專利名稱：增加骨的韌性和勁度以及減少骨折的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種服用甲狀旁腺素而增加骨的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折的可能性和/或嚴(yán)重性的方法。尤其是，本發(fā)明涉及在潛在的或?qū)嶋H的損傷部位中增加骨的韌性或勁度的方法，該損傷部位例如有骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)性或患有骨質(zhì)疏松的人的髖關(guān)節(jié)或脊柱。更具體的是，本發(fā)明涉及減少脊椎骨折的發(fā)生、減少多發(fā)性脊椎骨折的發(fā)生、減少脊椎骨折的嚴(yán)重性、和/或減少非脊椎骨折的發(fā)生的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的一些試劑諸如雌激素、膦酸二酯、氟化物或降鈣素可預(yù)防骨質(zhì)丟失并通過(guò)再充填重建空間而增加3-5％骨質(zhì)，但是不會(huì)明顯刺激凈骨形成。通過(guò)阻止骨轉(zhuǎn)換而保持的骨不能顯著防止已經(jīng)有明顯骨質(zhì)丟失的病人患骨折的危險(xiǎn)性。通過(guò)刺激骨形成而增加骨強(qiáng)度的合成代謝劑優(yōu)選的是可更好地防止已經(jīng)患有骨質(zhì)疏松的病人的骨折。
甲狀旁腺素(PTH)是哺乳動(dòng)物甲狀旁腺分泌的、84氨基酸產(chǎn)物，它通過(guò)對(duì)包括骨在內(nèi)的各種組織的作用來(lái)控制血清鈣水平。牛和人PTH(PTH(1-34))的N末端34氨基酸在生物學(xué)上被認(rèn)為是與全長(zhǎng)激素等價(jià)的?，F(xiàn)已證實(shí)激活PTH/PTHrP受體(PTH1受體)的PTH(例如包括1-31和1-38)、或PTHrP(PTH相關(guān)性的肽/蛋白質(zhì))、或者兩者中任一或兩者的類似物的其它氨基末端片段對(duì)骨質(zhì)具有相似的生物作用，但這些作用的大小可以不同。
對(duì)人體中各種形式PTH的研究已證實(shí)了骨具有合成代謝作用，并且對(duì)其用于治療骨質(zhì)疏松和相關(guān)的骨疾病引起了顯著的興趣。在許多動(dòng)物模型和人中已證實(shí)PTH對(duì)骨的顯著合成代謝作用(包括刺激骨形成)可增加骨質(zhì)和/或骨強(qiáng)度。
通常認(rèn)為對(duì)人和相關(guān)動(dòng)物模型使用PTH對(duì)皮質(zhì)骨具有副作用。事實(shí)上，出現(xiàn)在甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)疾病中的內(nèi)源性PTH的自然增加可導(dǎo)致皮質(zhì)骨變薄、并伴有小梁骨的連接性增強(qiáng)和小梁骨質(zhì)增加。過(guò)去的研究提示，當(dāng)Haversian皮質(zhì)骨(發(fā)現(xiàn)于人和高級(jí)哺乳動(dòng)物)在PTH的影響下重建時(shí)，將會(huì)出現(xiàn)骨的再分布從而使皮質(zhì)骨的骨質(zhì)和強(qiáng)度增加、同時(shí)小梁骨的骨質(zhì)和強(qiáng)度亦增加。例如，在發(fā)表的用PTH的臨床研究中，用外源性PTH治療后皮質(zhì)骨的骨質(zhì)減少了，這些發(fā)現(xiàn)引起了關(guān)注，即PTH的治療將導(dǎo)致皮質(zhì)骨的骨質(zhì)和強(qiáng)度降低。因這些研究而引起的關(guān)注之一是由于皮質(zhì)骨的丟失將導(dǎo)致總骨骼的骨質(zhì)的丟失。這在臨床上相應(yīng)的是在骨質(zhì)疏松中，小梁骨與皮質(zhì)骨相比丟失更大，意味著機(jī)械負(fù)荷主要由皮質(zhì)骨承擔(dān)。皮質(zhì)骨的連續(xù)丟失將增加骨折的危險(xiǎn)性。因此，骨質(zhì)疏松的治療劑對(duì)于保持或增加主要的剩余皮質(zhì)骨是很重要的。
已經(jīng)在非人動(dòng)物中用Haversian模型進(jìn)行了有關(guān)PTH對(duì)皮質(zhì)骨的影響的調(diào)查研究，這些動(dòng)物例如狗、雪貂、綿羊和猴，但是這些樣本的研究范圍對(duì)于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的可靠性確實(shí)是太小了。由PTH治療導(dǎo)致的變化對(duì)這些動(dòng)物的皮質(zhì)骨的機(jī)械性能的影響仍然是未知的。已發(fā)表的對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究表明，在用PTH期間皮質(zhì)骨骨質(zhì)增加了、但停用PTH后此增加又消失了。然而，嚙齒動(dòng)物的皮質(zhì)骨與Haversian皮質(zhì)骨具有明顯不同的結(jié)構(gòu)，并且通過(guò)表面添附成形和吸收而進(jìn)行重建、而不是通過(guò)骨單位的皮質(zhì)內(nèi)重建而重建。而且，當(dāng)一種試劑例如PTH改變骨的幾何形狀使骨變粗時(shí)，對(duì)嚙齒動(dòng)物的較短的骨的生物力學(xué)測(cè)試的工藝限制，使測(cè)量產(chǎn)生偽像。這些偽像從推斷大鼠的皮質(zhì)骨未反應(yīng)出人或其它動(dòng)物的皮質(zhì)骨基本骨單位重建的不安全性。因此，對(duì)諸如人的動(dòng)物進(jìn)行Haversian重建的現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，PTH對(duì)皮質(zhì)骨可能具有副作用，從而因皮質(zhì)骨的耗盡最后引起骨質(zhì)丟失。
為此，人們普遍認(rèn)為PTH的作用是患者需要同時(shí)或隨后用抗吸收劑治療才能使由PTH所致的骨質(zhì)丟失達(dá)到最少。實(shí)際上，此模式已成為對(duì)婦女進(jìn)行臨床研究的基礎(chǔ)。例如，對(duì)于子宮內(nèi)膜異位，三種臨床研究已經(jīng)在絕經(jīng)后婦女中使用PTH時(shí)同時(shí)用降鈣素或雌激素治療，或者在服用GnRH拮抗劑、醋酸那法瑞林的絕經(jīng)前婦女中使用PTH。雌激素和PTH對(duì)皮質(zhì)骨轉(zhuǎn)換的反作用使得在用這兩種試劑聯(lián)合治療期間僅僅觀察PTH的作用特別困難。
現(xiàn)在仍然需要一種使用PTH使具有Haversian重建的人和其它動(dòng)物的骨增加韌性和勁度的方法，和減少這些動(dòng)物發(fā)生骨折的方法。而且，還需要一種增加皮質(zhì)骨的質(zhì)量和數(shù)量的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明包括一種通過(guò)使用甲狀旁腺素而增加骨(優(yōu)選皮質(zhì)骨)的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折的發(fā)生和/或嚴(yán)重性的方法。尤其是，本發(fā)明涉及增加骨的潛在或?qū)嶋H的損傷部位的韌性或勁度的方法。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，增加骨的韌性和/或勁度可以用已知的許多方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如增加骨礦物質(zhì)密度、增加骨礦物質(zhì)含量、增加斷裂功，等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可減少脊椎骨折和/或非脊椎骨折的發(fā)生。本發(fā)明的方法可用于降低這些骨折的危險(xiǎn)性或治療這些骨折。尤其是，本發(fā)明的方法可減少脊椎骨折和/或非脊椎骨折的發(fā)生、減少脊椎骨折的嚴(yán)重性、減少多發(fā)性脊椎骨折的發(fā)生、提高骨的質(zhì)量，等等。
該方法可增加潛在損傷部位的韌性或勁度，例如患骨質(zhì)疏松的人的髖關(guān)節(jié)或脊柱；或者使骨質(zhì)異常缺乏或差的骨結(jié)構(gòu)的部位增加韌性或勁度。該方法還可增加諸如骨折之類的實(shí)際損傷部位的骨韌性或勁度，例如髖關(guān)節(jié)或脊椎。用本發(fā)明方法的優(yōu)選病人是有骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)或患有骨質(zhì)疏松的婦女或男子，優(yōu)選絕經(jīng)后婦女，并且不依賴于同時(shí)使用激素替代療法(HRT)、雌激素或同等療法、或抗吸收劑療法。在一個(gè)實(shí)施方式中，患者也可接受鈣和/或維生素D的補(bǔ)充治療。
甲狀旁腺素例如重組的人甲狀旁腺素的N末端氨基酸1-34可以周期性或者間歇給藥。周期性給藥方式優(yōu)選的是包括用PTH的2個(gè)或更多個(gè)重建周期以及停用PTH一個(gè)或更多個(gè)重建周期。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法，最后用甲狀旁腺素后，骨的韌性和/勁度的增加可保持?jǐn)?shù)個(gè)重建周期、或者直至數(shù)年。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A和1B表示用兩種劑量的PTH治療的動(dòng)物在股骨中段(皮質(zhì)骨)(A)和在近端股骨(網(wǎng)狀骨質(zhì)骨+皮質(zhì)骨)(B)中的BMD(骨礦物質(zhì)密度)和BMC(骨礦物質(zhì)含量)明顯大于對(duì)照組。
圖2A和2B表示PTH對(duì)股骨中段的皮質(zhì)骨中的機(jī)械強(qiáng)度和截面慣性矩(CSMI)的影響。
圖3表明對(duì)照組和治療組中的全身骨礦物質(zhì)含量的DXA測(cè)定的百分比變化。
圖4A-C表明對(duì)照組和治療組的脊柱做DXA測(cè)定的百分比變化、2-4腰椎骨的面積(A)、骨礦物質(zhì)含量(B)和骨礦物質(zhì)密度(C)的百分比變化。
圖5A和5B表明用甲狀旁腺素治療的靈長(zhǎng)目的腰椎中的骨質(zhì)(A)和骨強(qiáng)度(B)的增加。
圖6A和6B表明用甲狀旁腺素治療的靈長(zhǎng)目的肱骨骨干中段的恒定強(qiáng)度(B)和股骨頸的強(qiáng)度(A)的增加。
圖7表明肱骨中段的骨膜表面和骨內(nèi)膜表面上的骨形成率的活動(dòng)。
圖8表明PTH治療與對(duì)照組相比的腰椎骨中的骨體素密度改變的直方圖分析。注意停用PTH治療后皮質(zhì)骨腔隙中的密度增加。
圖9表明與用安慰劑治療的對(duì)照組相比、通過(guò)用PTH20μg/kg/天或PTH40μg/kg/天治療23個(gè)月的病人的腰棘BMD的增加。
圖10表明與用安慰劑治療的對(duì)照組相比、通過(guò)用PTH20μg/kg/天或PTH40μg/kg/天治療24個(gè)月的病人的股骨和髖關(guān)節(jié)頸的BMD的增加。
詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及一種使用甲狀旁腺素而增加骨的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折發(fā)生率的方法。本方法可用于增加潛在的損傷部位或?qū)嶋H的損傷部位的骨的韌性或勁度。該損傷一般包括骨折、外科損傷、關(guān)節(jié)復(fù)位、矯形外科方法，等等。增加骨的韌性/或勁度一般包括增加皮質(zhì)骨的礦物質(zhì)密度、增加骨的強(qiáng)度、增加抗負(fù)荷強(qiáng)度，等等。減少骨折的發(fā)生一般包括與未治療的對(duì)照人群相比，減少病人骨折的可能性或?qū)嶋H發(fā)生。
在本文中，極限壓力是指骨樣品所承受的最大壓力；勁度是指負(fù)荷變形曲線的線性部分的斜率；斷裂功是指斷裂前負(fù)荷形成曲線下的面積。通過(guò)骨研究領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法可對(duì)上述每一項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。這些參數(shù)是根據(jù)固有物質(zhì)性能和幾何形狀而確定的結(jié)構(gòu)特性，可根據(jù)Turner CH.Burr DB 1993“骨的基本生物力學(xué)測(cè)定指南(tutorial)”《骨》14595-608所述的方法測(cè)定，該文獻(xiàn)為本發(fā)明作參考文獻(xiàn)?？墒箻O限壓力、勁度和斷裂功正規(guī)化以得到固有物質(zhì)性能，例如極限應(yīng)力、彈性模量和韌性，它們不依賴于大小和形狀。在本文中，極限應(yīng)力是指樣品可承受的最大應(yīng)力；彈性模量是指物質(zhì)的固有勁度；韌性是指每單位體積抗骨折的強(qiáng)度。每一項(xiàng)都可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法確定。同前。本文所指的股骨的骨強(qiáng)度通常使用較后部位的三點(diǎn)或四點(diǎn)彎曲、在股骨頸或在股骨體中段進(jìn)行測(cè)量。骨損傷本發(fā)明方法有益于可能患有或已經(jīng)患有一處或多處骨折的患者。該方法可有益于哺乳動(dòng)物患者，例如人、馬、狗和貓，尤其是人。骨的損傷可能是賽馬和狗的一大問(wèn)題，也可能是家畜的一個(gè)問(wèn)題。人可因意外、醫(yī)療手術(shù)、疾病或紊亂而患各種骨損傷。年輕時(shí)，骨損傷可能是由于骨折、修復(fù)骨折的醫(yī)療手術(shù)、或修復(fù)被損傷的關(guān)節(jié)或結(jié)締組織而致，例如通過(guò)運(yùn)動(dòng)。骨損傷的其它形式在老年人中最多見，例如由骨質(zhì)疏松、變性性骨疾病(例如關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎)、髖關(guān)節(jié)復(fù)位或與其它系統(tǒng)疾病(糖皮質(zhì)類固醇骨質(zhì)疏松、燒傷或器官移植)的治療相關(guān)的繼發(fā)性疾病而致的損傷。
優(yōu)選的患者包括有骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)性或患有骨質(zhì)疏松的人(優(yōu)選婦女)。骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素在本領(lǐng)域是已知的，包括男子和婦女的性腺功能減退性疾病(不論年齡、健康狀況、誘導(dǎo)性腺功能減退的疾病或藥物)、與骨質(zhì)疏松有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)因素(最常見鈣或維生素D低下)、吸煙、飲酒、與骨丟失有關(guān)的藥物(例如糖皮質(zhì)類固醇、甲狀腺素肝素鈉、鋰、抗驚厥藥等)、傾向下垂的視力下降、宇宙航行、固定術(shù)、長(zhǎng)期住院或臥床休息、以及與骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)性增加有關(guān)的其它系統(tǒng)疾病。存在骨質(zhì)疏松的癥狀在本領(lǐng)域是已知的，包括至少一種脊椎壓迫骨折的放射跡象、低骨質(zhì)(特別是至少低于年輕人正常的平均值1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)和/或無(wú)創(chuàng)傷骨折。
骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致脊椎和/或非脊椎骨折。非脊椎骨折的例子包括髖關(guān)節(jié)骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。本發(fā)明方法可用于減少這些骨折的危險(xiǎn)性或治療這些骨折。通過(guò)增加骨(例如髖關(guān)節(jié)、脊柱或該兩者)的強(qiáng)度和/或勁度可降低骨折的危險(xiǎn)性并有助于骨折的愈合。代表性的有患骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)的婦女是絕經(jīng)后婦女或絕經(jīng)前婦女、性腺功能減退婦女。優(yōu)選的患者是絕經(jīng)后婦女，且與同時(shí)進(jìn)行激素替代法(HRT)、雌激素或等同治療、或抗吸收治療無(wú)關(guān)。本發(fā)明方法對(duì)任何階段的骨質(zhì)疏松患者都是有效的，尤其是對(duì)早期和晚期階段。
本發(fā)明尤其是提供了一種有效預(yù)防或降低患有骨質(zhì)疏松或有骨質(zhì)疏松加重危險(xiǎn)的患者的骨折的發(fā)生。例如，本發(fā)明可降低脊椎或非脊椎骨折的發(fā)生、減小脊椎骨折的加重、降低多發(fā)性脊椎骨折的發(fā)生、提高骨的質(zhì)量，等等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法對(duì)低骨質(zhì)的患者或以前有骨折將來(lái)有多發(fā)性骨折危險(xiǎn)的患者有效，例如脊柱骨折可能發(fā)展快的患者。
其他患者也可有骨損傷危險(xiǎn)，對(duì)這樣的患者本發(fā)明方法也有效。例如，許多有上述一種或多種骨折的患者可先期進(jìn)行外科治療骨損傷、或可在異常的低骨質(zhì)或差的骨結(jié)構(gòu)或礦物質(zhì)缺乏的骨骼部位的骨進(jìn)行矯形外科術(shù)。例如，外科術(shù)后的骨功能可用本發(fā)明方法得到恢復(fù)，該外科術(shù)例如關(guān)節(jié)復(fù)位(如膝或髖關(guān)節(jié))或脊柱拉緊、或固定骨或骨骼的其它方法。本發(fā)明方法也可幫助在骨質(zhì)異常缺乏或骨結(jié)構(gòu)差的部位的骨進(jìn)行手工矯形外科術(shù)后的恢復(fù)，該手術(shù)包括骨的外科切斷，包括切骨術(shù)、關(guān)節(jié)復(fù)位，其中骨結(jié)構(gòu)的丟失需要形成髖臼架，并防止修復(fù)偏移來(lái)進(jìn)行重建。實(shí)施本發(fā)明的其他適合的患者包括那些患有甲狀旁腺機(jī)能減退或脊柱后凸的患者，他們患有與甲狀旁腺機(jī)能減退或進(jìn)行性脊柱后凸有關(guān)或由其引起的損傷。骨的韌性和勁度本發(fā)明方法通過(guò)增加骨的韌性、勁度或其二者而降低損傷的危險(xiǎn)性或幫助損傷恢復(fù)。一般說(shuō)，骨的韌性或勁度是由皮質(zhì)骨、小梁骨和網(wǎng)狀骨質(zhì)骨的質(zhì)量和強(qiáng)度形成的。本發(fā)明方法可提供正常人范圍之內(nèi)或之上的骨韌性、勁度、質(zhì)量、和/或強(qiáng)度的水平。優(yōu)選的是，本發(fā)明提高了導(dǎo)致?lián)p傷或產(chǎn)生損傷危險(xiǎn)性的參數(shù)水平。與未治療的對(duì)照人群相比，增加了韌性、勁度、或兩者，或減少了骨折的危險(xiǎn)性或可能性。
當(dāng)骨的某些特征增強(qiáng)時(shí)，則可增強(qiáng)骨的韌性和/或勁度。這些特征包括骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨礦物質(zhì)含量(BMC)、活化頻率或骨形成率、小梁數(shù)、小梁厚度、小梁的連接性和其它連接性、骨膜的和骨內(nèi)膜的骨形成、皮質(zhì)孔、截面骨面積和骨質(zhì)量、抗負(fù)荷的強(qiáng)度和/或斷裂功。本發(fā)明方法的效果優(yōu)選是這些特征中的一種或多種特征的增強(qiáng)。
骨的某些特征如髓間隙和彈性模量降低時(shí)可增強(qiáng)骨的韌性和/或勁度。年輕人(柔韌和強(qiáng)勁)的骨含有的晶粒通常小于老年人骨的晶粒。因此，一般來(lái)說(shuō)減小骨晶粒的大小可增加骨的韌性和勁度，并降低骨折的發(fā)生。另外，骨的晶粒成熟可提供其它所需的特征(包括增加骨的韌性和勁度)和/或減少骨折的發(fā)生。本發(fā)明方法的效果優(yōu)選是增強(qiáng)這些特征中的一種或多種。
本發(fā)明方法可有效地增強(qiáng)幾種骨的韌性和/或勁度。例如，髖關(guān)節(jié)骨如髂骨、大腿骨如股骨、脊柱如脊椎的骨、或臂骨如遠(yuǎn)端前臂骨或近端肱骨。韌性和/或勁度增強(qiáng)可以是整個(gè)骨、或局限于骨的某些部分增強(qiáng)。例如，通過(guò)增強(qiáng)股骨頸或股骨轉(zhuǎn)子的韌性和/或勁度可增強(qiáng)股骨的韌性和/或勁度。通過(guò)增強(qiáng)髂嵴或髂棘的的韌性和/或勁度可增強(qiáng)髖關(guān)節(jié)的韌性和/或勁度。通過(guò)增強(qiáng)脊椎根、脊椎板或脊椎體的韌性和/或勁度可增強(qiáng)脊椎的韌性和/或勁度。該作用優(yōu)先產(chǎn)生于脊柱某些部分的脊椎，例如頸椎、胸椎、腰椎、骶椎和/或尾椎。優(yōu)選的是該作用產(chǎn)生于一個(gè)或多個(gè)中段胸椎和/或上腰椎。
這種韌性和/或勁度的增強(qiáng)可見于每一類型的骨中，或主要在一種類型骨中。骨的類型包括海綿狀的(網(wǎng)狀骨質(zhì)的、小梁的或?qū)訝畹?骨和致密的(皮質(zhì)的或稠密的)骨和骨折骨痂。本發(fā)明方法優(yōu)選通過(guò)作用于網(wǎng)狀骨質(zhì)骨或單獨(dú)作用于皮質(zhì)骨而增強(qiáng)韌性和/勁度。通過(guò)本發(fā)明方法也可使小梁骨變得柔韌和/或有勁度，該小梁骨附著有結(jié)締組織。例如，在附著韌帶、腱和/或肌肉的部位優(yōu)先具有附加的韌性。
本發(fā)明的另一方面，增強(qiáng)韌性或勁度可降低骨折的發(fā)生。在這方面，增強(qiáng)韌性或勁度可包括減少脊椎骨折的發(fā)生、減少重度骨折的發(fā)生、減少中度骨折的發(fā)生、減少非脊椎骨折的發(fā)生、減少多發(fā)性脊椎骨折的發(fā)生、或其組合。甲狀旁腺素作為活性成分，組合物或溶液可加入甲狀旁腺素的全長(zhǎng)、84氨基酸型，尤其是人的hPTH(1-84)型，可通過(guò)重組、肽合成或從人的體液提取得到。例如參見本發(fā)明的參考文獻(xiàn)美國(guó)專利號(hào)5,208,041。Kimura等在《生物化學(xué)生物物理研究會(huì)》114(2)493中報(bào)道了hPTH(1-84)的氨基酸序列。
上述組合物或溶液也可含有作為活性成分的人PTH或具有人PTH活性的大鼠、豬或牛的PTH片段或片段的變體，已由Kimmel等《內(nèi)分泌學(xué)》1993，32(4)1577報(bào)道的在卵巢切除的骨質(zhì)疏松大鼠模型中作了測(cè)定。
甲狀旁腺素片段需要至少含有第一28N末端殘基，例如PTH(1-28)、PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)。PTH變體的各種形式含有1-5氨基酸取代基，它提高了PTH穩(wěn)定性和半衰期，例如用亮氨酸或其它疏水氨基酸代替8和/或18位的蛋氨酸殘基可提高PTH抗氧化的穩(wěn)定性，用胰蛋白酶不敏感的氨基酸如組氨酸或其它氨基酸代替25-27區(qū)域內(nèi)的氨基酸可提高PTH抗蛋白酶的穩(wěn)定性。PTH的其它適合形式包括PTHrP、PTHrP(1-34)、PTHrP(1-36)和PTH的類似物或激活PTH1受體的PTHrP。這些PTHrP的形式均包含在本文一般所用的術(shù)語(yǔ)“甲狀旁腺素”中。該激素可通過(guò)已知的重組或合成方法得到，如在美國(guó)專利號(hào)4,086,196和5,556,940中所述，該文獻(xiàn)為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
優(yōu)選的激素是人PTH(1-34)，也叫做特立帕肽(teriparatide)。在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/069,075中描述了可用于本發(fā)明方法中的人PTH(1-34)的穩(wěn)定溶液，如重組的人PTH(1-34)(rhPTH(1-34))，該文獻(xiàn)為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。在美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/069,875中描述了可用于本發(fā)明方法中的人PTH(1-34)的晶體形式，該文獻(xiàn)為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。使用甲狀旁腺素的方法甲狀旁腺素通常以本領(lǐng)域已知的方法和劑型通過(guò)非腸道方式給藥，優(yōu)選皮下注射。在本發(fā)明參考文獻(xiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/069,075中描述了可優(yōu)先用于本發(fā)明方法中的人PTH(1-34)的穩(wěn)定制劑。該專利申請(qǐng)還描述了可儲(chǔ)藏和使用甲狀旁腺素的許多其它制劑形式。甲狀旁腺素的穩(wěn)定溶液可含穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑，等等。
用于溶液或組合物中的穩(wěn)定劑包括多羥基化合物，包括糖類，優(yōu)選單糖或二糖，例如葡萄糖、海藻糖、棉子糖或蔗糖；糖醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇或肌醇；以及多元醇，例如甘油或丙二醇或其混合物。優(yōu)選的多羥基化合物為甘露糖醇或丙二醇。多羥基化合物的濃度范圍可以是占總?cè)芤旱募s1-約20重量份％，優(yōu)選約3-10％。
用于本發(fā)明的溶液或組合物中的緩沖劑可以是藥學(xué)上可接受的任何酸或鹽的組合、且可使水溶液的pH保持3-7的范圍，優(yōu)選3-6。有用的緩沖系統(tǒng)例如有以醋酸鹽、酒石酸鹽或檸檬酸鹽為原料的。優(yōu)選的緩沖體系是以醋酸鹽或酒石酸鹽為原料的，最好的原料是醋酸鹽。緩沖的濃度可以是約2mM-約500mM的范圍，優(yōu)選約2mM-100mM。
本發(fā)明的穩(wěn)定溶液或組合物也包括腸道外可接受的防腐劑。這些防腐劑包括例如甲酚、芐醇、苯酚、氯芐烷銨、氯化芐乙氧銨、氯丁醇、苯基乙基醇、羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、乙基汞硫代水楊酸鈉以及硝酸苯汞和乙酸苯汞。優(yōu)選的防腐劑上甲氧甲酚或芐醇，最佳優(yōu)選是甲氧甲酚。防腐劑的用量可以占總?cè)芤旱募s0.1-約2重量份％，優(yōu)選約0.3-約1.0重量份％。
因此，穩(wěn)定的teriparatide溶液可含有甘露糖醇、乙酸鹽和甲氧甲酚，5℃時(shí)的預(yù)期半衰期大于15天。
如需要，甲狀旁腺素組合物可以是含不多于2％重量水的粉劑形式，這可通過(guò)將所選擇的甲狀旁腺素與上述的緩沖劑和穩(wěn)定劑混合制備成無(wú)菌的激素水溶液進(jìn)行冷凍干燥而得到。當(dāng)制備凍干粉末時(shí)特別用作緩沖劑的是以酒石酸鹽為原料的。尤其有用的穩(wěn)定劑包括甘氨酸、蔗糖、海藻糖和棉子糖。
另外，甲狀旁腺素可以用本領(lǐng)域所用的典型緩沖劑和賦形劑制備以穩(wěn)定和加溶非腸道給藥的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域已知的藥物載體及其制劑在Martin“Remington的藥物科學(xué)”第15版，Mack出版公司，Easton(1975)中已經(jīng)有描述。甲狀旁腺素也可經(jīng)肺、口、鼻、用栓劑或口服制劑給藥。
將甲狀旁腺素配制成給藥有效劑量，即可增加患者一處或多處骨的韌性和/或勁度、和/或減少骨折的可能性和/或嚴(yán)重性的劑量。優(yōu)選的是，有效量能改善皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和/或強(qiáng)度。優(yōu)選的有效量能減少脊椎骨折的發(fā)生、減少多發(fā)性脊椎骨折的發(fā)生、減少脊椎骨折的嚴(yán)重、和/或減少非脊椎骨折的發(fā)生。優(yōu)選的是，一個(gè)接受甲狀旁腺素治療的患者也使用有效量的鈣和維生素D，它們可加強(qiáng)激素的作用。甲狀旁腺素的代表性有效量為大于約5μg/kg/天，尤其是用于人時(shí)，但該劑量可大到約10-40μg/kg/天，或者更大的劑量尤其是對(duì)增加皮質(zhì)骨的韌性或勁度、或降低骨折的發(fā)生是有效的?；加屑谞钆韵贆C(jī)能減退的患者需要附加或較高劑量的甲狀旁腺素；這種患者還需要激素的替代療法。甲狀旁腺機(jī)能減退的替代療法所需的劑量在本領(lǐng)域是已知的。在某些情況下，PTH的相對(duì)效果可在小于約5μg/kg/天的劑量下觀察到，或者甚至小于約1μg/kg/天。
