Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)研宄領(lǐng)域，尤其涉及一種Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷 治療中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 機(jī)體氧化和抗氧化失衡所導(dǎo)致的氧化損傷是衰老和疾病發(fā)生的核心機(jī)制。已經(jīng) 證實(shí)，包括急性冠脈綜合征、糖尿病、肝硬化以及中毒等急慢性疾病的發(fā)生均與氧化損傷有 關(guān)。有鑒于此，內(nèi)外許多學(xué)者試圖采用補(bǔ)充超氧化物歧化酶（SOD)、維生素 C、維生素 E、谷光 甘肽、退黑素等抗氧化物治療氧化性損傷。然而，外源性抗氧化物分子量大，較難透過細(xì)胞 膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且迅速被代謝，所以無法真正有效的糾正細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化失衡狀態(tài)，其 對(duì)機(jī)體氧化性損傷的治療亦達(dá)不到預(yù)期效果。
[0003] 核因子 E2 相關(guān)因子 2 轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor E2_related factor-2，Nrf2) 屬于Cap' n' Collar家族，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)眾多抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵性因子。生理?xiàng)l件 下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keapl結(jié)合處于非活化、易降解的狀態(tài)。在氧化應(yīng)激原作用后（如 毒物、吸煙、損傷等），Nrf2轉(zhuǎn)錄因子與Keapl解離活化進(jìn)入細(xì)胞核，并與抗氧化反應(yīng)元件 ARE(antioxidant response element)結(jié)合，啟動(dòng)下游的II相解毒酶、抗氧化蛋白等基因 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)氧化損傷的抗性。Mercado等研宄發(fā)現(xiàn)，去乙?；敢种苿┠軌蝻@ 著抑制氧化應(yīng)激后Nrf2蛋白表達(dá)和活性，下游抗氧化分子的表降低，提示去乙?；诰S持 Nrf2蛋白的穩(wěn)定性和活性中起著重要的作用。沉默信息調(diào)節(jié)因子I (silent information regulator l，Sirtl)是NAD依賴的去乙酰化酶，可以與轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄因子共調(diào)節(jié)因子相 互作用，通過去乙酰化作用調(diào)節(jié)靶蛋白活性、基因轉(zhuǎn)錄。有鑒于此，深入了解氧化應(yīng)激情況 下Nrf2乙酰化狀態(tài)，分析Sirtl-Nrf2抗氧化效應(yīng)，對(duì)于氧化損傷相關(guān)疾病的治療具有重要 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應(yīng)用的 實(shí)驗(yàn)方法，旨在深入了解氧化應(yīng)激情況下Nrf2乙?；癄顟B(tài)，分析Sirtl-Nrf2抗氧化效應(yīng)。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應(yīng)用的 實(shí)驗(yàn)方法包括體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)；
[0006] 所述的體外實(shí)驗(yàn)包括：
[0007] 步驟一、小鼠 AEC-II的分離純化；
[0008] 步驟二、小鼠肺泡II型上皮細(xì)胞的鑒定；
[0009] 步驟三、RT-PCR檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2基因表達(dá)改變與PQ作用 的時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系；
[0010] 步驟四、Western-bolt法檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2蛋白表達(dá)改變 與PQ作用的時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系；
[0011] 步驟五、免疫沉淀法檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-IINrf2的乙酰化水平；
[0012] 步驟六、化學(xué)比色法檢測(cè)SOD、CAT、GSH、MDA ;
[0013] 步驟七、ELISA檢測(cè)HO-I表達(dá)；
[0014] 步驟八、CO-IP法檢測(cè)Sirtl與Nrf2蛋白之間的相互作用；
[0015] 所述的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括：
[0016] 步驟一、小鼠原代MSC提取與培養(yǎng)；
[0017] 步驟二、BMSC的免疫熒光鑒定；
[0018] 步驟三、慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC細(xì)胞；
[0019] 步驟四、PQ中毒小鼠實(shí)驗(yàn)分組及模型建立；
[0020] 步驟五、PRC法、Western-blot法檢測(cè)Nrf2、Sirtl蛋白的表達(dá)情況；
[0021] 步驟六、化學(xué)比色法檢測(cè)MDA、SOD、GSH、CAT改變；
[0022] 步驟七、ELISA 法檢測(cè) IL-I β、TNF- a、IL-10、TGF- β 1 蛋白含量；
[0023] 步驟八、肺組織損傷的檢測(cè)。
[0024] 進(jìn)一步，所述的RT-PCR檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2基因表達(dá)改變與 PQ作用的時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系中的PCR引物為：
[0025] Sirtl，上游序列為 5' -acgctgtggcagattgttatta-3'，下游序列為 5? -ttgaagaatggtcttgggtctt~3,；
[0026] Nrf2，上游序列為 5' -attctttcagcagcatcctctc-3'，下游序列為 5? -acacttccaggggcactatcta-3,；
[0027] β-actin，上游序列為 5' -atatcgctgcgctggtcgtc-3'，下游序列為 5, _aggatggcgtgagggagagc_3,。
[0028] 進(jìn)一步，所述的PQ中毒小鼠實(shí)驗(yàn)分為8組：空白對(duì)照組、NS組、PQ組、PQ+NS組、 PQ+LV-MSC-GFP 組、PQ+LV-MSC-Nrf2 組、PQ+LV-MSC-Sirtl 組、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirtl 組；
[0029] 每組小鼠的處理如下：
[0030] 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食8h，禁水4h ;
