具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用， 具體涉及具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢早衰，是指已建立規(guī)律月經(jīng)的婦女，40歲以前，由于卵巢功能衰退而出現(xiàn)持 續(xù)性閉經(jīng)和性器官萎縮，常有促性腺激素水平的上升和雌激素的下降，40歲前卵巢早衰的 發(fā)病率約為1%~3%，而30歲內(nèi)的發(fā)病率約為0.1%。臨床表現(xiàn)伴有不同程度的潮熱多汗、 失眠多夢(mèng)、煩躁易怒、心悸、疲乏、情緒緊張、陰道干澀、性功能低下、不孕不育、提前閉經(jīng)等 絕經(jīng)前后癥狀，使患者未老先衰，如果得不到及時(shí)的調(diào)整和治療，可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、心腦血 管疾病等慢性病的出現(xiàn)，直接影響女性生活質(zhì)量，嚴(yán)重影響女性的正常工作，同時(shí)給其身心 健康和夫妻生活帶來(lái)極大痛苦。
[0003] 圍絕經(jīng)期綜合征出現(xiàn)的根本的原因是由于生理性或病理性或手術(shù)而引起的卵巢 功能衰竭。卵巢功能一旦衰竭或被切除和破壞，卵巢分泌的雌激素就會(huì)減少。女性全身有 多種雌激素受體，分布在幾乎女性全身所有的組織和器官，接受雌激素的控制和支配，一旦 雌激素減少，就會(huì)引發(fā)器官和組織的退行性變化，出現(xiàn)一系列的癥狀。由此可見，卵巢早衰 會(huì)引發(fā)圍絕經(jīng)期綜合征，治療卵巢早衰可以同時(shí)有利于治療圍絕經(jīng)期綜合征。卵巢早衰，其 病因迄今尚不清楚，所以對(duì)該病的研宄已成為國(guó)內(nèi)外生殖發(fā)育界的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi) 外研宄多認(rèn)為卵巢早衰與遺傳、免疫、代謝以及醫(yī)源性等因素有關(guān)。已有研宄資料顯示染色 體突變，促卵泡生成素（FSH)促黃體生成素（LH)及其受體變異，代謝異常，藥物作用， 放化療損傷，病毒感染，免疫性以及其他高危因素如吸煙、抑郁等因素可能是其原因，這些 因素或使卵巢先天性卵細(xì)胞數(shù)目減少，或使其卵泡閉鎖加速，或被直接破壞，使卵泡過(guò)早衰 竭，對(duì)于卵巢早衰的治療現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一般采用激素替代治療法。但卵巢早衰治療比較困難，西 醫(yī)臨床上采用激素替代療法，需要在大夫的指導(dǎo)下使用雌孕激素；研宄表明該雌激素和孕 激素治療的時(shí)候，有一定的作用，可以改善癥狀，但對(duì)卵巢功能的恢復(fù)并不理想，同時(shí)停藥 之后癥狀重新出現(xiàn)，使卵巢處于依賴狀態(tài)，有導(dǎo)致卵巢功能更差的可能，也就是說(shuō)激素替代 療法僅僅起到了治標(biāo)的作用，而且這種方法副作用大，長(zhǎng)期使用外源性激素有導(dǎo)致子宮內(nèi) 膜癌變的危險(xiǎn)，并增加冠心病以及膽囊病的發(fā)病率。因此，該激素治療的效果不理想，同時(shí) 存在安全隱患。
[0004] 近年來(lái)，隨著基因治療和干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，采用干細(xì)胞技術(shù)來(lái)代替激素的療法 愈來(lái)愈被關(guān)注；目前，存在有采用靜脈回輸間充質(zhì)干細(xì)胞/細(xì)胞因子，或采用經(jīng)腹部有創(chuàng) 介入腹腔鏡下卵巢原位注射間充質(zhì)干細(xì)胞/細(xì)胞因子的方法治療卵巢早衰，取得一定的療 效，但是該療效不是很理想，有效率低，具體表現(xiàn)在： 首先，靜脈回輸間充質(zhì)干細(xì)胞容易粘附成團(tuán)，未經(jīng)過(guò)濾輸入易造成肺靜脈栓塞，表現(xiàn)為 呼吸急促、紫紺、躁動(dòng)和驚厥等，也有造成心腦血管卒中偏癱的案例； 其次，雖然間充質(zhì)干細(xì)胞是低免疫原性，不表達(dá)或低表達(dá)II類抗原，但多次靜脈輸入 間充質(zhì)干細(xì)胞，仍有一定比例產(chǎn)生白細(xì)胞抗體，與輸入細(xì)胞的量/次成正比，抗原抗體反應(yīng) 可導(dǎo)致低熱、疲乏、呼吸窘迫等反應(yīng)，靜脈輸入細(xì)胞或因子，歸巢的量有限，也一定程度影響 了療效。
[0005] 介入療法一般要在腹部開口，腹腔鏡下介入導(dǎo)管到血管或病變局部，一次性介入 療效有限，多次介入反復(fù)給患者帶來(lái)醫(yī)源性創(chuàng)傷，不能接受，不易普及。
[0006] 因此，到目前為止，還沒(méi)有確切有效的方法能恢復(fù)卵巢的功能，所以卵巢早衰病因 復(fù)雜、治療難度較大，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)迄今尚未取得突破進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充 質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑，解決了目前的卵巢早衰和圍絕經(jīng)期綜合征治療用藥物吸收率 低、療效有限及使用時(shí)造成的創(chuàng)傷大的問(wèn)題。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間 充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑的制備方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 一種具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑，是 由臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子和用于承載所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其 細(xì)胞因子的透明質(zhì)酸鹽組成的混懸液；該透明質(zhì)酸鹽無(wú)免疫原性，廣泛存在于人體結(jié)締組 織中，有一定的抗炎作用和藥物緩釋作用，無(wú)細(xì)胞毒性； 所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子與透明質(zhì)酸鹽的體積比為1:1~3 ; 所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度為〇. 5X 107~5X 107個(gè)/ml，所述透明質(zhì)酸鹽的 終濃度為〇. 〇1~〇. 1%。
