miRNA-214抑制劑在抑制調(diào)節(jié)性T細胞中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療領域，具體地，涉及rniRNA-214抑制劑用于抑制調(diào)節(jié)性T細胞 (Treg)以及抑制腫瘤免疫逃逸，從而預防或治療腫瘤中的應用
【背景技術】
[0002]microRNA來源于長度約1000 bp的長鏈RNA初始轉錄產(chǎn)物（Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細胞核中經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約60-80nt的具有莖環(huán)結構的miRNA 前體。前提miRNA轉運至胞質(zhì)后，被進一步切割成長約18-26nt的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA 解開后，成熟的miRNA進入RNA誘導基因沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex, RISC)，與互補mRNA完全或不完全配對，降解靶mRNA或阻遏其表達。
[0003] 盡管microRNA在細胞總RNA中所占的比重很小，但由于miRNA參與生命過程中一 系列的重要進程，包括早期胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞死亡、細胞凋亡與脂肪代謝、細胞分 化以及在基因表達調(diào)控中的作用。而細胞增殖及凋亡等常在腫瘤中發(fā)生異常，因此推測 miRNA的異常缺失、突變或過表達將導致人類疾病的發(fā)生。
[0004] 在哺乳動物在長期的進化歷程中，免疫調(diào)控已形成了一套復雜的自查與平衡系 統(tǒng)，以保證機體在抵抗外源性抗原時可以保持一種自身耐受狀態(tài)，這其中的許多機制現(xiàn)在 仍未完全清楚。
[0005] 近來，越來越多證據(jù)顯示miRNA在免疫調(diào)控和免疫細胞的發(fā)育中扮演者及其重要 的角色。到目前為止，只有相對較少的特異性miRNA被揭示出可作為免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控 因子。尤其是在腫瘤免疫相關領域，人們對miRNA所起到的作用知之甚少。
[0006] 因此，本領域迫切需要了解在腫瘤治療領域，各種不同miRNA的作用，以開發(fā)新的 腫瘤治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了miRNA-214在調(diào)節(jié)性T細胞及腫瘤免疫逃逸中的應用。
[0008] 本發(fā)明的一方面，提供了一種miRNA-214或其前體的拮抗劑的用途，用于制備抑 制Treg細胞從而促進T細胞介導的免疫應答的藥物組合物。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA-214來源于人或非人哺乳動物；較佳地所述的非 人哺乳動物為大鼠、小鼠。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA-214拮抗劑包括miRNA-214或其前體的反義核酸 序列。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述Treg細胞包括CD4+CD25+Treg、CD4+Th3、CD4+Trl、 CD4+CD25+Treg、CD4+CD8+Ts。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括miRNA-214或其前體的拮抗劑作為活性 成分，和藥學上可接受的載體。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述藥學上可接受的載體選自下組：水、鹽水、脂質(zhì)體、脂質(zhì)、蛋 白、蛋白-抗體綴合物、肽類物質(zhì)、纖維素、納米凝膠、或其組合。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑還進一步抑制腫瘤免疫逃逸。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括結腸癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮 頸癌、纖維細胞癌、骨髓瘤、周圍神經(jīng)鞘膜瘤。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制Treg細胞包括抑制Treg細胞自T細胞分化、抑制 Treg細胞的生長、抑制Treg細胞的增殖。
[0017] 本發(fā)明第二方面，提供了一種篩選用于預防或治療腫瘤的候選化合物的方法，且 該化合物可作為Treg的抑制劑，包括步驟：
[0018] (a)在試驗組中，向細胞培養(yǎng)體系加入待測化合物，并測定miRNA-214的表達量和 /或活性，以及Treg細胞的細胞數(shù)量；在對照組中，向細胞培養(yǎng)體系不加入待測化合物，并 測定miRNA-214的表達量和/或活性，以及Treg細胞的細胞數(shù)量；
[0019] 其中，若試驗組中miRNA-214的表達量和/或活性顯著低于對照組，且Treg細胞 的細胞數(shù)量顯著少于對照組，則說明所述候選化合物未能夠抑制miRNA-214并抑制Treg細 胞從而預防或治療腫瘤的化合物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，還包括步驟
[0021] (b)對（a)中的化合物進一步測試其預防或治療腫瘤的作用。
[0022] 本發(fā)明第三方面，提供了一種體外非治療性的抑制Treg細胞的方法，向培養(yǎng)體系 中加入miRNA-214抑制劑，從而抑制Treg細胞和/或抑制腫瘤免疫逃逸。
[0023] 本發(fā)明第四方面，提供了一種抑制腫瘤逃逸從而預防或治療腫瘤的方法，向所需 的對象施用安全有效量的miRNA-214抑制劑，從而通過抑制Treg細胞抑制腫瘤逃逸并預防 或治療腫瘤。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的對象為哺乳動物，更佳地，為人。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的對象為癌癥患者，所述的癌癥包括結腸癌、肝癌、胃癌、食 管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、纖維細胞癌、骨髓瘤、周圍神經(jīng)鞘膜瘤。
