一種非小細胞肺癌吉非替尼耐藥pdx模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于肺癌吉非替尼耐藥模型構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非小細胞肺癌吉 非替尼耐藥PDX模型的構(gòu)建方法的專利申請。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌位居全球癌癥死亡率中的第一位，非小細胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%。非小細胞肺癌5年生存率小于15%，主要原因是大約70% 的患者首次診斷為非小細胞性肺癌時已處于晚期，多合并有遠處轉(zhuǎn)移。肺癌是率先在臨床 中應(yīng)用靶向治療的癌癥種類之一。在過去的十年中，小分子化合物酪氨酸激酶抑制劑在臨 床上廣泛應(yīng)用于NSCLC患者的靶向治療，其靶點為表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Rec印tor，EGFR)。吉非替尼是在臨床上應(yīng)用于EGFR突變的NSCLC患者的靶向藥 物之一。吉非替尼治療非小細胞肺癌中取得了顯著的療效，然而吉非替尼靶向治療長期使 用后，幾乎所有患者都會產(chǎn)生耐藥性。因此，模擬NSCLC肺癌吉非替尼耐藥過程并深入明確 NSCLC吉非替尼耐藥機制具有重要意義。
[0003] 對于吉非替尼敏感的NSCLC患者治療中，吉非替尼耐藥性的出現(xiàn)嚴重限制了其臨 床療效。為了研究吉非替尼獲得性耐藥機制，許多人非小細胞肺癌細胞系被誘導(dǎo)為吉非替 尼耐藥細胞系，例如HCC827、PC-9、A549長期暴露于吉非替尼，最終就會誘導(dǎo)成為吉非替尼 耐藥細胞系HCC827GR、PC9/ZD和A549GR。利用這種方法所建立的吉非替尼耐藥細胞系，國 內(nèi)外許多研究進行了 NSCLC吉非替尼耐藥機制研究。揭示了 3種不同的耐藥機制：60%非 小細胞肺癌產(chǎn)生獲得性吉非替尼耐藥的原因是由于特定的EGFR發(fā)生了突變，主要是T790M 突變；22%是某些基因的擴增，例如，MET、HER2、BRAF、AXL、MAPK1或者PIK3CA等；還有4% 是從非小細胞肺癌到上皮細胞肺癌的組織轉(zhuǎn)變，或者是具有干細胞特性；還有10%耐藥機 制則是不清楚的。然而，由于這些細胞經(jīng)過多代體外培養(yǎng)而具有同質(zhì)性，從而導(dǎo)致其并不能 充分反映臨床病人腫瘤組織中的腫瘤異質(zhì)性，因而存在較大的局限性。因此，要找到有效的 治療方法來干預(yù)NSCLC患者發(fā)生吉非替尼耐藥的過程，深入研究獲得性吉非替尼耐藥的發(fā) 生機制，迫切需要一種能夠真實反映 NSCLC患者腫瘤特征，并有效模擬NSCLC患者吉非替尼 耐藥發(fā)生過程的動物模型。
[0004] 將人腫瘤組織直接接種于免疫缺陷小鼠而構(gòu)建出的人組織來源的移植瘤 (patient-derived xenografts，Η)Χ)模型充分保留了患者腫瘤組織學異質(zhì)性，因此，在過 去的十年中各種腫瘤PDX移植瘤模型廣泛建立，并在組織學、基因水平和藥理作用水平得 到廣泛認可。PDX模型的建立提供了一個臨床研究應(yīng)用的前期平臺，并且被廣泛應(yīng)用于評價 新的臨床治療方案和篩選分子靶標。目前非小細胞肺癌吉非替尼耐藥的PDX模型一直未能 成功構(gòu)建。