小時內的IC5q為42.5μΜ，而單純用溫水溶解黃連素溶液(游離黃連素溶液)對細胞的IC5Q為138.3μΜ，黃連素葡聚糖微膠囊對胰腺癌細胞系的
[0029]顯著優(yōu)于黃連素溶液;同樣在另一株胰腺癌細胞系MIAPaca-2中黃連素葡聚糖在48小時內的IC5Q為34.6μΜ，而游離黃連素溶液對該細胞的IC5Q為144.7μΜ。在體內抗腫瘤(皮下與原位)的研究發(fā)現，黃連素葡聚糖微膠囊在腫瘤部位的富集性增強，從而降低了游離黃連素的副作用(游離組黃連素體重減輕了 15%)，降低了腫瘤的遠端轉移，增強了黃連素的抗腫瘤效果，這種免疫劑型的改良具有十分重要的臨床意義。
[0030]本發(fā)明的有益效果如下:
[0031]本申請的黃連素葡聚糖微膠囊藥物制備過程不涉及非Π)Α批準材料的使用，避免了相關材料的安全風險。黃連素包封率可以達80%以上。同時將黃連素包封于葡聚糖內，不僅提高了黃連素的穩(wěn)定性，增強了黃連素的吸收，而且提高了黃連素的腫瘤靶向能力，最終為臨床提供了胰腺癌靶向治療的藥物備選。
[0032]本發(fā)明的黃連素葡聚糖微膠囊對胰腺癌切實有效，且制備工藝簡單易行，重復性好，在胰腺癌領域具有新的臨床治療價值和應用前景。
【附圖說明】
[0033]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0034]圖1示出黃連素葡聚糖微膠囊共聚焦顯微鏡照片。
[0035]圖2示出黃連素葡聚糖微膠囊的表面電荷及包載前后的最大發(fā)射波長的比較。
[0036]圖3示出黃連素葡聚糖微膠囊對胰腺癌細胞SW1990的MTT結果。
[0037]圖4示出黃連素葡聚糖微膠囊對胰腺癌細胞MIAPaCa-2的MTT結果。
[0038]圖5示出黃連素葡聚糖微膠囊進入胰腺癌細胞SW1990的流式結果比較。
[0039]圖6示出黃連素葡聚糖微膠囊進入胰腺癌細胞MIAPaCa-2的流式結果比較。
[0040]圖7示出黃連素葡聚糖微膠囊體外抑制胰腺癌細胞SW1990的克隆形成與轉移。
[0041]圖8示出黃連素葡聚糖微膠囊體外抑制胰腺癌細胞MIAPaCa-2的克隆形成與轉移。
[0042]圖9示出黃連素葡聚糖微膠囊體內抑制SW1990胰腺癌細胞皮下荷瘤的動物實驗。
[0043]圖10示出黃連素葡聚糖微膠囊體內抑制MIAPaCa-2原位胰腺癌動物實驗和遠端轉移，裸鼠體內的灰白熒光為腫瘤的增殖與轉移的實時活體分析。
[0044]圖11示出黃連素葡聚糖微膠囊體內抑制MIAPaCa-2原位胰腺癌的增殖。
[0045]圖12示出黃連素葡聚糖微膠囊體內抑制MIAPaCa_2遠端臟器的轉移白色箭頭為腫瘤的轉移灶。
【具體實施方式】
[0046]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。
[0047]實施例1:黃連素葡聚糖微膠囊的制備
[0048]60 °C下，制備黃連素的飽和溶液。取該溶液Iml，向其中加入葡聚糖微膠囊20mg，充分孵育8小時，溶脹葡聚糖微膠囊。在此過程中，黃連素分子向葡聚糖微膠囊內部擴散并達到平衡。
[0049]平衡后，向此體系中邊攪拌邊滴加2ml乙醇(速度小于0.4ml/分鐘)，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌10分鐘后凍干或旋轉蒸干溶劑，即獲得包封率在92%以上的黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。
[0050]實施例2:黃連素葡聚糖微膠囊的制備
[0051 ] 60 °C下，制備黃連素的飽和溶液。取該溶液1ml，向其中加入葡聚糖微膠囊200mg，充分孵育8小時，溶脹葡聚糖微膠囊。在此過程中，黃連素分子向葡聚糖微膠囊內部擴散并達到平衡。凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，用I?3ml水溶解所述黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，或再次進行凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。即可獲得包封率92 %以上黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。