該激素可按常規(guī)給藥(如每天或每周一次或多次)、間歇給藥(如一天或一周內(nèi)不規(guī)則)或周期性給藥(如有規(guī)律地幾天或幾周為一周期給藥、然后停藥一周期)。優(yōu)選的是，對(duì)于骨質(zhì)疏松患者，1-7天PTH每天給藥一次，一周期3個(gè)月-3年。周期性使用甲狀旁腺素優(yōu)選的方案是使用至少2個(gè)重建周期、再停用至少1個(gè)周期。另一個(gè)優(yōu)選的方案包括至少用約12-約24個(gè)月、再停用至少6個(gè)月。在沒(méi)有附加給藥的情況下，數(shù)月給藥的效果可維持一年或兩年或更長(zhǎng)。甲狀旁腺素制劑的應(yīng)用本發(fā)明還包括含有本發(fā)明藥物組合物且根據(jù)本發(fā)明方法使用的試劑盒。該試劑盒包含一個(gè)小瓶，此小瓶含有干燥或液體形式的本發(fā)明制劑和適合的載體。該試劑盒還包括以小瓶上標(biāo)簽的形式和/或以包含在包裝小瓶的盒子中的插頁(yè)的形式的說(shuō)明書，用以說(shuō)明化合物的用途和給藥方法。該說(shuō)明書可印在包裝小瓶的盒子上。說(shuō)明書包含諸如足夠劑量和用法等有關(guān)信息、以便本領(lǐng)域工作者使用該藥物。本領(lǐng)域的工作者包括任何可能使用該藥物的醫(yī)生、護(hù)士或技術(shù)人員。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，該組合物包括一種或多種甲狀旁腺素的制劑，例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34)，并且適用于腸道外給藥。本發(fā)明的一種或多種甲狀旁腺素(例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34))的制劑可用于制備適用于通過(guò)腸道外給藥的組合物或藥物。本發(fā)明還涉及制備適用于腸道外給藥形式的組合物的方法，該組合物包括一種或多種甲狀旁腺素(例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34))的制劑。例如，采用常規(guī)技術(shù)、可以按幾種方式制備液體或固體制劑。液體制劑可通過(guò)以下方法制備即將一種或多種甲狀旁腺素例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34)溶解在適當(dāng)?shù)膒H、包括緩沖劑或其它賦形劑在內(nèi)的適合的溶劑(例如水)中，形成上述的一種穩(wěn)定溶液。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明、而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1 通過(guò)給兔使用rhPTH(1-34)以增強(qiáng)骨的強(qiáng)度和密度實(shí)驗(yàn)方法將一組最小的動(dòng)物、接近9個(gè)月齡且重3.25-3.75kg的未受損的雌性新西蘭白兔(HRP Inc.Denver，Pa.)按平均組體重分成3組，每組6只動(dòng)物，通過(guò)皮質(zhì)內(nèi)重建形成骨單位。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組接受劑量為10或40μg/ml/kg/天的生物合成PTH(1-34)治療。對(duì)照組按1.0ml/kg/天給予含2％熱滅活兔血清的酸化0.9M鹽水。每天一次皮下注射PTH(1-34)或載體，一周5天，共140天。用含0.5％Ca和0.41％P的兔用實(shí)驗(yàn)室食物飼養(yǎng)兔，并自由飲水。
選擇的劑量是根據(jù)一系列初步研究，結(jié)果表明(1)按100μg/kg單獨(dú)注射PTH(1-34)后，血清鈣升高且24小時(shí)不回到基線值，而按50μg/kg的劑量單獨(dú)注射后，血清鈣在24小時(shí)內(nèi)回到基線值，(2)按20μg/kg重復(fù)注射PTH(1-34)導(dǎo)致血清鈣短暫升高、并6-24小時(shí)回到基線值，以及(3)按小于5μg/kg注射PTH(1-34)不改變骨表面的組織形態(tài)測(cè)定。
處死之前，在第55天和第63天按20mg/kg肌內(nèi)注射一種雙茜素標(biāo)記物(Sigma，St.Louis)、在第15天和第7天按5mg/kg皮下注射一種雙鈣黃綠素標(biāo)記物(Sigma，St.Louis)。按隨意順序用CO2麻醉兔，最后一次注射后約3-6小時(shí)，通過(guò)心臟穿刺然后腹膜內(nèi)注射苯巴比妥(100mg/kg)處死動(dòng)物，取血。去除右側(cè)肱骨、雙側(cè)股骨、腰椎(L3-L5)和右側(cè)脛骨。血液化學(xué)通過(guò)計(jì)算機(jī)多道血清分析測(cè)定血清鈣、磷、堿性磷酸酶、肌酸和脲氮。組織形態(tài)測(cè)定在脛骨體中段的皮質(zhì)骨和L3網(wǎng)狀骨質(zhì)骨上進(jìn)行組織形態(tài)測(cè)定。處死后，從每只動(dòng)物中去除這些骨，并在10％中性緩沖福爾馬林中固定24小時(shí)。將組織在分級(jí)系列醇(70-100％，在真空下每級(jí)改變2，每次4小時(shí))脫水。然后將樣品置于二甲苯中，在真空下以20psi用異丁烯酸甲酯滲濾，2小時(shí)/步驟，再在Shandon Hypercenter自動(dòng)加工器(Shandon Lipshaw，Pittsburgh，PA)中進(jìn)行24小時(shí)滲濾。將樣品包埋在含0.2％引發(fā)劑的2％DDK原生質(zhì)(DelawareDiamond Knives，Wilmington，DE)中。用金剛鋸(Delaware DiamondKnives，Wilmington，DE)切割脛骨的截面80μm厚、再用Goldner三鉻染色。將約80μm厚的未染色截面加工以用于氟鉻標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)定。在Reichert-Jung 2050切片機(jī)(Magee技術(shù)公司，Dexter，MI)上j2L3的sagittal面切割成5μm厚，再用McNeal四鉻染色，或者留下未染色的作動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)定。
用Nikon熒光顯微鏡(Optiphot，Nikon，Tokyo，Japan)和半自動(dòng)數(shù)字轉(zhuǎn)換系統(tǒng)(Bioquant IV，R和M Biometrics，Nashville，TN)在150x放大率下進(jìn)行組織形態(tài)測(cè)定。通過(guò)脛骨骨干中段的全部截面積測(cè)定骨膜、皮質(zhì)內(nèi)(endocortical)和內(nèi)皮質(zhì)(intracortical)的被膜的骨形成和吸收。對(duì)網(wǎng)狀骨質(zhì)骨的測(cè)定是在腰椎中央、距離周圍皮質(zhì)外殼邊緣0.5mm的6mm2面積內(nèi)進(jìn)行的。命名原則是根據(jù)ASBMR委員會(huì)的組織形態(tài)測(cè)定命名原則(Parfitt AM，DreznerMK.Florieux FH，Kains JA，Malluche H，Meunier PJ，Ott SM，Recker RR 1987“骨的組織形態(tài)測(cè)定命名原則、符號(hào)和單位的標(biāo)準(zhǔn)化。ASBMR組織形態(tài)測(cè)定命名原則委員會(huì)的報(bào)告”?！豆堑V物質(zhì)研究雜志》2595610)。根據(jù)鈣黃綠素標(biāo)記物測(cè)定動(dòng)態(tài)參數(shù)。骨質(zhì)測(cè)定采用960A pQCT通過(guò)定量計(jì)算機(jī)斷層X(jué)射線照相法(QCT或pQCT)對(duì)50％乙醇/鹽水中的股骨中段和第4腰椎進(jìn)行截面掃描、并用5.1版Dichte軟件(Norland/Stratec，F(xiàn)t.Atkinson，WI)分析。用148×148×1200μm的三維象素尺寸測(cè)定全部組織參數(shù)，包括體積骨礦物質(zhì)密度(vBMD，mg/cm3)、截面積(X面積，mm2)和骨礦物質(zhì)含量(BMC)。以1.2mm切片厚度乘以X面積計(jì)算體積。用外周雙能量吸光測(cè)定法(pDEXA，Norland/Stratec)對(duì)置于含50％乙醇、鹽水的浴器中的被切除的股骨的整個(gè)股骨頸進(jìn)行掃描。特別是，用0.5×1.0mm的掃描步驟和0.04d的低限測(cè)定表面骨礦物質(zhì)密度(vBMD，mg/cm2)、投影面積(cm2)和骨礦物質(zhì)含量(BMC，g)。生物力學(xué)測(cè)試在右側(cè)股骨體中段和L5椎體中測(cè)定骨的力學(xué)性能。切除骨、清除結(jié)締組織、用被等滲鹽水浸過(guò)的紗布包裹、并在-20℃冷凍直至測(cè)試。測(cè)試前，將樣品在室溫下融化1-2小時(shí)。用MTS 810伺服水壓測(cè)試機(jī)(MTS公司，Minneapolis，MN)將所有樣品在37℃循環(huán)水浴中測(cè)試直至斷裂。用HP 7090A測(cè)定描繪系統(tǒng)(Hewlett Packard，Camas，WA)記錄負(fù)荷形成曲線。用數(shù)字轉(zhuǎn)換器系統(tǒng)(Jandel Scientific，Corte Madera，CA)測(cè)定極限壓力(樣品承受的最大應(yīng)力)、勁度(負(fù)荷形成曲線的線性部分的斜度)和斷裂功(斷裂前負(fù)荷形成曲線下的面積)。這些參數(shù)是根據(jù)固有物質(zhì)的性能和幾何形狀而決定的結(jié)構(gòu)性能。Turner ch，Burr DB 1993“骨的基本生物力學(xué)測(cè)定論文(tutorial)”《骨》14595-608。規(guī)范這些數(shù)據(jù)得到固有的物質(zhì)性能，例如極限應(yīng)力(樣品承受的最大應(yīng)力)、彈性模量(物質(zhì)的固有勁度)和不依賴于大小和形狀的韌性(每單位體積抗骨折的強(qiáng)度)。同上。
在股骨體中段用三點(diǎn)彎曲測(cè)定股骨的骨強(qiáng)度。將股骨置于面對(duì)承載器的前側(cè)卡具中。在54mm寬的兩個(gè)支架的中點(diǎn)加載。以1mm/秒的速度移動(dòng)負(fù)荷槽直至產(chǎn)生斷裂。使由負(fù)荷形成曲線得到的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)下式從極限壓力計(jì)算彎曲極限應(yīng)力σf＝FuLr/8I(1)其中σf為彎曲骨折應(yīng)力，F(xiàn)u為極限力，L為支架間的長(zhǎng)度，r為前后方向的半徑，I為慣性矩。同上。假定股骨的截面是橢圓形，計(jì)算慣性矩的值。
從用一付數(shù)字測(cè)徑器在股骨截面的四個(gè)象限中的每一象限所測(cè)定的厚度計(jì)算平均皮質(zhì)厚度，該儀器具有±0.005mm的精密度、精確到0.01mm(Mitutoyo，Japan)。
用下面的等式計(jì)算股骨的彈性模量(Ef)Ef＝(勁度)*(L3/48I) (2)用下面的等式計(jì)算股骨的韌性(韌性f)韌性f＝3*(斷裂功)*r2/LI (3)對(duì)于第5腰椎(L5)的力學(xué)測(cè)試，用Buehler Isomet慢速鋸(Buehler LTD，Evanston，IL)平行切割椎體的兩個(gè)端平面。截?cái)嗪?，在壓縮中測(cè)定L5的機(jī)械強(qiáng)度。通過(guò)一個(gè)轉(zhuǎn)換臺(tái)板糾正椎體表面的不平行排列，以1mm/秒的十字頭速度、以控制沖程來(lái)施加壓縮負(fù)荷。使由負(fù)荷形成曲線得到的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并評(píng)價(jià)不依賴于骨的幾何形狀的固有物質(zhì)性能，根據(jù)由總截面積劃分的極限壓力來(lái)計(jì)算極限應(yīng)力。
通過(guò)下式計(jì)算截面積(CSA)CSA＝πab/4 (4)其中a和b分別是前后方向和中橫方向的寬度。通過(guò)下式計(jì)算脊椎的彈性模量(Ev)Ev＝(勁度)/(CAS/h) (5)其中h為椎體的顱-尾高度。
用下式計(jì)算椎體的韌性(韌性v)韌性v＝(斷裂功)/(CSA*h) (6)聲學(xué)顯微術(shù)用金剛鋸從右側(cè)肱骨骨干的中段切下500μm厚的截面積。用1μm分辨率的測(cè)微計(jì)(Mitutoyo，Japan)測(cè)定每個(gè)樣品的精確厚度。用掃描聲學(xué)顯微鏡(UH3，Olympus，Japan)、通過(guò)前面Hasegawa K，Turner CH，Recker RR，Wu E，Burr DB 1995“通過(guò)掃描聲學(xué)顯微術(shù)測(cè)定骨質(zhì)疏松骨的彈性性能”《骨》1658-90所述的方法進(jìn)行聲速測(cè)定。采用這一技術(shù)，可以測(cè)定所選擇的固定點(diǎn)的詳細(xì)的固有力學(xué)性能。將50MHz轉(zhuǎn)換器(V-390，Panametrics，Waltham，MA)用于產(chǎn)生脈沖-回聲模式的聲波。50MHz透鏡產(chǎn)生直徑約60μm的聲束。將樣品固定于充滿恒溫水(22℃)的一個(gè)室的底部。用數(shù)字示波器(TDS 620，Tekronix，Beaverton，OR)測(cè)定從樣品頂部反射的聲波與從樣品的底部反射的聲波之間的延遲時(shí)間。在肱骨的前皮質(zhì)的5個(gè)不同的部位測(cè)定延遲時(shí)間，每個(gè)部位相互之間大于300μm。根據(jù)樣品的兩倍厚度被平均延遲時(shí)間除可計(jì)算聲速。用天平(AJ100，Mettler儀器公司，Heightstown，NJ)測(cè)量100％乙醇中的濕重(Ww)和浸沒(méi)重(Ws)。用Archimedes原理計(jì)算濕密度(ρ)ρ＝{Ww/(Ww-Ws)}*ρETOH (7)其中ρETOH為乙醇的密度(0.789g/cm3)。假定骨中的聲波途徑是均一的，用下式計(jì)算樣品的代表固有勁度的彈性系數(shù)(C)C＝ρ*v2(8)其中ρ為濕密度，v為聲速。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將Barlett分析用于檢查方差的均一性。當(dāng)方差均一時(shí)，采用post-hoc比較的Fisher’s PLSD試驗(yàn)的單向ANOVA。當(dāng)方差不均一時(shí)，采用Kruskal-Wallis非參數(shù)方差分析，使用Mann-Whitney’s U檢驗(yàn)的post-hoc分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯為p＜0.05。結(jié)果表示為平均值±SEM。結(jié)果體重和生物化學(xué)用載體PTH(1-34)按10mg/kg/天進(jìn)行處理的兔140天后體重稍微增加了。給予PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的體重減量51g，表示實(shí)驗(yàn)期間體重丟失了1.4±1.6％(表1)。雖然觀察到血清鈣和脲氮有少量增加，但血清測(cè)定是在兔的正常生理反應(yīng)范圍內(nèi)進(jìn)行的。較高劑量PTH(1-34)時(shí)血清堿性磷酸酶增加了兩倍(表2)。
表1--PTH(1-34)對(duì)體重的影響對(duì)照組 PTH(1-34) PTH(1-34)10μg/kg/天 40μg/kg/天初始體重(kg)3.43±0.083.42±0.083.42±0.08最終體重(kg)3.70±0.053.51±0.053.37±0.10增重(kg)0.26±0.090.09±0.05-0.05±0.05*每組的6只兔子的數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。*與對(duì)照組相比P＜0.05。
表2--PTH(1-34)對(duì)血清化學(xué)的影響對(duì)照組 PTH(1-34)PTH(1-34)10μg/kg/天 40μg/kg/天鈣(mg/dl) 12.1±0.312.6±0.213.5±0.3*磷酸鹽(mg/dl) 4.7±0.2 4.7±0.2 5.5±0.3堿性磷酸酶(iu/l) 24.7±4.141.0±8.149.8±7.1*肌酸酐(mg/dl) 1.9±0.1 1.6±0.1 1.8±0.1脲氮(mg/dl)12.1±0.318.1±0.823.9±1.9每組的6只兔子的數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。*與對(duì)照組相比P＜0.05。組織形態(tài)測(cè)定脛骨體中段的骨膜表面的骨形成(Ps.MS/BS)和皮質(zhì)內(nèi)表面的骨形成(Ec.MS/BS)在PTH(1-34)治療組中增加了(表3)。高劑量組的Ps.MS/BS明顯大于其它兩組(p＜0.001)，并且高劑量組的Ec.MS/BS明顯大于對(duì)照組(p＜0.05)。隨著血清堿性磷酸酶的持續(xù)增加，高劑量組中每一表面(Ps.MS/BS和Ec.MS/BS)的骨形成率明顯大于其它兩組(p＜0.05)。在骨膜的或皮質(zhì)內(nèi)膜的礦物質(zhì)聚集率(MAR)沒(méi)有改變。
用PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的吸收部位數(shù)(Rs.N/Ct.Ar)在皮質(zhì)外明顯大于其它兩組7倍(p＜0.05)。用PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的標(biāo)記骨單位數(shù)(L.On.N/Ct.Ar)與其它兩組相比也明顯增加(與對(duì)照組相比p＜0.01，與10μg/kg/天組相比p＜0.05)。兩組治療組的MAR明顯大于對(duì)照組(p＜0.01)，但PTH治療組之間沒(méi)有顯著性差異。兩種劑量的骨形成率(BFR/BV)和激活頻率(Ac.F)都增加了(分別p＜0.05，p＜0.01)。
雖然兩種劑量的骨面積(B.Ar)都增加了，但僅在高劑量組與對(duì)照組之間出現(xiàn)了顯著性差異(p＜0.01)。治療后骨髓面積(Ma.Ar)減少了，但三組間沒(méi)有顯著性差異。高劑量組的皮質(zhì)面積(Ct.Ar)明顯大于其它兩組(與對(duì)照組相比p＜0.0001，與低劑量組相比p＜0.05)。低劑量組的Ct.Ar也明顯大于對(duì)照組(p＜0.05>。％Ct.Ar中的結(jié)果類似。
用PTH(1-34)10μg/kg/天的兔的皮質(zhì)孔(Ct.Po)是對(duì)照組的兩倍(p＜0.05)，而用PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的Ct.Po是高于對(duì)照組6X(p＜0.01)。但是，隨著截面慣性矩的不斷增加，由于PTH也增加皮質(zhì)骨面積，因此該部位內(nèi)的皮質(zhì)內(nèi)腔隙的孔位置不影響生物力學(xué)強(qiáng)度。
表3--PTH(1-34)對(duì)脛骨中段的骨膜和皮質(zhì)內(nèi)的骨質(zhì)重建的影響參數(shù)縮寫 對(duì)照組 PTH(1-34) PTH(1-34)10μg/kg/天40μg/kg/天皮質(zhì)內(nèi)類骨質(zhì)表面Ec.OS/BS(％) 8.8±6.0 13.7±10.5 20.2±5.8皮質(zhì)內(nèi)類骨質(zhì)厚度Ec.O.Th(μm) 7.4±2.4 3.7±2.3 8.1±0.9骨膜礦物質(zhì)聚集率Ps.MAR(μm/天) 0.33±0.17 0.38±0.08 0.66±0.14皮質(zhì)內(nèi)礦物質(zhì)聚集率 Ec.MAR(μm/天) 1.33±0.22 0.79±0.16 1.32±0.15骨膜礦化表面Ps.MS/BS(％) 3.8±1.9 8.2±2.1 22.3±2.7*↑皮質(zhì)內(nèi)礦化表面 Ec.MS/BS(％) 26.4±6.632.6±8.2 57.7±10.4*骨膜骨形成率Ps.BFR/BS(μm3/μm2/yr) 0.02±0.02 0.03±0.01 0.16±0.05*↑皮質(zhì)內(nèi)骨形成率 Ec.BFR/BS(μm3/μm2/yr) 0.40±0.10 0.31±0.10 0.72±0.12*↑每組的6只兔子的數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。*與對(duì)照相比P＜0.05。↑與PTH(1-34)10μg/kg/天相比P＜0.05。表4--PTH(1-34)對(duì)脛骨體中段的皮質(zhì)內(nèi)的骨重建的影響參數(shù) 縮寫 對(duì)照組 PTH(1-34) PTH(1-34)10μg/kg/天 10μg/kg/天吸收腔數(shù) Rs.N/Ct.Ar(#/mm2) 0.014±0.0130.013±0.004 0.097±0.036*↑標(biāo)記的骨單位數(shù) L.On N/Ct.Ar(#/mm2) 0.011±0.0060.027±0.006 0.215±0.094*↑類骨質(zhì)厚度 O.Th(μm)4.92±0.59 5.42±0.305.16±0.27礦物質(zhì)聚集率 MAR(μm/天) 1.19±0.20 1.56±0.13*1.60±0.12*骨形成率 BFR/BV(％/yr)0.5±0.38.5±2.9*21.4±3.8*激活頻率 Ac.F(#/mm2/yr) 1.8±1.015.1±5.0*43.8±10.5*↑骨面積 B.Ar(mm2) 29.1±1.3 33.3±1.9 37.8±2.7*骨髓面積 Ma.Ar(mm2) 12.7±0.7 11.9±1.0 10.7±1.0皮質(zhì)的面積 Ct.Ar(mm2) 16.4±0.9 21.3±1.2*27.1±2.0*↑皮質(zhì)面積％ ％Ct.Ar(％) 56.4±1.5 64.2±1.6*71.6±1.5*↑每組6只兔子的數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。*與對(duì)照相比P＜0.05?！cPTH(1-34)10μg/kg/天相比P＜0.05。表5--PTH(1-34)對(duì)第3腰椎的網(wǎng)狀骨質(zhì)重建的影響參數(shù) 縮寫 對(duì)照組 PTH(1-34)PTH(1-34)10μg/kg/天 40μg/kg/天骨體積BV/TV(％) 27.5±1.4 30.5±3.427.9±3.2小梁厚度 Tb.Th(μm) 124.8±7.3 147.4±12.7 126.4±13.7被腐蝕的面積 ES/BS(％) 0.5±0.31.4±0.3 2.6±0.7*破骨細(xì)胞表面 Oc.S/BS(％)0.4±0.20.9±0.3 1.3±0.3類骨質(zhì)表面OS/BS(％) 5.2±1.37.2±1.2 27.7±3.8*成骨細(xì)胞表面 Ob.S/BS(％)1.4±0.61.3±0.6 15.3±5.6*類骨質(zhì)厚度O.Th(μm) 5.2±0.55.3±0.5 4.4±0.2類骨質(zhì)體積OV/TV(％) 0.10±0.02 0.13±0.03 0.46±0.7*礦物質(zhì)聚集率 MAR(μm/天)1.3±0.21.5±0.1 1.7±0.1礦化表面 MS/BS(％) 4.4±1.47.4±1.9 24.2±1.5*骨形成率 BFR/BS(μm3/μm2/yr) 19.7±5.3 38.5±8.9153.0±15.6*每組6只兔子的數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。*與對(duì)照組相比P＜0.05。↑與PTH(1-34)10μg/kg/天相比P＜0.05。
在網(wǎng)狀骨質(zhì)中，用PTH(1-34)治療，大多數(shù)的形成參數(shù)(OS/BS，Ob.S/BS，OV/TV和MS/BS)增加了(表5)。給PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的那些參數(shù)明顯高于其它兩組(所有參數(shù)與兩組對(duì)照組和10μg/kg/天組相比p＜0.01)。給PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的骨形成率(BFR/BS)與其它兩組相比明顯增加(與兩組對(duì)照組和10μg/kg/天組相比p＜0.0001)。雖然兩個(gè)PTH(1-34)治療組的吸收(ES/BS和Oc.S/BS)增加了，但僅僅高劑量組的被侵蝕表面(ES/BS)顯著大于對(duì)照組(p＜0.001)。三組之間的類骨厚度(O.Th)沒(méi)有差異。盡管加速了骨轉(zhuǎn)動(dòng)，但PTH(1-34)治療后分段的骨體積(BV/TV)沒(méi)有改變。任何組中都沒(méi)有觀察到隧道吸收和小梁周圍的纖維變性。骨質(zhì)測(cè)定在40μg/kg/天組中通過(guò)pQCT評(píng)定的股骨體中段的vBMD和BMC明顯高于其它兩組(與對(duì)照組相比vBMD的p＜0.001、BMC的p＜0.0001，與低劑量組相比vBMD的p＜0.05、BMC p＜0.01)(圖1A)。10μg/kg/天組的vBMD和BMC均明顯高于對(duì)照組(vBMD和BMC均為p＜0.05)。雖然股骨體中段的骨面積也隨著增加，但僅40μg/kg/天組有顯著的增加p＜0.05)。
通過(guò)雙X線吸光測(cè)定法(DXA或pDXA)測(cè)定的近端股骨的vBMD和BMC隨劑量增加。對(duì)照組與10μg/kg/天組之間的vBMD和BMC(p＜0.05)、以及對(duì)照組與10μg/kg/天組之間的vBMD和BMC(p＜0.001)均有顯著性差異(圖1B)。三組之間的骨面積沒(méi)有顯著性差異。
總的來(lái)說(shuō)，圖1表明在用兩種劑量PTH治療的動(dòng)物中，其股骨體中段(皮質(zhì)骨)(A)和近端股骨(網(wǎng)狀骨質(zhì)+皮質(zhì)骨)(B)中的BMD(骨礦物質(zhì)密度)和BMC(骨礦物質(zhì)含量)明顯大于對(duì)照組。用高刺量治療的兔的股骨體中段的皮質(zhì)骨面積明顯大于對(duì)照組。兩組的近端股骨的骨面積之間沒(méi)有顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*與對(duì)照組相比P＜0.05，↑與PTH 10μg/kg/天相比P＜0.05。
通過(guò)pQCT評(píng)定三組中vBMD、BMC或腰椎(L4)的骨面積均沒(méi)有顯著性差異。生物力學(xué)測(cè)試股骨體中段的結(jié)構(gòu)性能例如極限壓力、勁度和斷裂功是依賴劑量而增加的(圖2)。圖2表示PTH對(duì)股骨體中段的皮質(zhì)骨中的機(jī)械強(qiáng)度和截面慣性矩(CSMI)的作用。高劑量組的結(jié)構(gòu)力學(xué)性能(空方條)和CSMI顯著增強(qiáng)，而低劑量組的勁度也顯著增強(qiáng)。固有的物質(zhì)性能(暗方條)中，僅低劑量組的彈性模量與對(duì)照組相比顯著增加了。高劑量組的彈性模量與低劑量組的彈性模量相比明顯降低了。圖2中數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*表示與對(duì)照組相比P＜0.05；↑表示與10μg/kg/天相比P＜0.05。
此研究結(jié)果如圖2所示，給PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的所有參數(shù)均顯著高于對(duì)照組(對(duì)于極限壓力和斷裂功p＜0.01，對(duì)于勁度p＜0.05)。低劑量組的勁度也明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)。固有的物質(zhì)性能中，給40μg/kg/天的兔的彈性模量低于給10μg/kg/天的兔的彈性模量(P＜0.05)。聲學(xué)顯微術(shù)三組中聲速或彈性系數(shù)沒(méi)有顯著性差異。討論在未受損的成熟雌性兔的長(zhǎng)骨中，皮質(zhì)骨對(duì)生物合成的hPTH(1-34)的骨骼反應(yīng)包括物質(zhì)性能的直接調(diào)節(jié)和生物力學(xué)性能的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。PTH(1-34)增加骨轉(zhuǎn)動(dòng)和皮質(zhì)孔，并且在40μg/kg劑量時(shí)降低皮質(zhì)骨的物質(zhì)彈性模量。但是，降低的彈性模量大于通過(guò)增加骨膜表面和皮質(zhì)內(nèi)表面的骨質(zhì)聚集而補(bǔ)償?shù)?，結(jié)果兔的皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、勁度和斷裂功均顯著提高。
在此研究中采用未受損的兔，盡管骨轉(zhuǎn)換增加，但PTH(1-34)治療后腰椎的網(wǎng)狀骨質(zhì)的體積沒(méi)有改變。前面用一種骨質(zhì)減少模型來(lái)測(cè)試間歇使用PTH(1-34)的作用，該模型具有皮質(zhì)內(nèi)重建、和短重建期以及兔的快速生長(zhǎng)和早期骨骼成熟(6-9個(gè)月)等特點(diǎn)，這構(gòu)成了選擇模型兔的基礎(chǔ)。
雖然兔的血清鈣含量變化很大(10-16mg/dl)，但它不直接受飲食鈣的數(shù)量的影響，這是該模型的另一優(yōu)點(diǎn)。雖然用PTH(1-34)40μg/kg治療的兔的記錄出現(xiàn)了大約1mg/ml的短暫顯著升高，但實(shí)際值總是在已知的生理范圍內(nèi)。
目前的研究中，使用生物合成的hPTH(1-34)140天后可增加皮質(zhì)內(nèi)的骨形成率以及骨膜表面和皮質(zhì)內(nèi)表面。低劑量組的皮質(zhì)內(nèi)Ac.F增加了8X，而高劑量組增加了20X。這就導(dǎo)致低劑量組的脛骨的皮質(zhì)孔增加了2倍，高劑量組增加了6倍。聲學(xué)顯微術(shù)的數(shù)據(jù)顯示肱骨中骨本身的彈性性能沒(méi)有受到影響，說(shuō)明了固有的皮質(zhì)骨質(zhì)量是正常的。因此，增加的孔一定是由于彈性模量輕微減少所致，物質(zhì)的性能測(cè)定包括皮質(zhì)的間隙。
但是，在高劑量組中，增加的皮質(zhì)孔大于通過(guò)顯著增加脛骨體中段的骨膜表面和皮質(zhì)內(nèi)表面的MS/BS和BFR/BS而補(bǔ)償?shù)模@樣導(dǎo)致骨面積顯著增加。這將增加截面慣性矩，它與骨的抗彎剛性成比例，這與股骨體中段的結(jié)果相同(圖2)。與對(duì)照組相比，這些形狀和物質(zhì)性能的變化結(jié)果是增強(qiáng)了股骨骨干的機(jī)械強(qiáng)度和勁度，這樣就抵銷了皮質(zhì)孔增加的潛在的有害機(jī)械作用。結(jié)論總之，用PTH(1-34)治療后，骨轉(zhuǎn)動(dòng)和皮質(zhì)孔增加的同時(shí)伴有骨膜表面和皮質(zhì)內(nèi)表面的骨增加。這些現(xiàn)象合在一起可導(dǎo)致股骨的韌性、極限應(yīng)力、勁度和斷裂功的增強(qiáng)。
實(shí)施例2猴子服用rhPTH(1-34)后骨的強(qiáng)度和密度的增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)方法一般方法本研究的猴子生長(zhǎng)期是使用體重2.77±0.03kg(平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差[SEM])的野生、成年(封閉的生長(zhǎng)高原(plates))獼猴靈長(zhǎng)目(Macacafascicularis)。將猴隔離檢疫3個(gè)月，然后開始給食每100g含0.3％鈣、0.3％磷酸鹽和250IU維生素D3，并自由飲用氟化水(1ppm氟)。鈣含量相當(dāng)于1734mg鈣/2000卡路里。飼養(yǎng)1個(gè)月后，將動(dòng)物分成21只組或22只組，假裝手術(shù)或施行卵巢切除術(shù)。卵巢切除后24小時(shí)開始每天一次皮下注射載體(假手術(shù)和卵巢切除對(duì)照)或rhPTH(1-34)，按1μg/kg(PTH1)或5μg/kg(PTH5)的劑量。將動(dòng)物治療18個(gè)月(PTH1和PTH5)或12個(gè)月后，停止治療(PTH1-W和PTH5-W)。
實(shí)驗(yàn)組按表6所示的劃分。
表6-靈長(zhǎng)目研究的實(shí)驗(yàn)組

