一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于膽紅素腦病的研究技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法
【背景技術(shù)】
[0002]高膽紅素血癥是新生兒臨床常見病癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致致死性的膽紅素腦病或嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。它可危及患兒生命，存活者常遺留手足徐動(dòng)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙、聽覺障礙、智力低下等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。迄今，對(duì)于膽紅素腦損傷這一嚴(yán)重危害新生兒健康的疾病，國內(nèi)外尚無特異性治療方法，仍以預(yù)防為主。在臨床實(shí)踐中，由于技術(shù)及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)等原因，有關(guān)新生兒高膽紅素腦損傷的神經(jīng)遞質(zhì)研究及其病理組織學(xué)檢查不宜在活體獲得，同時(shí)其神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)制也不明確，因此，必須依靠高膽紅素腦損傷的新生動(dòng)物腦模型來進(jìn)行深入的研究。
[0003]目前，有關(guān)高膽紅素血癥腦損傷的影像學(xué)研究取得了一些進(jìn)展，但存在不足是國內(nèi)膽紅素腦病動(dòng)物模型基本采用腹腔注射膽紅素液的方法建立動(dòng)物模型，但血清高膽紅素水平不穩(wěn)定，造模成功率極低，因此亟需探索一種穩(wěn)定的大鼠BE造模方法

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種應(yīng)用頸靜脈插管注射膽紅素制作BE模型，大大的提高了造模的成功率及其穩(wěn)定性，可作為該模型制作大力推廣，為今后該疾病的研究提供技術(shù)保障。
[0005]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法，其特征在于，所述應(yīng)用一種新的方法更穩(wěn)定的造模，包括以下步驟:
[0006]膽紅素溶液的配制，動(dòng)物造模；
[0007]動(dòng)物造t吳0.5小時(shí)后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)彳了處理和樣品米集；
[0008]取得動(dòng)物的腦組織，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化；
[0009]腦組織萃取及血清樣本的制備；
[0010]獲取血清及腦組織中膽紅素濃度的數(shù)據(jù)；
[0011]應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0012]進(jìn)一步，膽紅素溶液的配制:
[0013]膽紅素溶液的配制(使用前現(xiàn)配):避光稱取晶體膽紅素20mg溶于lml0.5M NaOH溶液中，加入雙蒸水9ml，用0.5M HCL調(diào)節(jié)pH至8.5即成膽紅素溶液，濃度為3.42mmo /L (2mg / ml)。
[0014]進(jìn)一步，動(dòng)物造模-J日齡新生大鼠，隨機(jī)分為:對(duì)照組和模型組；
[0015]用醫(yī)用膠帶將小鼠四肢固定在手術(shù)臺(tái)上，橡皮圈固定頭部。抽取2%鹽酸利多卡因注射液在小鼠頸正中線偏左(右)約1.5cm處皮下浸潤麻醉。持眼科鑷鈍性分離出頸總靜脈，用血管剪在頸總靜脈上剪一小口，將自制PE管(ID=0.lmm,ED=0.3mm)插入到血管內(nèi)，PE管遠(yuǎn)端接上Iml注射器(錫箔紙包好，避光)，注射少量含肝素的生理鹽水驗(yàn)證注藥通道通暢后，PE管近心端打結(jié)固定。在已建立的頸靜脈通道上，實(shí)驗(yàn)組緩慢注射上述現(xiàn)配制的膽紅素溶液，對(duì)照組注射安慰劑，均以50mg/kg體重劑量(即17μ I / g體重)注射，控制注射全時(shí)程保持在5-10min并保持注射過程在弱光下進(jìn)行。注完藥立即抽出PE管，打結(jié)頸總靜脈近心端，快速縫合創(chuàng)口，將小鼠放入到暗室內(nèi)避光。
[0016]進(jìn)一步，動(dòng)物處理及樣品收集:
[0017]獲取大鼠的血清，用于膽紅素濃度的檢測(cè)，斷頭取血完成后，隨即剖開大鼠大腦，迅速分離腦包膜，取出整個(gè)腦組織，用于膽紅素濃度檢測(cè)的樣本在實(shí)驗(yàn)前均保存在_80°C超低溫冰箱中。
[0018]動(dòng)物處理及樣品收集:
[0019]進(jìn)一步，觀察大鼠給藥后形態(tài)學(xué)上的變化:
[0020]模型組大鼠在給藥后均出現(xiàn)不同程度皮膚、粘膜黃染，煩躁、翻滾、俯伏狀，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍；對(duì)照組大鼠呼吸平穩(wěn)，無煩躁、翻滾等異?；顒?dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。
[0021]進(jìn)一步，腦組織形態(tài)學(xué)變化:
[0022]模型組腦組織兩側(cè)基底節(jié)區(qū)、海馬和小腦半球可見膽紅素顆粒沉積，呈現(xiàn)核黃染
[0023]進(jìn)一步，腦組織萃取及血清樣本的制備:
[0024]血液離心后取上層清液，腦組織用冰醋酸萃取后，取上層清液。用于膽紅素濃度的測(cè)定。
