嘧菌酯對(duì)口腔癌及癌前病變的干預(yù)作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種化合物的新應(yīng)用，具體的說是涉及一種新的干預(yù)口腔癌細(xì)胞生 長(zhǎng)的化合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的3%，位居第六位?？谇话?的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡年輕化及女性增多趨勢(shì)，估計(jì)全球每年新發(fā) 病例27. 4萬例?？谇皇侨梭w的重要解剖學(xué)部位，口腔癌病人以外觀受損、進(jìn)食困難及疼痛 為主要癥狀，晚期還有張口困難、唾液減少、頸部僵硬等一系列臨床表現(xiàn)。目前，對(duì)于口腔癌 主要采用手術(shù)治療，放射治療，化學(xué)藥物治療為主的綜合序列治療，但治療效果往往不佳，5 年生存率不足50%。理想的抗癌藥物應(yīng)具備低毒、安全、有效、價(jià)廉等條件，因此亟需研發(fā)。
[0003]開發(fā)一種新藥花費(fèi)昂貴，周期長(zhǎng)，應(yīng)用現(xiàn)有已知的化合物，是尋找新抗癌藥物的 有效手段。啼菌酯（別名阿米西達(dá)，英文名Azoxystrobin)是一種從蘑燕分離出來的 strobilurin類天然殺蟲劑，具有廣譜、高效、低毒、保護(hù)、治療等特點(diǎn)。嘧菌酯是一種線粒 體呼吸抑制劑，分子式C22H17N305，分子量403. 3875,CAS號(hào)131860-3-8,合成專利最早由英 國(guó)帝國(guó)化學(xué)工業(yè)公司申請(qǐng)。通過抑制細(xì)胞色素Bel向細(xì)胞色素C的電子轉(zhuǎn)移，從而抑制線 粒體的呼吸。嘧菌酯毒性較低，對(duì)雌、雄大鼠的急性經(jīng)口、經(jīng)皮毒性均屬低毒，雌、雄大鼠經(jīng) 口LD50>5000mg/kg，急性經(jīng)皮LD50>5000mg/kg，急性吸入LC50 (2h) >2474mg/m3,屬低毒性， 致敏實(shí)驗(yàn)得出對(duì)豚鼠皮膚致敏率為0%。致畸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示嘧菌酯原藥未引起人外周學(xué)淋 巴細(xì)胞染色體畸變率增高，目前尚未見報(bào)道有致突變、致畸和致癌作用。在大鼠體內(nèi)的毒代 動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)是，嘧菌酯給藥后lh血藥濃度達(dá)到峰值，分布范圍廣，但在被測(cè)組織器官中未 有蓄積作用，排泄快，4h后主要以未經(jīng)代謝的原型直接隨糞便排出。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)背景缺陷：化療是口腔癌臨床治療常用方法之一，在口腔癌治療中發(fā)揮 了重要的作用，但部分病例在化療后機(jī)體對(duì)化療藥物出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，造成化療失敗，且副 作用較大。所以尋找新型低毒高效的治療藥物對(duì)口腔癌綜合治療具有重要意義。本發(fā)明所 涉及的化合物嘧菌酯為常見市售的廣譜殺菌劑，主要用于農(nóng)作物的病蟲害防治，其制備方 法簡(jiǎn)單，殺蟲效果好。我們研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯對(duì)口腔癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，有望為 臨床口腔癌治療的新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。迄今，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)嘧菌酯與癌癥相關(guān) 性研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前口腔癌綜合治療的缺陷，提供一種在制備用作抗腫瘤藥 物中應(yīng)用的化合物，為口腔癌的臨床藥物治療提供新的支持。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。
[0007]具體包括以下步驟：
[0008] 1.啼菌酯為式⑴所不結(jié)構(gòu)式的化合物，分子式為C22H17N305，化學(xué)名， (E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基）嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，CAS編號(hào)為 131860-33-8 ;外觀為白色粉末狀，分子量403. 34。本品也可溶于甲醇、甲苯、丙酮等其他有 機(jī)溶劑，但不以此為限，本發(fā)明中將嘧菌酯原藥溶于DMSO,配制成50mg/ml貯存液，存于4°C 冰箱。
[0009]
[0010] 2.嘧菌酯對(duì)口腔癌細(xì)胞增殖的影響
[0011] 通過CCK-8法檢測(cè)嘧菌酯對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，其原理為在電子耦合劑存在的 情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物。顏色的深淺與 細(xì)胞的增殖成正比，使用酶標(biāo)儀在450nM波長(zhǎng)處測(cè)定0D值，以間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
[0012] 將1. 5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml不同濃度的啼菌酯分別作用于口腔癌 細(xì)胞SCC15,CAL2724h，48h，72h后，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制。隨著藥物濃度的升高， SCC15及CAL27細(xì)胞增殖抑制率亦隨著升高。嘧菌酯作用于SCC15細(xì)胞24h，48h，72h的半 數(shù)抑制率IC50 分別為L(zhǎng)82μg/ml,7· 51μg/ml和 8· 02μg/ml;CAL27 細(xì)胞 24h, 48h, 72h的 IC50分別為4. 4μg/ml，6.5μg/ml，和5. 9μg/ml。提示嘧菌酯對(duì)口腔癌細(xì)胞增殖具有抑制 作用。
[0013] 3.嘧菌酯對(duì)口腔癌前病變細(xì)胞增殖的影響
[0014] 將1. 5μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml不同濃度的啼菌酯分別作用于口腔 癌前病變細(xì)胞D0K24h，48h，72h后，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制。48h，72h的抑制率都在 90% -100%之間。提示嘧菌酯對(duì)口腔癌前病變細(xì)胞的增殖抑制作用尤其顯著。