[0052]實施例3:黃連素葡聚糖微膠囊的制備
[0053]50°C下，制備黃連素的飽和溶液。取該溶液1ml，向其中加入葡聚糖微膠囊200mg，充分孵育8小時，溶脹葡聚糖微膠囊。在此過程中，黃連素分子向葡聚糖微膠囊內部擴散并達到平衡。凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，用I?3ml水溶解所述黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，或再次進行凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，即可獲得包封率92 %以上黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。
[0054]實施例4:黃連素葡聚糖微膠囊的制備
[0055]70 °C下，制備黃連素的飽和溶液。取該溶液1ml，向其中加入葡聚糖微膠囊200mg，充分孵育8小時，溶脹葡聚糖微膠囊。在此過程中，黃連素分子向葡聚糖微膠囊內部擴散并達到平衡。凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，用I?3ml水溶解所述黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，或再次進行凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，即可獲得包封率92 %以上黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。
[0056]實施例5:黃連素葡聚糖微膠囊的制備
[0057]55 °C下，制備黃連素的飽和溶液。取該溶液200ml，向其中加入葡聚糖微膠囊5g，充分孵育10小時，溶脹葡聚糖微膠囊。在此過程中，黃連素分子向葡聚糖微膠囊內部擴散并達到平衡。將此體系直接凍干，凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，用5-10ml水溶解所述黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，或再次進行凍干或旋轉蒸干溶劑后獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑，即可獲得包封率92 %以上黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。
[0058]在另一實施例中，向孵育體系中邊攪拌邊滴加200ml乙醇(速度小于0.4ml/分鐘)，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌10分鐘后凍干或旋轉蒸干溶劑。也可獲得包封率在92%以上的黃連素葡聚糖微膠囊。
[0059]實施例6:黃連素葡聚糖微膠囊的參數檢測
[0060]包封于葡聚糖微膠囊內的黃連素為包封的黃連素(BBR-GPs);游離于溶液中為游離的黃連素(BBR-free)。
[0061]將實施例5的黃連素葡聚糖微膠囊用PBS快速洗滌2次后，洗去表面粘附的黃連素成分，用100微升PBS溶液分散，在激光共聚焦平臺檢測黃連素分子藥物在葡聚糖內的分布狀況。采用德國萊卡激光共聚焦，激發(fā)光488nm，發(fā)射光為550nm，可以激發(fā)黃連素產生綠色熒光，證實黃連素葡聚糖微膠囊內包封有黃連素小分子藥物。通過微粒表面電荷的差異比較進一步分析，黃連素小分子在包載前后的兩種溶液介質下顆粒表面的電荷變化，發(fā)現包載前黃連素小分子水溶液呈現表面正電荷+10.1mV(BBR-free為正電荷粒子)，與空載葡聚糖(GPs)表面電荷為電中性，電荷為-0.37mV，，當黃連素被葡聚糖包載后，BBR-GPs呈現趨向電中性的狀態(tài)，電荷為-0.523mV，與GPs表面電荷接近，這說明黃連素小分子從溶液中擴散至葡聚糖微膠囊內，即被包封于葡聚糖，結果見2A。通過最大發(fā)射波長的比較，無論是游離抑或包封于葡聚糖內的黃連素，其最大發(fā)射波長始終保持一致，包封前后黃連素的最大發(fā)射波長為553nm，結果見圖2B。葡聚糖包封不影響黃連素小分子熒光的紅移或者藍移，為后期的黃連素小分子藥物的熒光檢測與分布提供理論依據。