[0010] 在上述技術(shù)方案中，所述透明質(zhì)酸鹽的分子量為30~300萬(wàn)道爾頓。
[0011] 在上述技術(shù)方案中，所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子是人的傳代培養(yǎng) 8代以內(nèi)的異體臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子；更優(yōu)選的是，所述間充質(zhì)干細(xì)胞 及其細(xì)胞因子是來(lái)源于檢測(cè)合格的健康產(chǎn)婦的胎盤或新生兒的臍帶，將所述胎盤或臍帶經(jīng) 組織培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞，再將原代間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)至8代以內(nèi)， 收集間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子，凍存待用；其中，采用胎盤或臍帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞及其 細(xì)胞因子的來(lái)源，是因臍帶的增殖能力更強(qiáng)，胎盤分泌細(xì)胞因子的能力更強(qiáng)。
[0012] 上述具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制 劑，包括： 制備臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子； 將所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子與透明質(zhì)酸鹽按照所述比例混勻，制 得；所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度為〇.5X107~5X107個(gè)/ml，所述透明質(zhì)酸鹽的 終濃度為〇. 〇1~〇. 1%。
[0013] 在上述技術(shù)方案中，所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法為： 臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：取志愿、健康合格、產(chǎn)后24~72小時(shí)的冷藏新生兒臍 帶，浸泡消毒后，剪切成3~4cm的小段，用止血鉗去除每段臍帶中的血管(一根靜脈兩根動(dòng) 脈)，將臍帶組織塊與組織皮面分離，浸泡清洗后，將臍帶組織塊煎成3~4_3的塊狀，浸泡清 洗，2000rpm離心3min，棄上清，將得到的臍帶組織按0. 5g/瓶的質(zhì)量濃度接種到T175培養(yǎng) 瓶中，再在培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清，搖勻，于37 °C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng)至第5天和第8天時(shí)分別換培養(yǎng)液，2周后，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40~80%時(shí)，加入胰酶首 次消化傳代，換用無(wú)血清培養(yǎng)基，收集第3~8代間充質(zhì)干細(xì)胞，凍存?zhèn)溆谩?br>[0014] 胎盤來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：取志愿、健康合格、產(chǎn)后24~72小時(shí)的冷藏胎 盤，用止血鉗剝離覆蓋在胎盤絨毛板表面的羊膜組織后，再用精細(xì)剪從胎盤上剪取足量的 胎盤絨毛膜組織塊，清洗后，用組織鑷剔除上述胎盤絨毛膜組織塊上的血管組織和滋養(yǎng)層 組織，再次清洗后，用彎窄頭精細(xì)剪將剔除后的胎盤絨毛膜組織塊煎成3~5_ 3大小的組織 塊，2000rpm離心5min，棄上清，將得到的胎盤絨毛膜組織按lg/瓶的質(zhì)量濃度接種到T175 培養(yǎng)瓶中，再在培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清，搖勻，于37°0、5%〇) 2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，5天后首次換液，2周后，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40%~80%時(shí)傳代，換用無(wú)血清培養(yǎng)基，收集 3~8代間充質(zhì)干細(xì)胞，凍存?zhèn)溆谩?br>[0015] 在上述技術(shù)方案中，所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞因子的制備方法為： 將臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第3~8代后，加入胰酶消化再次傳代，待細(xì)胞融合度 到達(dá)60%~70%時(shí)，采用1%~10%02低氧培養(yǎng)，或者換培養(yǎng)液撤去胎牛血清饑餓培養(yǎng)，72小時(shí)后 收集培養(yǎng)基上清，限外過(guò)濾除去小分子物質(zhì)后，凍存待用。
[0016] 在上述技術(shù)方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑為用于局部靶向注射的 間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑；在本發(fā)明的技術(shù)方案中，該間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子 制劑的使用方法為局部靶向注射； 在上述