隔3個(gè)月時(shí)注射載體或rhPTH(1-34)后24小時(shí)取出血清和尿樣品。每個(gè)rhPTH(1-34)治療組中5只猴各抽樣一只設(shè)計(jì)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，在基線、7、11和17個(gè)月進(jìn)行抽樣(每次測(cè)量0-240分鐘)。在0時(shí)和隔6個(gè)月時(shí)，通過(guò)雙能量X線吸光測(cè)定法(DXA)測(cè)定總骨骼和脊柱(L-2至L-4)骨的質(zhì)量；外周定量計(jì)算機(jī)X線斷層照相法(pQCT)用于評(píng)定橈骨中段和末端、以及近端脛骨的骨質(zhì)。在6和15個(gè)月時(shí)做髂骨活檢以進(jìn)行組織形態(tài)測(cè)定。18個(gè)月后將所有動(dòng)物處死。
在腰椎L-3至L-4、股骨頸、肱骨體中段和股骨骨干的皮質(zhì)骨樣品中進(jìn)行生物力學(xué)試驗(yàn)(表7定義的測(cè)定)。在肱骨體中段、腰椎L-2、股骨頸、股骨體中段、橈骨體中段和末端橈骨中進(jìn)行常規(guī)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)定(表11所述的測(cè)定)。開始的統(tǒng)計(jì)分析將所有組與用載體治療的卵巢切除對(duì)照組進(jìn)行比較。該數(shù)據(jù)適用于檢查劑量依賴性、停藥的影響、結(jié)果之間的相互關(guān)系和用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法改變時(shí)間的其它探察分析。所有評(píng)定都是通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法實(shí)施和決定的。
對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，肱骨的皮質(zhì)骨是通過(guò)組織形態(tài)測(cè)定法和極化傅里葉變換紅外線顯微術(shù)進(jìn)行測(cè)定的。傅里葉變換紅外線顯微術(shù)是采用這種顯微術(shù)的已知方法進(jìn)行的。3D有限單元造型研究這些研究測(cè)定了在用18個(gè)月研究劑量的PTH的猴脊椎上的3D有限單元造型數(shù)據(jù)。將從卵巢切除(n＝7)組和PTH(n＝7)組切除的置于50％乙醇/鹽水中的L-5腰椎，通過(guò)定量計(jì)算機(jī)斷層X(jué)線照相法(QCT，Norland，F(xiàn)t，Atkinson，WI)、使用70×70μm象素、在500μm階中進(jìn)行掃描。對(duì)每個(gè)500μm截面進(jìn)行體積骨礦物質(zhì)密度(BMD，mg/cc)、骨礦物質(zhì)含量(BMC，mg)、截面積(X-面積)、網(wǎng)狀骨質(zhì)體積(BV/TV)、小梁厚度(Tb.Th)和連接性(節(jié)密度、腫脹(strut)分析)分析。將每系列掃描平均得到490×490×500μm的三維象素。然后堆積這些系列掃描，使用“marching cubes”規(guī)則(參見例如LorensenCline1987“Marching cubes，一種高分辨的3D表面構(gòu)造規(guī)則”《計(jì)算機(jī)制圖法》21，163-169)產(chǎn)生了每個(gè)骨的三角形表面網(wǎng)眼。然后將每個(gè)平滑形式的表面網(wǎng)眼用于產(chǎn)生3D有限-單元造型中使用的四面體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
每個(gè)四面體單元的楊氏模量從猴的股骨骨干研磨的皮質(zhì)骨干最初的三維象素密度和物質(zhì)性能產(chǎn)生。轉(zhuǎn)動(dòng)每個(gè)四面體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使每個(gè)脊椎的底面排列為平面。然后對(duì)每個(gè)L-5模型進(jìn)行線性彈性應(yīng)力分析，該模型中有100N的分配負(fù)荷施于中心的頂表面、與底平面垂直，而底表面固定在負(fù)荷方向。評(píng)價(jià)所得到的軸向變形曲線(與BMD分布相同)，并比較PTH組和卵巢切除組。在此轉(zhuǎn)變中，每個(gè)三維象素的密度是依賴于每個(gè)三維象素用與軟組織相對(duì)的骨填充的程度。結(jié)果本文所述的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，p＜0.05。在研究期間所有不治療動(dòng)物的體重都增加了初始體重的4％-9％。血清和尿測(cè)定所有卵巢切除猴在3和18個(gè)月時(shí)的血清雌二醇水平都低于5pg/mL。當(dāng)與假性對(duì)照組比較鈣的體內(nèi)平衡測(cè)定時(shí)，卵巢切除對(duì)照組具有較低的血清鈣和磷酸鹽和1，25-二羥基維生素D水平，但最后注射后24小時(shí)測(cè)定的內(nèi)源PTH、尿環(huán)腺苷酸(cAMP)、尿鈣、尿肌酸或血清脲氮沒(méi)有差異。與卵巢切除組比較，用rhPTH(1-34)治療的動(dòng)物具有較低的血清磷酸鹽、較低的內(nèi)源PTH、和較高的1，25-二羥基維生素D和尿cAMP。血清骨形成標(biāo)記測(cè)定表明卵巢切除的猴與假性手術(shù)者比較，血清總的堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣蛋白低，且rhPTH(1-34)恢復(fù)到假性值的水平。與卵巢切除對(duì)照組相比，用作骨吸收的生物化學(xué)標(biāo)記的尿C-端肽(交叉重迭(CrossLaps))分泌沒(méi)有受rhPTH(1-34)而改變。骨質(zhì)PTH(1-34)明顯增加了總體骨骼的骨質(zhì)，表示為全身BMC(圖3)。18個(gè)月的卵巢切除對(duì)照組的脊柱骨礦物質(zhì)密度(BMD)保持穩(wěn)定，而假性對(duì)照組增加了大約基線上面的5％(圖4A-4C和5A)。與基線相比(圖4A-4C和5A)，rhPTH(1-34)增加了7％-14％脊柱BMD、全身骨礦物質(zhì)含量增加達(dá)到6％(BMC，圖3)。脊柱骨礦物質(zhì)含量也增加了(圖5A)。在rhPTH(1-34)治療的靈長(zhǎng)目中，這些增加值明顯高于卵巢切除對(duì)照組，與假性組相當(dāng)(PTH1)或超過(guò)(PTH5)假性組。rhPTH(1-34)沒(méi)有改變橈骨體中段或橈骨末端的BMD。PTH5組的骨體中段的截面積增加了7％。近端脛骨中，截面積未增加，但與卵巢切除對(duì)照組相比，rhPTH(1-34)增加了BMC和BMD。停止治療后6個(gè)月，脊柱和股骨頸中的BMD和BMC仍然高于卵巢切除對(duì)照組，肱骨體皮質(zhì)中段沒(méi)有變化。骨強(qiáng)度rhPTH(1-34)增加脊椎強(qiáng)度(Fy)可達(dá)43％(表7和8，圖5B)。rhPTH(1-34)提高股骨頸強(qiáng)度(Fu)可達(dá)12％(表7和9，圖6A)。當(dāng)與卵巢切除對(duì)照組比較時(shí)，rhPTH(1-34)沒(méi)有改變?cè)陔殴求w中段的皮質(zhì)骨干中的測(cè)定值(表7和10)、或股骨骨干樣品的物質(zhì)性能(表7和9，圖6B)。在用rhPTH(1-34)治療12個(gè)月再停止治療6個(gè)月的動(dòng)物中，骨強(qiáng)度測(cè)定值仍然大于卵巢切除對(duì)照組(表7-10，圖5B和6A)。
表7 第3和第4腰椎(L-3和L-4)、肱骨體中段、近端股骨頸和股骨干樣品的可變量

