柳葉繡線菊根抗類風濕有效部位及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位及其制備方 法，還涉及柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位在制備治療類風濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免 疫性疾病。其主要的病理變化為關(guān)節(jié)滑膜細胞浸潤，滑膜翳形成，軟骨與骨組織的侵蝕。類 風濕性關(guān)節(jié)炎治療的目的是阻止病程發(fā)展，即阻止關(guān)節(jié)炎癥和破壞進程，預防功能喪失。雖 然治療措施很多，但藥物治療仍是基礎(chǔ)。目前治療藥物包括非留體抗炎、留體抗炎藥和疾病 調(diào)修抗風濕病藥。隨著對炎癥過程、分子遺傳學和生物技術(shù)發(fā)展，對病原學機制的認識不斷 深入，研究者努力尋找具有特異性的治療藥物。主要以炎性細胞因子為靶點、以炎癥介質(zhì)為 靶點、以免疫活性細胞表面抗原為靶點、以信號轉(zhuǎn)導通路為靶點。細胞因子是一組由機體免 疫細胞和非免疫細胞合成、分泌產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，具有多種生物學功能。與類風濕性關(guān)節(jié) 炎密切相關(guān)的細胞因子大部分由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和T細胞分泌，其中腫瘤 壞死因子-α、白介素_1β、白介素_6為致病因子，白介素-10、白介素-4為保護因子。
[0003] 郝小江研究組對薔薇科繡線菊屬植物粉花繡線菊化學成分和生物活性進行了系 統(tǒng)的研究。粉花繡線菊Spiraea japonica L. f.變異性強，在我國有7個變種，構(gòu)成一個復 合群，包括橢圓葉變種S. japonica var. ovalifolia Franch·、急尖變種S. japonica var.acuta Yu、漸尖變種S. japonica var. acuminate Franch·、光葉變種S· japonica var. f ortunei (Planchon) Rehd·、無毛變種 S. japonica var. Glabra (Regel) Koidz·、星花變種 S. japonica var.stellaris Rehd.和裂葉變種 S. japonicavar. incisa Yu)。作為民間草藥，粉花繡線菊主要用于感冒驅(qū)風，止血活血，鎮(zhèn)痛止咳，明目利 尿，月經(jīng)不調(diào)，消腫解毒和去腐生肌等。該植物的化學成分研究始于1964年，前蘇聯(lián)學者 Frolova等報道了該植物中的二萜生物堿成分，自此以后的30多年間，前蘇聯(lián)、日本及我國 學者相繼報道了數(shù)十個二萜生物堿及二萜成分。郝小江研究組自1987年起對國產(chǎn)該復合群 植物各變種的化學成分進行了系統(tǒng)的化學研究，先后分離鑒定了 53個新的二萜及二萜生物 堿，并發(fā)現(xiàn)這類生物堿具有抗炎、抗血小板聚集和神經(jīng)保護活性。薔薇科繡線菊屬植物柳葉 繡線菊資源豐富，經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻檢索，但罕見其化學成分和藥理作用的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本案發(fā)明人在對長白山繡線菊屬植物資源抗類風濕性關(guān)節(jié)炎活性篩選研究中發(fā) 現(xiàn)柳葉繡線菊根提取物潛在抗類風濕性關(guān)節(jié)炎作用的基礎(chǔ)上，采用活性指標指導下的導向 分離模式確定有效部位和無效部位，研究了有效部位的主要化學成分和含量，因而完成了 本發(fā)明。
[0005] 本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種有效物質(zhì)明確、活性與機制清晰的 柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位，本發(fā)明另一目的是提供柳葉繡線菊根抗類風濕 性關(guān)節(jié)炎有效部位的制備方法和在制備治療類風濕性關(guān)節(jié)炎廣品中的應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為： 本發(fā)明的柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位是從柳葉繡線菊根中提取分離的 總木脂素有效部位，其中（ + )_異落葉松脂素、5-甲氧基-( + )-異落葉松脂素、（7R，8S)-5-甲 氧基二氫脫氫雙松柏醇和(7S，8R)-二氫脫氫雙松柏醇的重量之和20%~25%，通過以下方法 制備得到:柳葉繡線菊根加60%乙醇回流提取三次，每次用量為以公斤計柳葉繡線菊根重量 的8倍以升計體積量，每次2小時，濾過，濾液合并，減壓回收乙醇得提取物，提取物加水使溶 解，用量為以公斤計柳葉繡線菊根重量的0.5倍以升計體積量，經(jīng)大孔吸附樹脂柱DlOl色 譜，填充大孔吸附樹脂DlOl體積為以公斤計柳葉繡線菊根重量的0.5倍以升計體積量，用水 洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用70%乙 醇洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有 效部位。
[0007] 本發(fā)明采用活性指標指導下的導向分離模式確定有效部位和無效部位，采用大孔 吸附樹脂DlOl技術(shù)將柳葉繡線菊根60%乙醇提取物分離為水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、 70%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位，其中70%乙醇洗脫部位對弗氏完全佐劑誘導的大鼠 關(guān)節(jié)炎模型原發(fā)性炎癥和繼發(fā)性炎癥均有明顯的抑制作用。
[0008] 本發(fā)明的柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位中主要成分包括( + )_異落葉 松脂素、5-甲氧基-(+ )-異落葉松脂素、（71?，83)-5-甲氧基二氫脫氫雙松柏醇、（73,81〇-二 氫脫氫雙松柏醇、（7R，8R)-4，7，9，9 ' -四羥基-3，3 ' -二甲氧基-8-0-4 ' -新木脂素和（7R， 8S) -4，7，9，9 ' -四羥基-3，3 ' -二甲氧基-8-0-4 ' -新木脂素。