[0062]實施例7:黃連素葡聚糖微膠囊處理胰腺癌細胞
[0063]選用胰腺癌細胞系SW1990和MIA PaCa-2，在96孔板中，每孔鋪3000個SW1990或MIAPaCa-2的胰腺癌細胞，待第二天細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，以有效黃連素濃度為ΟμΜ、ΙΟμΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ和500μΜ的黃連素葡聚糖微膠囊(被包封的黃連素的濃度)處理胰腺癌細胞48小時，以MTT方法檢測細胞活力，評價不同處理組對上述兩株胰腺癌細胞活力的影響(結果見圖3和4)。所述有效黃連素濃度是指溶液中包封于葡聚糖微膠囊內的黃連素濃度或者游離黃連素水溶液濃度。
[0064]通過不同濃度的黃連素處理SW1990細胞，48小時后，我們可以看見BBR-GPs組的1〇50為42.54]?，顯著低于游離881?(881?-灶66)組138.34]\1。]\04 PaCa_2中黃連素葡聚糖在48小時內的IC5q為34.6μΜ，明顯低于游離黃連素溶液對該細胞的IC5q為144.7μΜ。試驗結果表明黃連素葡聚糖微膠囊能夠有效降低黃連素用量，并提高胰腺癌細胞的殺傷力。
[0065]實施例8黃連素葡聚糖微膠囊處理胰腺癌細胞的熒光流式分布
[0066]配制黃連素游離溶液和黃連素葡聚糖微膠囊溶液。
[0067]將50μΜ同等黃連素小分子的藥物濃度(其中黃連素游離溶液中黃連素的濃度與黃連素葡聚糖微膠囊溶液中包封于葡聚糖微膠囊內的黃連素的濃度相同)加入分別到上述2株胰腺癌細胞(SW1990和MIA PaCa-2)，以BD公司的C6流式檢測儀分析藥物的熒光強度，檢測BBR自身熒光(488nm激發(fā)，550nm發(fā)射，FL-1通道)，發(fā)現BBR-GPs組進入2株胰腺癌細胞的黃連素熒光更多，這提示胰腺癌細胞能更加有效地攝入BBR-GPs，圖5左圖為處理48小時后，BBR-free、BBR-GPs和生理鹽水組中SW1990細胞的熒光吞噬強度。結果表明BBR-GPs更容易進入細胞。中圖和右圖，比較了在Oh、0.5h、3h和6h時，BBR進入細胞的速度，結果表明BBR-free進入細胞的速度慢于BBR-GPs，尤其是BBR-free在6小時才明顯進入細胞，BBR-GPs在
0.5小時就顯著進入細胞。
[0068]圖6左圖為處理48小時后，BBR-free、BBR_GPs和生理鹽水組中，MIA PaCa_2細胞的熒光吞噬強度。結果表明BBR-GPs更容易進入細胞。中圖和右圖，比較了在0h、0.5h、3h和6h時，BBR-free進入細胞的速度慢于BBR-GPs，尤其BBR-free在0.5小時進入細胞的BBR的熒光量為14?15，而BBR-GPs在0.5小時進入細胞的BBR熒光藥將近15?106。結果顯示:BBR-GPs組顯著多于BBR-free組。通過流式細胞計數檢測發(fā)現在短時間內，BBR-GPs較BBR-free進入胰腺癌細胞的分布方式更快更多。
[0069]實施例9:黃連素葡聚糖微膠囊體外抑制胰腺癌細胞的平板克隆與侵襲實驗
[0070]在同等50μΜ的BBR的藥物濃度下，擬平板克隆形成實驗，在每個直徑為60mm培養(yǎng)皿的中鋪4000個細胞，每3天換液(含不同處理組的藥液)，觀察到第21天，棄去培養(yǎng)基，以結晶紫方法對細胞克隆進行染色，并對平皿內的細胞克隆數進行計數。圖7A結果顯示，SW1990細胞平板克隆實驗中，游離黃連素(BBR-free，50μΜ)組和黃連素葡聚糖組(BBR-GPs，50μΜ)具有良好的腫瘤克隆抑制能力，在10x鏡頭下觀察5個視野，結果顯示，未處理組的平板克隆形成數為432 土 53，GPs組平板克隆形成數為378 土 62，BBR-free組平板克隆形成數為108 土35，BBR-GPs 組平板克隆形成數為 67 土 11 (*P〈0.05，#P〈0.01)。圖 8A 結果顯示，MIA PaCa-2細胞平板克隆形成實驗中，黃連素(BBR-free，50μΜ)組和黃連素葡聚糖組(BBR-GPs，50yM)具有良好的腫瘤克隆抑制能力，在10x鏡頭下觀察5個視野，結果顯示，未處理組的平板克隆形成數為 316±47，6?8組為273±32，881?-打66組為188±20，881?-6?8組為97±13(*?〈0.05，**Ρ〈0.01)ο