表8 18個(gè)月的卵巢切除靈長(zhǎng)目的脊柱(腰椎，L-3和L-4組合)強(qiáng)度的生物力學(xué)測(cè)定

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個(gè)月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個(gè)月再停止治療6個(gè)月；PTH5＝使用18個(gè)月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個(gè)月再停止治療6個(gè)月。
a參見表4.1有關(guān)可變量的說(shuō)明。
b每組的數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
o與OVX對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。
s與假性對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。
表9 18個(gè)月的卵巢切除靈長(zhǎng)目股骨干相同大小骨干樣品物質(zhì)性能的生物力學(xué)測(cè)定、和股骨頸強(qiáng)度的生物力學(xué)測(cè)定

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個(gè)月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個(gè)月再停止治療；PTH5＝使用18個(gè)月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個(gè)月再停止治療。
a參見表4.1有關(guān)可變量的說(shuō)明。
b每組的數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
o與OVX對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。
s與假性對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。
表10 18個(gè)月的卵巢切除靈長(zhǎng)目肱骨體中段皮質(zhì)骨的生物力學(xué)測(cè)定

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個(gè)月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個(gè)月再停止治療；PTH5＝使用18個(gè)月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個(gè)月再停止治療。
a參見表4.1有關(guān)可變量的說(shuō)明。
b每組的數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。
o與OVX對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。
s與假性對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。骨組織形態(tài)測(cè)定雖然卵巢切除組的轉(zhuǎn)換率大于假性對(duì)照組，但髂骨嵴中的骨體積沒(méi)有明顯丟失。許多動(dòng)物中沒(méi)有檢測(cè)到在6個(gè)月時(shí)給的四環(huán)素標(biāo)記物，在此時(shí)間點(diǎn)僅測(cè)定了靜態(tài)參數(shù)。15個(gè)月時(shí)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)表明與卵巢切除組相比，用rhPTH(1-34)治療增加了網(wǎng)狀骨質(zhì)骨的面積，并在沒(méi)有增加高于卵巢切除對(duì)照組所側(cè)得的骨吸收的情況下增加了骨形成。高劑量rhPTH(1-34)逐漸增加骨形成率。雖然治療12個(gè)月再停用rhPTH(1-34)后，與卵巢切除對(duì)照組相比網(wǎng)狀骨質(zhì)骨仍然增加，但骨形成和吸收回復(fù)到卵巢切除對(duì)照組的水平，骨轉(zhuǎn)換仍然大于假性對(duì)照組。rhPTH(1-34)沒(méi)有影響礦化、激活頻率或重建周期。吸收與形成之間基于單個(gè)骨多細(xì)胞單位(BMU)的骨平衡沒(méi)有差異。概括而言，rhPTH(1-34)通過(guò)選擇性刺激骨形成而增加網(wǎng)狀皮質(zhì)骨。
在肱骨的皮質(zhì)骨中，rhPTH(1-34)沒(méi)有顯著改變BMD或骨強(qiáng)度測(cè)定，rhPTH(1-34)刺激骨膜、骨內(nèi)膜和皮質(zhì)內(nèi)的腔隙的改變(表11和12)。雖然兩組之間的總面積或髓面積沒(méi)有差異，但rhPTH(1-34)增加皮質(zhì)面積，而PTH5和PTH5-W組明顯具有更多的皮質(zhì)骨，說(shuō)明增加了截面慣性矩，它是強(qiáng)度的一種測(cè)定值。面積的增加可能是由于骨膜和骨內(nèi)膜的表面的骨形成均增加所致(圖7)。
與卵巢對(duì)照組和其它rhPTH(1-34)治療組相比，假性對(duì)照組和PTH5-W組的骨膜礦化表面減少。與假性對(duì)照組相比，卵巢切除對(duì)照組的皮質(zhì)內(nèi)的礦化表面明顯更大，rhPTH(1-34)沒(méi)有增加到大于卵巢切除對(duì)照組的值。在皮質(zhì)內(nèi)重建中，卵巢切除的動(dòng)物有更多的吸收空間，卵巢切除組、PTH1和PTH5組的激活頻率大于假性對(duì)照組或任一停藥組。與假性對(duì)照組相比，卵巢切除組的每單位面積明顯具有更多的標(biāo)記骨單位，rhPTH(1-34)沒(méi)有增加到明顯大于卵巢切除對(duì)照組的值。
與假性對(duì)照組相比，卵巢切除組的皮質(zhì)內(nèi)的孔更大，但卵巢切除組和PTH1之間沒(méi)有差異。PTH5和PTH5-W增加的孔多于卵巢切除對(duì)照組中的孔。兔的研究數(shù)據(jù)提示了這一假設(shè)孔隙度的增加、伴有皮質(zhì)骨增加，可能是一種結(jié)構(gòu)反應(yīng)以保持用rhPTH(1-34)治療的骨的生物力學(xué)性能。18個(gè)月時(shí)，卵巢切除組和其它組之間在骨形成周期、類骨質(zhì)、壁寬度或類骨質(zhì)成熟方面沒(méi)有差異。
概括而言，卵巢切除組和任一劑量的rhPTH(1-34)組之間，其轉(zhuǎn)換率沒(méi)有差異。假性對(duì)照組的轉(zhuǎn)換率較卵巢切除對(duì)照組或用rhPTH(1-34)治療的動(dòng)物低。當(dāng)停用rhPTH(1-34)6個(gè)月時(shí)，轉(zhuǎn)換率顯著下降，但BMD和生物力學(xué)強(qiáng)度測(cè)定值仍然高于卵巢切除對(duì)照組。所有組皮質(zhì)內(nèi)的類骨質(zhì)寬度和成熟時(shí)間的正常值表明治療沒(méi)有對(duì)正常的礦化過(guò)程的時(shí)間帶來(lái)任何缺點(diǎn)。壁寬度的正常值表明在單個(gè)BMU水平方面，治療沒(méi)有改變吸收與形成之間的正常平衡。
表11 肱骨皮質(zhì)骨測(cè)定的組織形態(tài)測(cè)定的可變量


a命名原則是1987的骨和礦物質(zhì)研究雜志推薦的。
表12 18個(gè)月卵巢切除的靈長(zhǎng)目肱骨中段皮質(zhì)組織形態(tài)測(cè)定(n＝121)

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個(gè)月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個(gè)月后再停止治療；PTH5＝使用18個(gè)月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個(gè)月后再停止治療。
a與OVX對(duì)照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。
b參見表4.2有關(guān)可變量的說(shuō)明。
c數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
通過(guò)組織形態(tài)測(cè)定和極化傅里葉變換紅外線顯微術(shù)的分析揭示了用PTH治療可用幼小骨(分級(jí)微晶物的范圍，傾向于較小的)代替老化骨(大的微晶物)而改善骨質(zhì)量。而且，對(duì)用小劑量的猴停用PTH時(shí)的其它好處是基質(zhì)已最佳礦化且有微晶物成熟。組織形態(tài)測(cè)定和極化傅里葉變換紅外線顯微術(shù)的數(shù)據(jù)表明，由于最佳礦化產(chǎn)生礦物質(zhì)相成熟，對(duì)改善質(zhì)骨的骨質(zhì)量是非常有利的。3D有限單元造型研究L-5的中間500μm切片的實(shí)驗(yàn)表明，與卵巢切除組相比，PTH的BMD增加21％是由于BMC增加了27％而截面積沒(méi)有改變。與卵巢切除組相比，對(duì)PTH組的椎體的分析顯示BV/TV增加了73％，這是由于Tb.Th增加了30％和Tb.N增大了37％。這一區(qū)域的連接性分析顯示PTH脊椎的節(jié)密度(節(jié)/組織體積)升高了140％、節(jié)-節(jié)柱(struts)增加了286％。
PTH的骨三維象素密度的直方圖分析表明，與卵巢切除組相比，低密度(0-355mg/cc)的比例減少、中密度(356-880mg/cc)的比例增加、對(duì)高密度三維象素(887-1200mg/cc)幾乎無(wú)作用。最驚人的是停止治療6個(gè)月后皮質(zhì)骨腔隙中較大骨的三維象素密度的改變(圖8)。
計(jì)算落在BMD值的某范圍內(nèi)的脊椎骨單元(三維象素)的比例。所選擇的BMD范圍如下低BMD，0-300mg/cc；中BMD，300-700mg/cc；高BMD，700-1000mg/cc；和皮質(zhì)BMD，＞1000mg/cc(表13)。與卵巢對(duì)照組相比，用PTH治療明顯降低了低BMD骨的體積并增加了中BMD骨的體積。停用PTH后，中BMD骨降低而高BMD骨升高，表明中等BMD骨變得更加致密。
表13 根據(jù)BMD值分組的L5腰椎體積的百分比(平均值±SEM)