[0031] PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirtl組：經(jīng)左側(cè)腹腔注射20% PQ溶液，染毒后Imin內(nèi)經(jīng)尾靜 脈注射濃度為IOX IO6Ail LV-MSC-Nrf2細(xì)胞懸液和LV-MSC-Sirl細(xì)胞懸液各0. 05ml ;
[0032] PQ+LV-MSC-Nrf2組：經(jīng)左側(cè)腹腔注射20 % PQ溶液，染毒后Imin內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射 濃度為 5 X l〇7ml LV-MSC-Nrf2 細(xì)胞懸液 0.1 ml ;
[0033] PQ+LV-MSC-Sirtl組：經(jīng)左側(cè)腹腔注射20% PQ溶液，染毒后Imin內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射 濃度為 5 X l〇7ml LV-MSC-Sirtl 細(xì)胞懸液 0.1 ml ;
[0034] PQ+LV-MSC-GFP組：經(jīng)左側(cè)腹腔注射20% PQ溶液，染毒后Imin內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射濃 度為 5 X 106ml LV-MSC-GFP 細(xì)胞懸液 0.1 ml ;
[0035] PQ+生理鹽水組：經(jīng)左側(cè)腹腔一次性注射20% PQ溶液，染毒后Imin內(nèi)經(jīng)右側(cè)腹腔 注射；
[0036] PQ組：經(jīng)左側(cè)腹腔注射20 % PQ溶液；
[0037] NS組：經(jīng)左側(cè)腹腔注射等體積的生理鹽水；
[0038] 空白對(duì)照組：未給予任何處理。
【附圖說明】
[0039] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的Sirtl_Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應(yīng)用的 體外實(shí)驗(yàn)的方法流程圖；
[0040] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應(yīng)用的 體內(nèi)試驗(yàn)的方法流程圖；
[0041] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的Sirtl、Nrf2蛋白表達(dá)水平圖；
[0042] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的Sirtl、Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量圖；
[0043] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的PQ刺激小鼠 AEC-II HO-I改變圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，茲例舉以下實(shí)施例，并配合附圖 詳細(xì)說明如下：本發(fā)明不存在軟件或方法的創(chuàng)新。
[0045] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化損傷治療中應(yīng)用的 實(shí)驗(yàn)方法包括體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)；
[0046] 如圖1所示所述的體外實(shí)驗(yàn)包括：
[0047] S101、小鼠 AEC-II的分離純化；
[0048] S102、小鼠肺泡II型上皮細(xì)胞的鑒定；
[0049] S103、RT-PCR檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2基因表達(dá)改變與PQ作用的 時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系；
[0050] S104、Western-bolt法檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2蛋白表達(dá)改變與 PQ作用的時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系；
[0051] S105、免疫沉淀法檢測(cè)PQ暴露小鼠 AEC-IINrf2的乙?；?；
[0052] S106、化學(xué)比色法檢測(cè) SOD、CAT、GSH、MDA ;
[0053] S107、ELISA 檢測(cè) HO-I 表達(dá)；
[0054] S108、CO-IP法檢測(cè)Sirtl與Nrf2蛋白之間的相互作用；
[0055] 1.體外實(shí)驗(yàn)：
[0056] I. 1 方法：
[0057] I. I. 1小鼠 AEC-II的分離純化
[0058] (1)清潔級(jí)健康ICR小鼠脫頸處死，置于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡5min，取出后 超凈臺(tái)操作，盡快完整的取下肺組織，在預(yù)冷的PBS液（含Dnase 10. 01g/L)中盡量去除氣 管、支氣管、血管等組織，PBS液沖洗直至洗液清亮。
[0059] ⑵將肺組織剪成ImmX ImmX Imm小塊后移至IOmL離心管，依照2mL/只小鼠加入 lg/L胰蛋白酶（含Dnase I 0. 01g/L)的比例加入胰蛋白酶，吸管吹打混勻，37°C消化5min， 將消化好的細(xì)胞懸液移除，加入與消化液等量的含10% FBS的M199終止消化。
[0060] (3)同上再次用lg/L的胰蛋白酶消化肺組織，5min后移出消化好的細(xì)胞懸液并終 止消化。
[0061] (4)在剩余肺組織中依照2mL/只小鼠加入lg/L I型膠原酶（含Dnase 10.0 lg/ L)的比例加入I型膠原酶，吸管吹打混勻，37°C，消化15min，將細(xì)胞懸液移出，加入與消化 液等量的含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的M199中止消化。
[0062] (5)將上述步驟中的細(xì)胞懸液混合，吸管充分吹打混勻，200目篩網(wǎng)過濾，1000 r/ min，5min，離心2次，棄上清，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的M19910mL重懸沉淀。
[0063] (6)純化：小鼠 IgG包被培養(yǎng)皿，將肺細(xì)胞懸液接種其中，于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min，將含未貼壁細(xì)胞的液體吸出接種于另一包被小鼠 IgG的培養(yǎng)皿 中，如此繼續(xù)在包被小鼠 IgG的培養(yǎng)皿中37°C孵育40min，連續(xù)2次。
[0064] (7)培養(yǎng)：吸出未黏附細(xì)胞，1000r/min，5minX2次離心，棄上清，用含10% FBS的 M199重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 109L-1，并按4X 105個(gè)/cm2密度接種于90cm2 -次性 培養(yǎng)皿和6孔培養(yǎng)板中，37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后換液，此時(shí)貼壁的 即為肺泡II型上皮細(xì)胞，此后每48-72h換液1次。
[0065]