[0071]同時，購買美國BDmatrigel小室，以15萬細胞/孔鋪細胞，并進行含有黃連素藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。棄去上下室的培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛的PBS溶液進行固定，再用PBS清洗3次，然后以結晶紫染料對上下小室進行染色20分鐘，用棉簽擦拭掉上室的細胞，將下室貼面的細胞快速用PBS清洗，在倒置顯微鏡下，以不同的5個視野，對轉移細胞進行拍照、計數和統計，結果見圖9和10。結果顯示BBR-GPs組的細胞克隆形成數最少，侵襲轉移的細胞最少，表明BBR-GPs更能有效抑制胰腺癌細胞的克隆增殖和侵襲轉移。
[0072]圖7B的結果顯示，在matrigel的transwell小室中培養(yǎng)SWl990細胞，結果表明，SW1990細胞的侵襲轉移能力明顯降低。在10x鏡頭下觀察5個視野，轉移細胞平均計數為:未處理組為246 ±31，GPs組為217 ±12，BBR-free組為94 ±18，BBR-GPs組為30 ±6(*P〈0.05，**Ρ〈0.01)ο
[0073]圖8Β的結果顯示，在matrigel的transwell小室中培養(yǎng)MIA Paca-2細胞，結果表明MIA Paca-2細胞的侵襲轉移能力明顯降低。在10x鏡頭下觀察5個視野，轉移細胞平均計數為:未處理組為 272 土 36，GPs 組為 247 ± 31，BBR-free 組為 91 土 19，BBR-GPs 組為 65 土 16(*P〈0.05，**Ρ〈0.01)ο
[0074]實施例10:黃連素葡聚糖微膠囊體內抑制胰腺癌細胞生長的動物實驗
[0075]從維通利華公司購買4-周齡雌性Balb-c裸鼠(每組3只)，將事先培養(yǎng)好的MIAPaCa-2細胞(呈現對數增長期)用胰酶消化，PBS清洗2遍后，用Iml注射針在裸鼠臀側(雙側)分別注射16細胞。待腫瘤長到體積為2mm X 2mm X 2mm后，開始干預給藥，(陰性對照生理鹽水，20mg/kg游離黃連素水溶液和黃連素葡聚糖微膠囊)，每3天給藥，保證一周2次注射，裸鼠稱重和腫瘤體積測量均在每次給藥前完成，處理到第24天(結果見9A)，皮下荷瘤SW1990細胞后每3天記錄腫瘤長徑與短徑(體積=長徑2 X短徑/2)，觀察腫瘤體積變化，結果表明BBR-GPs組的腫瘤體積長勢最慢，說明BBR-GPs的抑瘤效果較好
[0076]24天后，用⑶2窒息法處死動物(按照小動物倫理規(guī)范進行安樂死)，剝離皮下腫瘤組織，，觀察不同組的皮下腫瘤外觀，結果顯示BBR-GPs組的腫瘤最小(結果見9B)。對上述腫瘤進行稱重(結果見9C)，發(fā)現BBR-GPs組的腫瘤重量最小，為200 土 23毫克，而游離BBR(BBR-free)組為382土47毫克，對照組為963土 136毫克(*P〈0.05，#P〈0.01)。對于各組的荷瘤鼠體重進行稱量，結果表明，在經過24天的施用，BBR-free處理組引起裸鼠體重的減輕，(*P〈
0.05)。
[0077]實施例11:黃連素葡聚糖微膠囊體內抑制MIAPaCa-2原位胰腺癌的動物實驗
[0078]從安泰康生物科技購買MIAPaCa-2-RFP紅色熒光的細胞系，先購買2只4-周齡雌性Balb-c裸鼠，進行如實施例11的皮下荷瘤處理，當皮下腫瘤體積大約在500mm3時，處死動物，以無菌方法剝離腫瘤，并切成平均Imm3的腫瘤塊，與此同時重新購買4-周齡雌性Balb-c裸鼠，給予腹腔注射麻醉后，施行胰腺組織的腫瘤塊埋種，結果以活體熒光成像儀觀察小鼠原位胰腺部位的熒光變化，熒光信號的變大變強，說明腫瘤的增殖旺盛甚至發(fā)生轉移等。在不同時間段，在第I天、5天、7天、9天、10天、12天、15天和21天，對裸鼠進行稱重和熒光的拍照記錄，結果見圖10，結果表明對照組(單純5%葡糖糖溶液+等量空葡聚糖微膠囊組)隨著時間延續(xù)，發(fā)生熒光腫瘤(灰白色熒光)大量的增多增強，而BBR-free組，腫瘤增加和轉移的速度慢于對照組，同時BBR-GPs發(fā)生更明顯的腫瘤熒光的減弱和轉移緩慢。第22天處死小鼠，剝離腫瘤和重要臟器，以活體熒光成像儀分析腫瘤的轉移狀況和腫瘤的質量分析，結果見圖11。