表14 中等水平的L5腰椎的BMC和脊椎的有效應(yīng)變

*統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(經(jīng)Fisher’s PLSD檢驗(yàn)p＜0.05)圖8概括的數(shù)據(jù)顯示用PTH治療18個(gè)月，獼猴的L-5腰椎在骨質(zhì)、小梁厚度和小梁連接性方面顯著增加，對(duì)脊椎的外部大小(X面積)有決定性的作用。對(duì)L-5骨單元分布的分析表明，重度礦化骨的一些區(qū)域變化最少、沒(méi)有產(chǎn)生骨硬化。相反，多孔的小梁骨對(duì)PTH的反應(yīng)最強(qiáng)。BMD的變化導(dǎo)致軸向應(yīng)變明顯降低，力學(xué)性能改善。如PTH和卵巢切除術(shù)的BMD的直方圖中清楚地顯示，PTH將低密度骨的三維象素轉(zhuǎn)化為中密度三維象素、對(duì)高密度三維象素沒(méi)有顯著作用。
表2概括的數(shù)據(jù)顯示通過(guò)PTH治療顯著增加了脊椎中段的BMC、而停藥6個(gè)月后仍然存在PTH的有效作用。通過(guò)PTH治療減少了36％脊椎的平均力學(xué)應(yīng)變，而停用PTH后保留了23％、低于OVX。這些研究提示停用PTH治療后6個(gè)月沒(méi)有導(dǎo)致新形成骨的吸收，但取而代之的是中密度骨有效地重新分布成低和高密度骨。這種再分布導(dǎo)致脊椎的應(yīng)變連續(xù)降低、因而改善了力學(xué)功能。討論對(duì)靈長(zhǎng)目的這種研究表明，在不用其它可能對(duì)骨有影響的藥物時(shí)，PTH有益于增強(qiáng)皮質(zhì)骨和小梁骨全部骨骼的骨質(zhì)。而且，停用PTH時(shí)不會(huì)明顯失去由PTH治療至少2個(gè)重建周期的療效。
替代標(biāo)記已用在其它試驗(yàn)中表明骨的活性，并假定此值的變化反映出骨質(zhì)的改變。雖然有公開的人和靈長(zhǎng)目的數(shù)據(jù)證明了形成和吸收標(biāo)記增加，但與骨轉(zhuǎn)換的激活一致(例如在絕經(jīng)早期或疾病活動(dòng)期)，高度轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是骨質(zhì)丟失的表征。對(duì)青春期人骨骼成熟過(guò)程的高度轉(zhuǎn)換還沒(méi)有進(jìn)行很好的研究，但骨丟失的合成代謝增加。根據(jù)當(dāng)前技術(shù)，在骨質(zhì)疏松的藥物治療中這種現(xiàn)象完全是意外的。因此，如本研究的數(shù)據(jù)所示，骨轉(zhuǎn)換標(biāo)記的增加與已知的PTH對(duì)增加骨質(zhì)和強(qiáng)度的合成代謝作用不一致。
從對(duì)獼猴的18個(gè)月冶療研究的數(shù)據(jù)證實(shí)了下列意外的發(fā)現(xiàn)·總的骨骼質(zhì)量全面顯著增加·股骨頸的骨質(zhì)和強(qiáng)度顯著增加。
·沒(méi)有出現(xiàn)“竊”皮質(zhì)骨以增加小梁骨。在富有皮質(zhì)骨(股骨頸)或小梁骨(腰椎)的部位骨質(zhì)和強(qiáng)度的增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。在純皮質(zhì)骨部位(股骨體中段)，與卵巢切除對(duì)照組相比，PTH傾向于穩(wěn)定或稍微增加骨質(zhì)和強(qiáng)度。
·卵巢切除的猴(和人)的骨標(biāo)記的改變并不反映出PTH對(duì)骨骼的合成代謝作用有益。本研究中使用靈長(zhǎng)目的體液可以開發(fā)新的和更有效的替代品標(biāo)記。
·停止治療后骨質(zhì)和強(qiáng)度的增加保持至少2個(gè)重建循環(huán)。
這種PTH的靈長(zhǎng)目研究不同于已公布的有關(guān)對(duì)恒河猴和獼猴的研究，它們采用了可提供適當(dāng)統(tǒng)計(jì)能力的大量樣品以檢測(cè)在前面少量研究中可能出現(xiàn)的不明顯的差異；對(duì)照組包括卵巢切除靈長(zhǎng)目(用于公開研究中)和假性手術(shù)組兩種，但都是整體的靈長(zhǎng)目。在此類型的研究中以前沒(méi)有報(bào)導(dǎo)過(guò)后一個(gè)對(duì)照組，因此與卵巢切除動(dòng)物的值比較，對(duì)PTH的某些效果，以及假性對(duì)照組水平的一些測(cè)定值的恢復(fù)是第一次進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)論對(duì)野生的卵巢切除的已發(fā)育獼猴Macaca fascicularis的18個(gè)月研究確定了用rhPTH(1-34)治療12個(gè)月再停止治療6個(gè)月、或用rhPTH(1-34)治療18個(gè)月的骨中的效果和安全性。rhPTH(1-34)顯著增加了上面卵巢切除對(duì)照組脊柱和股骨頸的骨質(zhì)和強(qiáng)度，其增加程度等于或大于假性對(duì)照組。在用rhPTH(1-34)治療的卵巢切除的猴中，鈣的體內(nèi)自身平衡(血清鈣、磷酸鹽和1，25-二羥基維生素D)的測(cè)定值恢復(fù)到假性對(duì)照組的水平。用于評(píng)價(jià)骨轉(zhuǎn)換的血清、尿和組織形態(tài)測(cè)定顯示rhPTH(1-34)保持的形成率等于或大于卵巢切除對(duì)照組的形成率，而骨吸收的生物化學(xué)標(biāo)記仍然與假性對(duì)照組的等同。在所有用rhPTH(1-34)治療達(dá)18個(gè)月的動(dòng)物中，藥物動(dòng)力學(xué)測(cè)定值不隨時(shí)間而改變，沒(méi)有出現(xiàn)rhPTH(1-34)蓄積。治療18個(gè)月后沒(méi)有出現(xiàn)持續(xù)的高血鈣或腎病理改變的跡象。礦化或重建期沒(méi)有變化。用rhPTH(1-34)所觀察到的骨骼的骨礦物質(zhì)含量的凈增加可從增加了骨形成率和骨形成表面而對(duì)骨吸收作用極小或無(wú)作用得到解釋。在諸如脊柱、股骨頸和近端脛骨的臨床相關(guān)部位，骨礦物質(zhì)含量、骨礦物質(zhì)密度和強(qiáng)度的生物力學(xué)測(cè)定值，包括韌性和勁度在內(nèi)均顯著增加。
rhPTH(1-34)增加肱骨體中段和橈骨體中段的皮質(zhì)骨的轉(zhuǎn)換率，但與卵巢切除或假性對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯改變骨質(zhì)或強(qiáng)度的生物力學(xué)測(cè)定值。然而，皮質(zhì)寬度和/或皮質(zhì)骨面積的增加與截面慣性矩、強(qiáng)度和勁度的測(cè)定值是一致的。rhPTH(1-34)對(duì)皮質(zhì)骨的固有物質(zhì)性能沒(méi)有顯著影響。由于刺激了皮質(zhì)內(nèi)的骨形成，因此皮質(zhì)寬度和皮質(zhì)內(nèi)的孔增加了。似乎孔的這些改變是由于保持了骨的彈性。
這些猴中，用rhPTH(1-34)治療12個(gè)月后再停藥6個(gè)月，脊柱和股骨頸的骨質(zhì)和強(qiáng)度出現(xiàn)較小但仍然顯著的增加。停藥后，對(duì)肱骨體中段和橈骨體中段的皮質(zhì)骨沒(méi)有顯著影響。骨標(biāo)記和組織形態(tài)測(cè)定顯示傾向于回到假性對(duì)照組所測(cè)得的低轉(zhuǎn)換值。
嚙齒動(dòng)物的體內(nèi)力學(xué)研究表明與rhPTH(1-34)的合成代謝結(jié)果相關(guān)的基因在1-6小時(shí)內(nèi)被增量調(diào)節(jié)，在首次劑量后的24小時(shí)內(nèi)、在未出現(xiàn)可檢測(cè)的吸收作用的情況下，可以檢測(cè)到骨形成表面的增加。rhPTH(1-34)似乎可補(bǔ)充S相的前期骨源(osteoprogenitor)、并刺激它們分化為成骨細(xì)胞，由此快速增加骨形成表面的百分率。可以在1小時(shí)期間內(nèi)注射一次或多次rhPTH(1-34)，以誘導(dǎo)骨的合成代謝作用。但是，當(dāng)給年幼大鼠在6小時(shí)或8小時(shí)內(nèi)多次注射相同劑量時(shí)，合成代謝作用消失了，這說(shuō)明rhPTH(1-34)的簡(jiǎn)單、有限的暴露對(duì)于誘導(dǎo)合成代謝作用是需要的。
概括而言，rhPTH(1-34)是促進(jìn)猴和兔的骨合成代謝的，通過(guò)選擇性刺激骨形成，增加諸如腰棘和股骨頸的臨床相關(guān)部位的骨質(zhì)和生物力學(xué)強(qiáng)度。在皮質(zhì)部位通過(guò)組織形態(tài)測(cè)定檢測(cè)的骨轉(zhuǎn)換、皮質(zhì)內(nèi)表面形成和孔的增加不會(huì)改變骨質(zhì)或改變骨強(qiáng)度的生物力學(xué)測(cè)定值，但可通過(guò)增加皮質(zhì)骨面積和/或?qū)挾榷黾咏孛鎽T性矩。
這些研究證實(shí)了使用甲狀旁腺素受體激活劑例如重組的人PTH(1-34)可提高治療期間和治療后的骨質(zhì)量。事實(shí)上，用18個(gè)月PTH 1次/天，或同樣劑量使用12個(gè)月，然后停藥6個(gè)月，通過(guò)組織形態(tài)測(cè)定法和極化傅里葉變換紅外線(FTIR)顯微術(shù)分析，肱骨皮質(zhì)骨的質(zhì)量明顯提高。這一分析揭示了服用PTH通過(guò)用幼小骨(分級(jí)微晶物的范圍，傾向于較小者)代替老化骨(大的微晶物)而改善骨質(zhì)量。因此，PTH提高皮質(zhì)骨質(zhì)量、改善礦化、以及加速礦化和加速新骨代替老化骨。
而且，對(duì)使用低劑量PTH的猴停用后，出現(xiàn)其它有益效果，如骨質(zhì)發(fā)生最佳礦化和微晶物成熟。即在停止治療期間，低劑量PTH可通過(guò)增強(qiáng)礦化而產(chǎn)生其它有益效果。這些數(shù)據(jù)表明用PTH治療后再停藥一段時(shí)間這一限制性方案的好處是達(dá)到高的效果。骨質(zhì)量的當(dāng)前定義不包括增強(qiáng)礦化的這些方面。
在早期研究中PTH治療期后再接著一個(gè)非治療期，該治療期少于1個(gè)月。以前還沒(méi)有對(duì)18-24個(gè)月長(zhǎng)期的但有限的治療期后再接著至少2個(gè)重建循環(huán)期進(jìn)行探究。停止治療后靈長(zhǎng)目的持續(xù)療效與用PTH治療的嚙齒動(dòng)物的結(jié)果形成鮮明對(duì)照。對(duì)大鼠的研究同樣顯示停止治療后骨質(zhì)迅速丟失。見Gunness-Hey，M.Hock，J.M。(1989)《骨》10447-452；Shen，V等(1993)《臨床調(diào)查研究雜志》912479-2487；Shen，V等(1992)Calcif.TissueInt.50214-220；和Mosekilde，L等(1997)《骨》20429-437。
這種方法增強(qiáng)骨礦化以前沒(méi)有觀察到，是出乎意外的，由此開發(fā)出了一種用PTH增加骨強(qiáng)度和韌性且預(yù)防骨折的新方法。這種新方法包括增強(qiáng)和調(diào)節(jié)礦化以提供更有韌性、更強(qiáng)勁、更能抗骨折的骨。這些有益效果不止需要新基質(zhì)形成。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明PTH對(duì)固定骨或骨骼的患者、或?qū)θ狈ΦV物質(zhì)的骨骼有好的療效，但還需適當(dāng)補(bǔ)充鈣和維生素D。
實(shí)施例3 人服用rhPTH(1-34)后增強(qiáng)骨的強(qiáng)度和密度并減少骨折患者數(shù)rhPTH(1-34)登記1093，完成848。
安慰劑登記544，完成447。
診斷和列入標(biāo)準(zhǔn)30-85歲的婦女、絕經(jīng)后最少5年、最少有一處中度脊椎骨折或兩處輕度不致外傷的脊椎骨折。
劑量和用法試驗(yàn)品(不診斷的)rhPTH(1-34)20μg/天，皮下給藥rhPTH(1-34)40μg/天，皮下給藥參考治療(不診斷的)注射用的安慰研究物質(zhì)治療持續(xù)時(shí)間rhPTH(1-34)17-23個(gè)月(除6個(gè)月試治療期)安慰劑17-23個(gè)月(除6個(gè)月試治療期)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)脊柱X線；血清生物指標(biāo)(鈣、骨-特異堿性磷酸酶、前膠原I羧基末端前肽)；尿指標(biāo)(鈣、N-端肽、游離脫氧吡啶啉)；1，25-二羥基維生素D；骨礦物質(zhì)密度脊柱、髖關(guān)節(jié)、腕和全身；高度；人群藥物動(dòng)力學(xué)；骨活檢(選擇的研究部位)。
患者特征


結(jié)果本臨床試驗(yàn)包括共1637名婦女，用重組人甲狀旁腺素(1-34)治療，0、20或40μg rhPTH(1-34)/kg/天，并補(bǔ)充維生素D和鈣，總共治療18-24個(gè)月結(jié)果如表15-19所示。
表15舉例說(shuō)明的數(shù)據(jù)表明用PTH治療降低了脊椎骨折的數(shù)量和嚴(yán)重性。將所有用PTH治療的患者與安慰劑組患者進(jìn)行比較，脊椎骨折的患者數(shù)減少了67％(p＜0.01)，與安慰劑組相比，20μg PTH/天組減少了65％(p＜0.001)，與安慰劑組相比，40μg PTH/天組減少了69％(表15)。將所有用PTH治療的患者與安慰劑組患者進(jìn)行比較，多發(fā)性脊椎骨折的患者數(shù)減少了81％(p＜0.001)；與安慰劑組相比，20μg PTH/天組減少了77％(p＜0.001)；以及與安慰劑組相比，40μg PTH/天組減少了86％。將所有用PTH治療的患者與安慰劑組患者進(jìn)行比較，中度至重度脊椎骨折的患者數(shù)減少了84％(p＜0.001)；與安慰劑組相比，20μg PTH/天組減少了90％(p＜0.001)；以及與安慰劑組相比，40μg PTH/天組減少了78％(表15)。
表15. 用PTH治療對(duì)脊椎骨折的數(shù)量和嚴(yán)重性的影響

*N＝基線和終點(diǎn)x射線的患者數(shù)**中度骨折導(dǎo)致脊椎高度下降超過(guò)25％(或等同測(cè)定)。重度骨折導(dǎo)致脊椎高度下降超過(guò)40％(或等同測(cè)定)。骨折如Genant等(1993)“采用半定量技術(shù)的脊椎骨折評(píng)定”；《骨和礦物質(zhì)研究雜志》81137-1148所定義。
表16舉例說(shuō)明了用PTH治療對(duì)全身各種非脊椎骨骨折的數(shù)量的影響。在髖關(guān)節(jié)、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳、骨盆、以及其它部位每一處的骨折數(shù)顯著下降(表16)。與安慰劑治療的患者相比、觀察到用PTH治療的患者的骨折總數(shù)減少，這種減少在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。與安慰劑治療的患者相比，用PTH治療的患者的髖關(guān)節(jié)、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳和骨盆的骨折總數(shù)減少時(shí)，這種減少更顯著(表16)。
表16. 用PTH治療對(duì)非脊椎骨折的數(shù)量的影響