然而，建立吉非替尼耐藥的PDX模型有兩個方法，一個是直接將吉非替尼耐藥的 非小細胞肺癌組織進行接種構(gòu)建，一個是篩選出吉非替尼敏感的NSCLC PDX模型給予吉非 替尼進行誘導(dǎo)。第一種構(gòu)建方法的不足吉非替尼耐藥的非小細胞肺癌病人通常處于癌 癥晚期，沒有機會進行手術(shù)，通常通過穿刺進行再次診斷，而穿刺所取得的組織量少，因此 很難得到足夠多耐藥組織進行PDX模型構(gòu)建。2吉非替尼耐藥是長時間服用吉非替尼后發(fā) 生耐藥的，吉非替尼發(fā)生耐藥發(fā)生之前是無法分階段對病人進行穿刺獲得吉非替尼耐藥過 程中的組織。因此，我們采取第二種方法即構(gòu)建NSCLC PDX模型，篩選出對吉非替尼敏感的 模型組，然后采用逐步增加吉非替尼劑量的方法誘導(dǎo)NSCLC移植瘤發(fā)生吉非替尼耐藥，充 分模擬了 NSCLC患者吉非替尼耐藥發(fā)生過程，為進一步研究吉非替尼耐藥發(fā)生機制和篩選 干預(yù)耐藥過程藥物提供了臨床前平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種非小細胞肺癌吉非替尼耐藥PDX模型的構(gòu)建方法，所構(gòu)建 的非小細胞肺癌吉非替尼耐藥PDX模型可以作為直接用吉非替尼耐藥組織構(gòu)建的PDX模型 的替代品，并模擬了 NSCLC患者發(fā)生吉非替尼耐藥過程，對于研究吉非替尼耐藥機制，篩選 吉非替尼耐藥過程的靶點和小分子藥物，進而延緩或干預(yù)吉非替尼耐藥過程具有重要的意 義和實用價值。
[0006] 下面對本發(fā)明的詳細技術(shù)方案介紹如下。
[0007] -種非小細胞肺癌吉非替尼耐藥PDX模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1) 首先構(gòu)建非小細胞肺癌（NSCLC) H))(模型，具體為： 首先，獲得非小細胞肺癌病人的組織樣本，具體為：對臨床確診為非小細胞肺癌、且術(shù) 前均未接受過放療和化療的病人，在獲得其同意并辦理相關(guān)手續(xù)后，取其腫瘤組織作為樣 本，即人來源的非小細胞肺癌腫瘤樣本； 其次，將所獲得的人來源的非小細胞肺癌腫瘤樣本處理后，常規(guī)操作植入，所形成的腫 瘤即為移植瘤； 監(jiān)控植入人來源非小細胞癌腫瘤(移植瘤)的SCID小鼠生長情況，當腫瘤長到有壞死或 者液化現(xiàn)象時(此時腫瘤體積一般在500~1500 mm3左右)，應(yīng)及時進行傳代； 當腫瘤(移植瘤）被穩(wěn)定傳代至三代或三代以上時則認為該非小細胞肺癌（NSCLC) rox 模型構(gòu)建成功； (2) 對步驟（1)中所構(gòu)建的非小細胞肺癌（NSCLC) PDX模型進行評價，篩選出吉非替尼 敏感的非小細胞肺癌Η?模型；具體為： 首先，對所構(gòu)建的非小細胞肺癌（NSCLC) PDX模型中腫瘤生長界限進行記錄和判定， 所述腫瘤生長界限即移植瘤在小鼠體內(nèi)生長時壞死或者出現(xiàn)液化現(xiàn)象時的腫瘤體積臨界 值； 其次，對所構(gòu)建的非小細胞肺癌（NSCLC) PDX模型中腫瘤進行病理學和免疫組化染色 評價，所述免疫組化染色評價采用如肺鱗癌的標記物CK5/6、P63和P40 (CK5/6、P63和P40 是在臨床上公認的鱗癌標記指標)，肺腺癌的標記物TTF-1、CK8/18和NapsinA (TTF-1、 CK8/18和NapsinA是在臨床上公認的腺癌標記指標）等進行評價，以確定移植瘤類型為典 