[0015] 綜上所述，本發(fā)明拓展了嘧菌酯新的應(yīng)用途徑，為將嘧菌酯應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞 生長(zhǎng)上，使其能進(jìn)一步應(yīng)用包括于治療口腔癌的醫(yī)藥組分中，改善口腔癌的治療效果。本發(fā) 明對(duì)該化合物的應(yīng)用的范圍包括對(duì)于口腔癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，進(jìn)而抑制腫瘤的增生，從而 延緩腫瘤的惡化。同時(shí)，本發(fā)明中亦可將嘧菌酯利用于抑制口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)的醫(yī)藥組成物 的成分中，還可包括藥學(xué)上可接收的載體。載體可為賦形劑（如水）、填充劑（如蔗糖或淀 粉）、黏合劑（如纖維素衍生物）、稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并未僅限于此。 本發(fā)明醫(yī)藥制劑可依一般習(xí)知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將嘧菌酯與一種以上的載體相混 合，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體制劑，但未以此為限。
[0016] 以下將配合圖示進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方式，
【附圖說明】
[0017] 圖1.嘧菌酯化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
[0018] 圖2.嘧菌酯對(duì)SCC15細(xì)胞增殖的影響；
[0019] 圖3.嘧菌酯對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的影響；
[0020] 圖4.嘧菌酯對(duì)D0K細(xì)胞增殖的影響；
【具體實(shí)施方式】
[0021] SCC15細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM-F12培養(yǎng)基中，CAL27細(xì)胞和D0K細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培 養(yǎng)基中，10%Gibco胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，并置于5%C02、95%空氣、 37°C的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，2-3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期。
[0022] 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組，嘧菌酯濃度分別為1. 5μg/ml、 3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml;溶劑對(duì)照組，與實(shí)驗(yàn)組同濃度的DMS0。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 用含0.25%EDTA胰酶消化，離心，棄上清。用含有10 %血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為 2. 5X104個(gè)/ml。每孔接種200μ1細(xì)胞懸液入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組4個(gè)復(fù)孔。貼壁過夜 后，吸棄上清，按組加入含有不同濃度漏蘆ΕΑ的培養(yǎng)液（血清含量為10% )，并設(shè)溶劑對(duì) 照組繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間（24h、48h、72h)。每孔加190μ1培養(yǎng)基和10μ1CCK8試劑，置于 37°C、5%C02飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)2. 5h后終止培養(yǎng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度（Α值）， 選擇450nm波長(zhǎng)，記錄結(jié)果，并按以下公式計(jì)算增殖抑制率：增殖抑制率（％) = (A$JSS-A 空白組)/ 對(duì)醒-A空白組)X100%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，具有下述結(jié)構(gòu)：2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，該化合物系 (E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基）啼啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙稀酸甲酯（methyl(E)_2_{2_[6_(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate)〇3. 權(quán)利1、2中所述化合物對(duì)口腔癌及癌前病具有顯著干預(yù)作用。4. 一種用于抑制口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)的制劑，包括有效劑量如權(quán)利要求1、2所述的化合物 以及藥學(xué)上可接收的載體或稀釋劑。5. 如權(quán)利要求4所述的制劑，其特征在于，所述制劑為片劑、糖衣丸、膠囊、注射劑、溶 液、乳液、油膏、乳膏、吸入劑、氣霧劑或栓劑。6. 如權(quán)利要求1、2所述的化合物或權(quán)利要求4、5中所述的制劑在制備防治口腔癌的藥 物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于一種化合物嘧菌酯(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯(methyl(E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate)的新用途和用于顯著抑制口腔癌細(xì)胞的制劑，屬于抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域。嘧菌酯獲取方法簡(jiǎn)便，化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，采用CCK-8法對(duì)口腔癌細(xì)胞SCC15和CAL27以及口腔癌前病變DOK細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有明顯的增殖抑制作用，本發(fā)明為臨床治療口腔癌新藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可應(yīng)用于抑制口腔癌細(xì)胞生長(zhǎng)的制劑中。
【IPC分類】A61K31/505, A61P35/00, C07D239/52
【公開號(hào)】CN105250303
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510778439
【發(fā)明人】湯曉飛, 王春曉, 陳慧, 張敏
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日