*安慰劑(pbo)通過(guò)雙能量吸光測(cè)定法(DEXA)測(cè)定PTH對(duì)骨礦物質(zhì)含量(BMC)、骨礦物質(zhì)密度(BMD)和骨面積的影響，結(jié)果如表17-19所報(bào)告。使用PTH明顯增加了患者的腰棘、股骨和髖關(guān)節(jié)、腕、以及患者全身的MBC(表17)。通過(guò)PTH治療顯著增加了患者的腰棘、股骨和髖關(guān)節(jié)的MBD(表18)。腰棘、股骨和髖關(guān)節(jié)中的增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，p＜0.001(表18)。通過(guò)用PTH治療患者的腰棘、股骨和髖關(guān)節(jié)的骨面積顯著增加了(表18)。腰棘和髖關(guān)節(jié)頸中的增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(表19)。
PTH對(duì)全身骨的數(shù)量和質(zhì)量、BMC的測(cè)定的作用尤其重要。這種全身作用表明患者身體的骨質(zhì)的量在增加。PTH不僅僅使骨質(zhì)從患者身體的一個(gè)部分移動(dòng)到另一部分。而且，用PTH治療可增加患者身體中骨質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量。
圖9和10舉例說(shuō)明了對(duì)于PTH治療組和安慰劑對(duì)照組的患者，腰棘BMD和股骨/髖關(guān)節(jié)頸BMD長(zhǎng)時(shí)間增加?；颊叩难珺MD平穩(wěn)地增加至少約18個(gè)月，隨后的幾個(gè)月里無(wú)顯著性增加或增加很少?；颊叩墓晒?髖關(guān)節(jié)BMD顯著增加至少18個(gè)月，且PTH再治療期間可以進(jìn)一步增加。
表17. PTH對(duì)骨礦物質(zhì)含量的影響，以基線的端點(diǎn)％改變(SD)表示

表18. PTH對(duì)骨礦物質(zhì)密度的影響，以基線的端點(diǎn)％改變(SD)表示

表19. PTH對(duì)骨面積的影響，以基線的端點(diǎn)％改變(SD)表示

概括而言，上述數(shù)據(jù)表明用PTH治療的患者骨折減少了。特別是，用PTH治療使66％以上先前患有脊椎骨折的患者不再患新的脊椎骨折。用PTH治療也使78％以上先前患有脊椎骨折的患者不再患新的多發(fā)性脊椎骨折。另外，PTH降低了脊椎骨折的嚴(yán)重性，顯著減少了78％患者患中度或重度骨折。接受PTH治療的患者得到的益處是患所有非脊椎骨折(包括髖關(guān)節(jié)、橈骨、腕、骨盆、腳、肱骨、肋骨或踝的骨折)者顯著減少，其顯著性水平為p＜0.007。骨質(zhì)量也增加了。先前患有骨折的患者的療效為髖關(guān)節(jié)、脊柱和全身的骨礦物質(zhì)含量顯著增加。這些增加表明這些部位的骨折減少早在治療后12個(gè)月就可出現(xiàn)。結(jié)論骨折的這些數(shù)據(jù)是用PTH而減少人骨折的第一數(shù)據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度提高了，正如上面所報(bào)道的臨床前數(shù)據(jù)。這些結(jié)果也顯示了對(duì)非脊椎部位的骨質(zhì)量和強(qiáng)度療效。在臨床或臨床前的研究中，以前沒(méi)有觀察到治療18-23個(gè)月期間持續(xù)的骨折數(shù)減少。
PTH是否單獨(dú)增強(qiáng)骨的韌性和強(qiáng)度以提高抗骨折性這一問(wèn)題以前在人體中沒(méi)有試驗(yàn)過(guò)。公開的文獻(xiàn)一直建議PTH必須與抗吸收劑或雌激素聯(lián)合用藥。以前報(bào)道的臨床試驗(yàn)包括的患者人數(shù)太少、無(wú)法確定骨折顯著減少。在一項(xiàng)研究中，由于沒(méi)有安慰劑對(duì)照，因而無(wú)法單獨(dú)評(píng)定PTH的療效。在第二次研究中，采用普遍接受的骨折定義，沒(méi)有觀察到骨折減少。
一般認(rèn)為，PTH對(duì)結(jié)合的非脊椎部位有相反的作用，在這些部位發(fā)現(xiàn)骨折減少尤其意外。常見的教條認(rèn)為PTH會(huì)增加皮質(zhì)孔、由此而削弱骨，特別是在治療早期。而且，這種理論斷言皮質(zhì)骨部位有骨折的高度危險(xiǎn)、而PTH對(duì)減少非脊椎部位的骨折毫無(wú)益處。該理論還認(rèn)為單獨(dú)PTH不可能有效、需要同時(shí)采用抗吸收治療以阻斷對(duì)皮質(zhì)骨的負(fù)作用。本發(fā)明的數(shù)據(jù)證實(shí)了PTH給接受維生素D和鈣補(bǔ)充治療的患者服用后具有以前未觀察到的有益效果。意外地發(fā)現(xiàn)，PTH使骨強(qiáng)度增加從而減少了有脊柱多發(fā)性骨折危險(xiǎn)、有附加的非脊椎骨折的危險(xiǎn)、有中度或重度附加的脊柱骨折危險(xiǎn)等等的患者發(fā)生新骨折的次數(shù)。
對(duì)絕經(jīng)后婦女的臨床研究顯示了用低劑量(20μg/天)治療患者所產(chǎn)生的特殊效果，由于減少了PTH劑量(高劑量時(shí)，一些患者出現(xiàn)副作用)、但保留了預(yù)防骨折和減少骨折的效果，這與高劑量(40μg/天)時(shí)的效果類似。FT-IR猴的數(shù)據(jù)提供了一種可能(但不局限)的力學(xué)解釋。對(duì)猴的研究表明低劑量PTH增加了結(jié)晶形成并加速了皮質(zhì)骨的礦化。另外，使用低劑量的猴由于PTH增加了骨的礦物質(zhì)含量，停藥后出現(xiàn)另外的有益效果。本發(fā)明的數(shù)據(jù)證實(shí)了新的發(fā)現(xiàn)，即對(duì)接受維生素D和鈣補(bǔ)充治療的患者給予低劑量PTH，可有效預(yù)防脊椎骨折和非脊椎骨折。與普遍的認(rèn)為相反，PTH由于提高礦化和骨的礦物質(zhì)含量、在非脊椎部位明顯增加骨強(qiáng)度從而預(yù)防新的骨折或降低骨折的嚴(yán)重性。
以上參考各種特定和優(yōu)選的實(shí)施方式和技術(shù)對(duì)本發(fā)明已進(jìn)行了描述。但是，應(yīng)知道在不超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍的同時(shí)，可以進(jìn)行許多變化和改進(jìn)。本說(shuō)明書中的所有出版物和專利申請(qǐng)代表本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的普通技術(shù)的水平。
權(quán)利要求
1.一種使需要治療的患者增加潛在損傷部位或?qū)嶋H損傷部位的骨韌性或勁度的方法，包括給該患者服用有效量的甲狀旁腺素。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中損傷是一種潛在的損傷，包括骨折、外科手術(shù)或矯形外科的方法所致的損傷，該方法包括對(duì)異常低的骨質(zhì)部位或差的骨結(jié)構(gòu)部位的骨所施行的手術(shù)。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中外科手術(shù)是指關(guān)節(jié)復(fù)位、脊柱固定、或者它們的組合。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中關(guān)節(jié)復(fù)位包括髖關(guān)節(jié)復(fù)位。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者它們的組合。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關(guān)節(jié)骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中損傷是指潛在的損傷，它包括與甲狀旁腺機(jī)能減退或進(jìn)行性脊柱后突相關(guān)的損傷。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中損傷是指包括骨折在內(nèi)的實(shí)際損傷。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者兩者的組合。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關(guān)節(jié)骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中骨包括固定的骨或骨骼、礦物質(zhì)缺乏的骨或骨骼、或者它們的組合。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中骨包括皮質(zhì)骨、網(wǎng)狀骨質(zhì)骨、小梁骨、或它們的組合。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中骨包括附著韌帶、腱、肌肉、或其組合的部位。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中損傷部位是指髖關(guān)節(jié)、脊柱、或它們的組合。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中損傷部位包括股骨頸、股骨轉(zhuǎn)子、髂骨、或其組合。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中損傷部位包括髂骨的網(wǎng)狀骨質(zhì)骨。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中損傷部位包括中段胸椎、上腰椎、或其組合。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中患者是指患有骨質(zhì)疏松的婦女。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中患者是指絕經(jīng)后婦女。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中婦女是指不依賴于激素替代療法或抗吸收劑的婦女。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中患者是指骨質(zhì)疏松早期或骨質(zhì)疏松進(jìn)行期的婦女。
22.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加韌性和勁度。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括降低骨折的危險(xiǎn)和可能性。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加皮質(zhì)骨和小梁骨的活化頻率或骨形成率。
25.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加骨礦物質(zhì)含量、增加骨礦物質(zhì)密度、增加小梁數(shù)、增加小梁厚度、減少骨髓空間、增加小梁連接性、增加連接性、增加抗負(fù)荷強(qiáng)度、增加骨膜的和骨內(nèi)膜的骨形成、增加皮質(zhì)的多孔性、增加橫斷面的骨面積和骨質(zhì)、增加斷裂功、減少?gòu)椥阅Ａ?、或者上述的組合。
26.權(quán)利要求1所述的方法，其中給藥包括皮下給藥。
27.權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素是周期性給藥或間歇給藥。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中周期性給藥包括至少用2個(gè)重建周期的甲狀旁腺素并停止使用甲狀旁腺素至少1個(gè)重建周期。
29.權(quán)利要求27所述的方法，其中周期性給藥包括至少用約12-24個(gè)月的甲狀旁腺素并停止使用甲狀旁腺素至少6個(gè)月。
30.權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素是一種選自由PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)組成的組的片段激素。
31.權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素為人的PTH(1-34)。
32.權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素為人的PTH(1-84)。
33.權(quán)利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素給藥劑量是至少約5μg/kg/天。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中該劑量為約10μg/kg/天-約40μg/kg/天。
35.權(quán)利要求1所述的方法，它還包括服用鈣、維生素D、或其組合。
36.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加中密度骨的骨礦物質(zhì)含量。
37.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加低和高密度骨的骨礦物質(zhì)含量、并降低中密度骨的骨礦物質(zhì)含量。
38.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加中密度骨的骨礦物質(zhì)含量，然后增加低和高密度骨的骨礦物質(zhì)含量、并降低中密度骨的骨礦物質(zhì)含量。
39.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括減小骨中的微晶物的大小。
40.權(quán)利要求39所述的方法，它還包括使骨中的微晶物成熟。
41.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加骨的礦化。
42.權(quán)利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括減少骨折的發(fā)生。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中增加韌性或勁度包括減少脊椎骨折的發(fā)生、減少重度骨折的發(fā)生、減少中度骨折的發(fā)生、減少非脊椎骨折的發(fā)生、減少多發(fā)骨折的發(fā)生、或其組合。
44.一種對(duì)需要治療的患者減少骨折危險(xiǎn)性的方法，包括給予該患者服用有效量的甲狀旁腺素。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中骨包括髖關(guān)節(jié)、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳、骨盆、脊柱或其組合。
46.權(quán)利要求44所述的方法，其中甲狀旁腺素是一種選自由PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)組成的組的片段激素。
47.權(quán)利要求44所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者它們的組合。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關(guān)節(jié)骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
49.一種制備用于增加潛在或?qū)嶋H損傷部位的骨的韌性或勁度的藥劑的方法，包括將甲狀旁腺素與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。
50.權(quán)利要求49所述的方法，其中藥劑包括甲狀旁腺素的穩(wěn)定制劑。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中穩(wěn)定制劑包括治療有效量的甲狀旁腺素；多羥基化合物，例如甘露糖醇或丙二醇；適用于保持組合物的pH在約3-7的范圍內(nèi)的緩沖劑，例如醋酸鹽或酒石酸鹽原料；以及水。
52.甲狀旁腺素在制備用于減少需要治療的患者的骨折危險(xiǎn)性的藥劑中的應(yīng)用。
53.權(quán)利要求52所述的方法，其中骨包括髖關(guān)節(jié)、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳、骨盆、脊柱或其組合。
54.權(quán)利要求52所述的方法，其中甲狀旁腺素是一種選自由PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)組成的組的片段激素。
55.權(quán)利要求52所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者它們的組合。
56.權(quán)利要求55所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關(guān)節(jié)骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
57.甲狀旁腺素用于制備減少需要治療的患者的骨折危險(xiǎn)性的組合物中的應(yīng)用。
58.甲狀旁腺素在制備用于增加潛在或?qū)嶋H損傷部位的骨的韌性或勁度的藥劑中的應(yīng)用。
59.甲狀旁腺素用于制備增加潛在或?qū)嶋H損傷部位的骨的韌性或勁度的組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用甲狀旁腺素而增加骨的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折的可能性和/或嚴(yán)重性的方法。該方法可用于增加潛在的或?qū)嶋H的損傷部位的骨的韌性或勁度,該損傷部位例如有骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)性或患有骨質(zhì)疏松的人的髖關(guān)節(jié)或脊柱。本發(fā)明的方法可減少脊椎骨折的發(fā)生、減少多發(fā)性脊椎骨折的發(fā)生、減少脊椎骨折的嚴(yán)重性、和/或減少非脊椎骨折的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1308545SQ9980835
公開日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月19日
發(fā)明者珍妮特·M·霍克 申請(qǐng)人:伊萊利利公司