型的非小細胞癌移植瘤； 最后，對所構(gòu)建的非小細胞肺癌（NSCLC)PDX模型中腫瘤的EGFR基因進行突變檢測，檢 測時可采用現(xiàn)有的檢測試劑盒(如北京雅康博生物科技有限公司的"人EGFR基因突變檢測 試劑盒)，通過熒光PCR法定性確定EGFR基因類型；根據(jù)EGFR突變情況篩選出吉非替尼敏 感的非小細胞癌PDX模型， 對吉非替尼敏感的非小細胞肺癌PDX模型中的EGFR基因突變類型具體如：L858R、 L861Q、G719C、Exonl9 缺失等； 對于吉非替尼敏感的非小細胞肺癌PDX模型發(fā)生耐藥后基因型改變情況，出現(xiàn)EGFR T790M 基因突變，c-Met, HER2, BRAF, AXL, MAPK1 或者 PIK3CA 基因擴增等。
[0008] (3)構(gòu)建非小細胞肺癌吉非替尼耐藥H))(模型，具體為： 對步驟（2)中篩選獲得的吉非替尼敏感的非小細胞肺癌PDX模型，給予吉非替尼灌胃 處理，劑量從l〇~l〇〇mg/kg逐步增加給藥，從而誘導(dǎo)獲得性非小細胞肺癌吉非替尼耐藥FOX 模型； 誘導(dǎo)過程中，吉非替尼誘導(dǎo)劑量先從l〇mg/kg升至50mg/kg，再從50mg/kg升至100mg/ kg ； 為便于檢測，可在每個劑量產(chǎn)生耐藥的情況下，傳代前凍存組織樣本，以便于后期復(fù)蘇 后研究耐藥過程中的分子改變； 吉非替尼耐藥誘導(dǎo)過程總體需要7~10個月左右時間。
[0009] 目前，PDX模型具有功能性的基質(zhì)和血管、腫瘤微環(huán)境、并能反映腫瘤中心壞死和 腫瘤分化的特征，因此被認為是反映人體內(nèi)腫瘤生長的真實情況的最佳模型。這些PDX模 型比來源于細胞系的移植瘤更能夠反映病人體內(nèi)腫瘤的真實分子特征和腫瘤的異質(zhì)性。腫 瘤的生長和藥物的作用均可受到血管生成、生長因子、間質(zhì)和腫瘤微環(huán)境的影響，因此，基 于PDX模型所獲得的結(jié)果要比單純細胞系獲得的移植瘤更有信服力。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)中雖然有部分非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞系模型的成功構(gòu)建，但基 于臨床研究應(yīng)用的復(fù)雜性和特殊性，加上細胞系模型的局限性，因而構(gòu)建非小細胞肺癌吉 非替尼耐藥PDX模型仍然具有十分重要的意義。采用一般性思路，從非小細胞肺癌病人中 獲得吉非替尼耐藥的腫瘤組織并構(gòu)建PDX模型，雖然具有理論操作的可能性，但實際實踐 中，由于非小細胞肺癌吉非替尼耐藥過程中腫瘤組織的不可獲得性，因而使得這一思路無 法實現(xiàn)。
[0011] 本發(fā)明首先通過構(gòu)建非小細胞肺癌PDX模型，進一步篩選出對于吉非替尼耐藥敏 感的pdx模型，并以此為基礎(chǔ)采用吉非替尼誘導(dǎo)獲得了非小細胞肺癌吉非替尼耐藥的rox 模型，可以作為由非小細胞肺癌吉非替尼耐藥的腫瘤組織直接構(gòu)建的P D X模型的替代品， 對于研究吉非替尼耐藥機制，篩選吉非替尼耐藥過程的靶點和小分子藥物，進而延緩或干 預(yù)吉非替尼耐藥過程提供了較好的研究基礎(chǔ)，具有較好的推廣應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實施例1中其中一例非小細胞肺癌移植瘤模型的腫瘤生長曲