[0025]進(jìn)一步，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間的統(tǒng)計(jì)差異采用單因素方差分析，采用post hoc Dunnett’ s two-sided檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)且僅當(dāng)P值小于0.05時(shí)，結(jié)果被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)顯著性差異的。
[0026]本發(fā)明通過頸靜脈插管技術(shù)制作膽紅素腦病模型，大大的提高了造模的成功率及其穩(wěn)定性，可作為該模型制作大力推廣，為今后該疾病的研究提供技術(shù)保障。
【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的應(yīng)用一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法流程圖；
[0028]圖2是7日齡新生大鼠示意圖
[0029]圖3是7日齡新生大鼠頸靜脈插管的示意圖
[0030]圖4是注射后，實(shí)驗(yàn)組大鼠示意圖
[0031]圖5是對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的形態(tài)學(xué)比較
[0032]圖6是對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔內(nèi)情況比較
[0033]圖7是對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠全腦冠狀位的比較
【具體實(shí)施方式】
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0035]圖1示出了本發(fā)明提供的應(yīng)用應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法流程圖。
[0036]為了便于說明，僅僅示出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。
[0037]本發(fā)明應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法包括以下步驟:
[0038]膽紅素溶液的配制，動(dòng)物造模；
[0039]動(dòng)物造t旲0.5小時(shí)后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)彳丁處理和樣品米集；
[0040]取得動(dòng)物的腦組織，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化；
[0041]腦組織萃取及血清樣本的制備；
[0042]獲取血清及腦組織中膽紅素濃度的數(shù)據(jù)；
[0043]應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0044]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，膽紅素溶液的配制:
[0045]膽紅素溶液的配制(使用前現(xiàn)配):避光稱取晶體膽紅素20mg溶于Iml0.5M NaOH溶液中，加入雙蒸水9ml，用0.5M HCL調(diào)節(jié)pH至8.5即成膽紅素溶液，濃度為3.42mmo /L (2mg / ml)。
[0046]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，動(dòng)物造模:7日齡新生大鼠，隨機(jī)分為:對(duì)照組和模型組；
[0047]用醫(yī)用膠帶將小鼠四肢固定在手術(shù)臺(tái)上，橡皮圈固定頭部。抽取2%鹽酸利多卡因注射液在小鼠頸正中線偏左(右)約1.5cm處皮下浸潤麻醉。持眼科鑷鈍性分離出頸總靜脈，用血管剪在頸總靜脈上剪一小口，將自制PE管(ID=0.lmm,ED=0.3mm)插入到血管內(nèi)，PE管遠(yuǎn)端接上Iml注射器(錫箔紙包好，避光)，注射少量含肝素的生理鹽水驗(yàn)證注藥通道通暢后，PE管近心端打結(jié)固定。在已建立的頸靜脈通道上，實(shí)驗(yàn)組緩慢注射上述現(xiàn)配制的膽紅素溶液，對(duì)照組注射安慰劑，均以50mg / kg體重劑量(即17μ I / g體重)注射，控制注射全時(shí)程保持在5-10min并保持注射過程在弱光下進(jìn)行。注完藥立即抽出PE管，打結(jié)頸總靜脈近心端，快速縫合創(chuàng)口，將小鼠放入到暗室內(nèi)避光。
[0048]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，動(dòng)物處理及樣品收集:
[0049]獲取大鼠的血清，用于膽紅素濃度的檢測(cè)，斷頭取血完成后，隨即剖開大鼠大腦，迅速分離腦包膜，取出整個(gè)腦組織，用于膽紅素濃度檢測(cè)的樣本在實(shí)驗(yàn)前均保存在_80°C超低溫冰箱中。
[0050]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，觀察大鼠給藥后形態(tài)學(xué)上的變化:
[0051]模型組大鼠在給藥后均出現(xiàn)不同程度皮膚、粘膜黃染，煩躁、翻滾、俯伏狀，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍；對(duì)照組大鼠呼吸平穩(wěn)，無煩躁、翻滾等異?；顒?dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。
[0052]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，腦組織形態(tài)學(xué)變化:
[0053]模型組腦組織兩側(cè)基底節(jié)區(qū)、海馬和小腦半球可見膽紅素顆粒沉積，呈現(xiàn)核黃染。
[0054]作為本發(fā)明實(shí)施例的一優(yōu)化方案，腦組織萃取及血清樣本的制備:
[0055]血液離心后取上層清液，腦組織用冰醋酸萃取后，取上層清液。用于膽紅素濃度的測(cè)定。
[0056]作為本發(fā)明實(shí)施