[0009] 本發(fā)明采用現(xiàn)代分離鑒定技術(shù)對柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位化學 成分進一步分離鑒定，包括8-羥基松脂醇[Yeo H，et al. Arch Pharm Res，2004,27:287-290·]、8_羥基_7'_表松脂醇[Tsukamoto H，et al. Chem Pharm Bull，1985,33:1232_ 1241 .]、（7R，8S)-5_甲氧基二氫脫氫雙松柏醇[Meng J X，et al. Org Biomol Chem，2010， 8:107-113.]、（75,81〇-二氫脫氫雙松柏醇[1^6 0￥，6七31.八代11?1^^111^8,2007,30: 402-407 · ]、（7R，8R)-4，7，9，9 ' -四羥基-3，3 ' -二甲氧基-8-0-4 ' -新木脂素 [Matsuda N，et al. Chem Pharm 81111，1996,44:1676-1679]、（71?，85)-4,7,9,9'-四羥基-3,3'-二甲氧基-8-0-4，-新木脂素 [Sinkkonen J，et al. Mag Reson 016111，2006,44:633-636.]、（ + )-異落 葉松脂素 [Julio D，et al. 8100(1，2003,655:459-466.]，5-甲氧基-(+ )-異落葉松脂素 [Zhang Z Z，et al. Phytochemistry，1999,51:469_472·]和環(huán)撤欖素[左國營，等·云南 植物研究，2005,27:101~106·]。
[0010] 化學結(jié)構(gòu)如下：
本發(fā)明采用高效液相色譜法測定( + )_異落葉松脂素、5-甲氧基-( + )-異落葉松脂素、 (7R，8S)-5-甲氧基二氫脫氫雙松柏醇和(7S，8R)_二氫脫氫雙松柏醇的含量。
[0011] 本發(fā)明提供柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位的制備方法，該方法包括以 下步驟:柳葉繡線菊根加60%乙醇回流提取三次，每次用量為以公斤計柳葉繡線菊根重量的 8倍以升計體積量，每次2小時，濾過，濾液合并，減壓回收乙醇得提取物，提取物加水使溶 解，用量為以公斤計柳葉繡線菊根重量的0.5倍以升計體積量，經(jīng)大孔吸附樹脂柱DlOl色 譜，填充大孔吸附樹脂DlOl體積為以公斤計柳葉繡線菊根重量的0.5倍以升計體積量，用水 洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無色，棄去洗脫液，用70%乙 醇洗脫至洗脫液近無色，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有 效部位。
[0012] 本發(fā)明提供的柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位的制備方法，制備的有效 部位中( + )_異落葉松脂素、5-甲氧基-( + )_異落葉松脂素、（7R，8S)-5_甲氧基二氫脫氫雙松 柏醇和(7S，8R)_二氫脫氫雙松柏醇的重量之和20%~25%。
[0013] 本發(fā)明提供的柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位的制備方法是從柳葉繡 線菊根中提取分離的總木脂素有效部位，主要成分包括( + )_異落葉松脂素、5-甲氧基-( + )_ 異落葉松脂素、（7R，8S)-5_甲氧基二氫脫氫雙松柏醇、（7S，8R)-二氫脫氫雙松柏醇、（7R， 81〇-4,7,9,9'-四羥基-3,3'-二甲氧基-8-0-4'-新木脂素和(71?，85)-4,7,9,9'-四羥基-3， 3 二甲氧基-8-0-4 新木脂素。
[0014] 本發(fā)明的柳葉繡線菊根抗類風濕性關(guān)節(jié)炎有效部位在制備治療類風濕性關(guān)節(jié)炎 產(chǎn)品中應(yīng)用，特別是在制備促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α、白介素_1β和白介素-6生成抑 制劑產(chǎn)品中應(yīng)用。
[0015] 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型是評價抗類風濕關(guān)節(jié)炎藥物對免疫性炎癥作用的經(jīng)典模 型，當大鼠足趾內(nèi)注射弗氏完全佐劑致敏后，其病變分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種:原發(fā)性病變 主要表現(xiàn)為早期致炎局部的炎癥反應(yīng)，致炎后18天右足腫脹達峰值，持續(xù)3天后逐漸減輕； 繼發(fā)性病變出現(xiàn)于致炎后15天左右，表現(xiàn)為對側(cè)(左后肢)和前肢腳的腫脹，耳和尾部出現(xiàn) "關(guān)節(jié)炎"小結(jié)，變應(yīng)性角膜翳以及體重下降等。細胞因子是一組由機體免疫細胞和非免疫 細胞合成、分泌產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，具有多種生物學功能。與類風濕性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的細 胞因子大部分由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和T細胞分泌，其中腫瘤壞死因子-α、白介 素_1β和白介素-6為致病因子，白介素-4和白介素-10為保護因子。腫瘤壞死因子-α是一種 具有多種生物活性的細胞因子，主要源于單核細胞和巨噬細胞。成熟的腫瘤壞死因子_α分 子量約為17kd，分為跨模型和分泌型，以三聚體形式與細胞表面受體結(jié)合。腫瘤壞死因子-α 促進滑膜細胞和軟骨細胞合成并釋放前列腺素 EdP膠原酶，引起骨和軟骨的吸收破壞，促 進成纖維母細胞的增生;促進軟骨內(nèi)蛋白多糖的吸收并抑制其合成，使軟骨降解;在活動性 類風濕性關(guān)節(jié)炎中能提高血小板的活性和聚集，促進成纖維細胞釋放黏附分子如細胞黏附 分子。白介素-1主要由單核細胞和巨噬細胞分泌。類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中 可檢出高水平的白介素-1，其水平與疾病的活動性