對各組小鼠的體型外觀，腫瘤和重要臟器進行明場和熒光場觀察，其中IlA結果顯示，對照組(單純5%葡糖糖溶液+等量空葡聚糖微膠囊組)具有明顯的脾臟，肝臟和腎上腺等轉移，而BBR-free組發(fā)生少量的脾臟和肝臟被膜轉移，BBR-GPs組未見明顯的轉移灶和微小灶。IlB結果顯示在裸鼠體重的測量中發(fā)現，BBR-free組可以引起藥物性的體重減輕，較BBR處理前，體重減輕了8 % ± 3.5 %，而BBR-GPs組對小鼠體重減輕有保護意義，小鼠體重較處理前增加了 12% ± 3.8% (*P〈0.05)。IIC結果顯示原發(fā)灶腫瘤重量比較發(fā)現，BBR-GPs組顯著低于BBR-free組和對照組，具有顯著的統計學差異(**P〈0.01)。結果發(fā)現BBR-GPs組能有效降低原位胰腺癌的遠端轉移(如肝臟，脾臟，腎上腺等)。
[0079]實施例12:對各組轉移灶熒光腫瘤的HE染色驗證
[0080]通過HE染色觀察各組重要器官的熒光轉移腫瘤的驗證，結果如圖12表明:對照組發(fā)現除了原位胰腺組織有腫瘤外，腫瘤的轉移灶在肝臟，脾臟和腎上腺均有轉移，在BBR-free 組發(fā)生脾臟和肝臟的微小轉移灶 ，而在 BBR-GPs 組未見明顯微小腫瘤轉移。說明， BBR-GPs可以有效降低原位胰腺癌的遠端轉移(白色箭頭指示)。
[0081]以上詳細描述了本發(fā)明的實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，以及這些改良劑型在慢性腸液和結直腸患者載藥方面具有極其安全高效的應用市場，這些均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0082]另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0083]此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內容。
[0084]
【申請人】聲明，本發(fā)明通過上述實施例說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于與上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加，制備工藝和對胰腺癌，慢性腸炎，結直腸癌等疑難雜癥的新用途的改進、開發(fā)和具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內。
【主權項】
1.一種黃連素葡聚糖微膠囊，其特征在于，包括黃連素和葡聚糖，所述葡聚糖形成微膠囊，黃連素被包封在葡聚糖微膠囊內部，直徑為I?6μπι的球體或長徑X短徑為I?6μπιΧ I?6μηι的橢球體。2.如權利要求1所述黃連素葡聚糖微膠囊，其特征在于，所述微膠囊為直徑為2?4μπι的球體或長徑X短徑為2?4μηι X 2?441]1橢球體。3.如權利要求1所述黃連素葡聚糖微膠囊的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:在10?100°C下配制黃連素的飽和溶液；向所述黃連素的飽和溶液中加入葡聚糖微膠囊;孵育，即獲得黃連素葡聚糖微膠囊溶液。4.如權利要求2的制備方法，其特征在于，在40?700C下，配制黃連素的飽和溶液。5.如權利要求2的制備方法，其特征在于，所述黃連素和葡聚糖膠囊的質量比為0.001?50:1;優(yōu)選地，所述黃連素和葡聚糖膠囊的質量比為0.5?5:1。6.如權利要求2的制備方法，其特征在于，進一步包括向黃連素葡聚糖微膠囊溶液中加入乙醇，其中乙醇與溶液體積比不高于20%。7.如權利要求2的制備方法，其特征在于，進一步包括干燥所述黃連素葡聚糖微膠囊溶液，獲得黃連素葡聚糖微膠囊粉狀制劑。8.如權利要求7的制備方法，其特征在于，所述干燥的方法為凍干或旋轉蒸干。9.如權利要求2的制備方法，其特征在于，所述的葡聚糖微膠囊來源于真菌的細胞壁。10.如權利要求1所述黃連素葡聚糖微膠囊作為胰腺癌治療藥物的應用。
【文檔編號】A61K47/36GK105919971SQ201610463953
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】潘元明
【申請人】潘元明