[0026] 本發(fā)明第五方面，提供了一種活性成分的用途，所述的活性成分選自下組 ：
[0027] (a)微小RNA-214 (miRNA-214)家族，所述miRNA-214 家族包括：miRNA-214 或經(jīng)修 飾的miRNA-214衍生物、功能與miRNA-214相同或基本相同的微小RNA或經(jīng)修飾的miRNA 衍生物；
[0028](b)前體miRNA，所述的前體miRNA能在宿主內(nèi)加工成（a)中所述的微小RNA ;
[0029] (c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主轉錄形成（b)中所述的前體miRNA，并加 工形成（a)中所述的微小RNA;
[0030] (d)表達載體，所述表達載體含有（a)中所述的微小RNA、或（b)中所述的前體 miRNA、或（c)中所述的多核苷酸；
[0031] (e) (a)中所述的微小RNA的激動劑；
[0032] 其特征在于，所述活性成分用于制備促進調(diào)節(jié)性T細胞（regulatoryTcell,Treg 細胞）的組合物。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述活性成分還用于制備抑制T細胞介導的免疫應答的組合 物。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括權利要求1所述的活性成分以及藥學上可接受 的載體。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述促進調(diào)節(jié)性T細胞包括促進Treg細胞自T細胞分化、促進 Treg細胞的生長、促進Treg細胞的增殖。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA-214具有如SEQID NO. :1(ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU)所示的核苷酸序列。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的活性成分還被用于制備免疫抑制藥物組合物。
[0038] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0039] 圖1顯示miR-214在s-180腫瘤移植模型小鼠和LLC移植模型小鼠血漿和細胞微 粒子中的表達水平。圖IA為miR-214在s-180腫瘤移植模型小鼠血漿和細胞微粒子中的 表達結果。normal作為對照組，S-180為實驗組；圖IB為miR-214在LLC腫瘤移植模型小 鼠血漿和細胞微粒子中的表達結果。MV-free作為對照組，MV為實驗組。
[0040] 圖2顯示LLCMVs對Treg影響的結果圖。PBS作為對照組，LLCMV作為實驗組。 圖2A為具體實驗設計流程示意圖，首先收集LLCMVs，然后將LLCMVs(含有20Ug蛋白MV 的IOOiiLPBS)靜脈注射C57BL/6J小鼠，每2天一次，一共7次，第14天取小鼠全血、脾臟 中T細胞，收集血液和脾臟樣本。圖2B為miR-214在靜脈注射LLCMV的小鼠血漿中的表達 結果圖。圖2C為小鼠經(jīng)LLCMV處理后，全血中Treg細胞流式細胞檢測結果圖。圖2D為 小鼠經(jīng)LLCMV處理后，脾臟中Treg細胞流式細胞檢測結果圖。
[0041] 圖3顯示LLCMVs對腫瘤生長影響的結果圖。PBS作為對照組，LLCMV作為實驗組。 圖3A為具體實驗設計流程示意圖，首先收集LLCMVs，然后將LLCMVs靜脈注射C57BL/6J 小鼠，每2天一次，一共7次，第14天給小鼠移植s-180腫瘤（IO6細胞/只），第24天收集 血液和腫瘤組織樣本。圖3B為miR-214在s-180腫瘤移植小鼠血漿中的表達結果圖。圖 3C為LLCMVs預處理的小鼠中，植入腫瘤的體積變化曲線圖。圖3D為LLCMVs預處理的小 鼠中，植入腫瘤的體積實體圖。圖3E為LLCMVs預處理的小鼠中，植入腫瘤的重量結果圖。
[0042] 圖4顯示了體外CD4+T細胞經(jīng)不同濃度的LLCMV或miR-214缺失LLCMV處理72 小后，⑶4+CD25highF〇xp3+調(diào)節(jié)性T細胞誘導效果。圖4A為小鼠Treg流式細胞檢測結果圖。 圖4B為小鼠Treg含量統(tǒng)計結果柱狀圖。Control為對照組，5LLCMV、10LLCMV、10LLCMV/ miR-214def為實驗組。圖4A顯示的結果為五組實驗的平均值土標準誤差均值（SEM)。
[0043] 圖5顯示了小鼠經(jīng)不同MV處理，移植肉瘤S-180細胞后，腫瘤體積和重量的變化。 圖5A顯示了實施例4實驗流程圖。圖5B顯示了各組腫瘤的大小，其中，PBS為對照組，⑶4+T cell、CD4+Tcell(LLCMV)、CD4+Tcell(LLCMV/miR-214def)為實驗組。圖 5C顯示了腫 瘤的重量，結果與圖5B相同。
[0044] 圖6顯示了LLCMVs和LLCMV/miR-214def處理的Foxp3DTK型小鼠和野生型小鼠外 周血⑶4+T細胞miR-214的表達結果、Tregs細胞數(shù)量以及腫瘤的體積。圖6A顯示了實施 例5實驗流程圖，首先構建Tregs缺失（F〇xp3DTK)模型小鼠；每兩天用白喉毒素處理F〇xp3D? 型小鼠與野生型小鼠，持續(xù)2周；同時LLCMVs或LLCMV/miR-214def處理Foxp3D?型小鼠 與野生型小鼠；第十天，向小鼠注射S-180肉瘤細胞，第十七天處死，收集樣本。圖6B顯示 了qRT-PCR分析Foxp3D?和Foxp3+小鼠的脾臟CD4+T細胞中miR-214的表達水平。圖6C 顯示了流式細胞技術分析Foxp3DTK和Foxp3+小鼠全血中的Tregs細胞數(shù)量。圖6D顯示了 LLCMVs和LLCMV/miR-214def處理的Foxp3D?型小鼠和野生型小鼠肉瘤的體積。*，p〈0. 05 ; **，p〈0.Ol0
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