專利名稱：減少紫外線誘導的人皮膚中膠原合成抑制的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及人皮膚的光保護領域。更具體地，本發(fā)明涉及用于以下用途的組合物和方法，即通過局部涂用來減少(如果不是消除的話)在偶然和/或直接暴露于紫外線輻射之后人皮膚中膠原合成的抑制。這種抑制作用可能每天發(fā)生，而且在有計劃和長期在太陽下消遣性地暴露于紫外線輻射之后也會發(fā)生。
2．現(xiàn)有技術狀況人皮膚是一種復雜的器官，它延伸覆蓋整個身體。在身體的不同部位有不同類型的皮膚，例如面部皮膚與頭皮皮膚是不同的，而且甚至手心的皮膚和手背的皮膚也是不同的。盡管在一個人的身體上皮膚的類型可不同，然而皮膚通常由2層主要組織構成。表皮層，即最外面的一層，由數(shù)層構成。真皮(英文為dermis,corium或cutis vera)是由上面的乳頭層和下面的網狀層構成的。
隨著哺乳動物的進化，人基本上是無毛發(fā)的，即人體的大部分皮膚不受毛發(fā)干擾而可看見。因此，皮膚是暴露于環(huán)境對人體的各種危害(天然的和人工的)。因為最早知道太陽光會造成紅斑，人們已經采取措施來避免太陽光的“有害射線”。與光老化的皮膚相比，時間性老化或固有性老化的皮膚(老皮膚)生理學之間是有差異的。老皮膚通常維持光滑和無疵的外表，這不同于光老化皮膚的皮革化、有斑點并且通常有細而深的皺紋。老皮膚的表皮通常比正常的更薄，而光老化皮膚的表皮通常比正常的更厚(棘皮)并且隨著時間會萎縮。還可參見N.A.Fenske和C.W.Lober,"Structural and functional changes of normal aging skin",J.Am.Acad.Dermatol.,15:571-585(1986)。
光老化是一個目前用于描述因重復暴露于陽光而導致人皮膚外觀和/或功能的變化，尤其是關系到皺紋以及認為與暴露于陽光有關的其他外觀變化的術語。陽光的紫外線(UV)成分，尤其是UVA和UVB，通常據(jù)信是光老化的主要導致因素。造成“光老化”所需的UV暴露程度目前還不知道，但是對于某給定的UV光源而言，足以引起人皮膚紅斑(發(fā)紅，通常視為曬斑)所需的量被經驗性地定量為“最小紅斑劑量”(“MED”)。然而，反復暴露于可造成紅斑和曬黑水平的陽光UV，通常與光老化相關。
到達地球表面、影響并使各種動物(包括人)賴以生存的太陽輻射，包括紫外線(UV)(λ＜400nm)、可見光(400nm＜λ＜700nm)和紅外線(IR)(λ＞700nm)。UV輻射通常分為UVA(320-400nm)、UVB(290-320nm)和UVC(＜290nm)；UVC輻射被平流層中的臭氧阻擋因而不能到達地球表面。UVB劑量在30-50mJ/cm2皮膚范圍內時，會在大多數(shù)皮膚好的人中引起紅斑。當太陽基本上在頭頂上方時，到達地球表面的日光提供了如下輻射量0.5％UVB；6.5％UVA；38.9％可見光和54.0％IR。這些輻射類型提供了下列能量通量UVB為2.11mJ/cm2·s(21.1 W/m2)；UVA為8.57mJ/cm2·s(85.7W/m2)；可見光為53.2mJ/cm2·s(532W/m2)；和IR為72.2mJ/cm2·s(722W/m2)。
光老化的臨床特征是皮膚粗糙、起皺、混雜色素沉著、呈病黃色、松弛、毛細管擴張、著色斑、紫癜、和較容易擦傷、萎縮、脫色區(qū)域、甚至呈癌前期變化和最終惡性腫瘤。光老化一般出現(xiàn)在習慣上暴露于陽光的皮膚部位，如臉、耳、頭皮的光禿區(qū)域、頸、前臂和手上。
防曬劑(sunscreen)一般被用來預防暴露于陽光的皮膚部位產生曬斑(紅斑)。防曬劑是局部施用的制劑，它含有吸收、反射和/或散射UV光的組分。一些防曬劑是以不透明的顆粒物質如氧化鋅、氧化鈦、粘土和三氯化鐵為基礎的。由于這些制劑是可見的并且會堵塞毛孔，因此許多人認為這些不透明制劑作為化妝品不能接受。其他防曬劑含化學物質，如對氨基苯甲酸(PABA)、羥苯甲酮(oxybenzone)、二羥苯甲酮、甲氧基肉桂酸乙基己酯、奧克立林(octocrylene)、甲氧基肉桂酸辛酯和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷，它們在皮膚上是透明或半透明的。盡管這些類型的防曬劑作為化妝品更易接受，但是它們的使用期仍然較短，并且容易因洗滌或出汗而被除去。
如上所述，通?？山邮艿钠つw光損傷病因涉及暴露于足以引起紅斑的日光照射(曬斑或變紅；精確地說皮膚潮紅)，現(xiàn)在已經知道，足量的UVB輻射的確會引起紅斑。該原理指導了目前用于抑制光老化的組合物和方法都包括采用能阻擋或吸收UVB的化合物，而且這種組合物只需要用于日光照射非?？赡軐е录t斑的場合。更近期的防曬劑組合物包括同時阻擋UVA和UVB輻射的化合物的組合。
根據(jù)L.A.Goldsmith等人編輯的《皮膚生理學、生物化學和分子生物學》第2版(New York:Oxford Univ.Press,1991)，認為UVA既有致黑色素作用，又有致紅斑作用，而且UVA照射誘導培養(yǎng)的成纖維細胞中合成32kDa的應激蛋白。該文章還描述了，在UV照射后一段數(shù)小時的潛伏期后，紅斑才變得明顯可見(即，“延遲的”紅斑)；據(jù)描述，“立刻的”紅斑在UVB和UVC照射后通常并不明顯，但是在暴露于UVA之后的確以劑量依賴性方式發(fā)生。Goldsmith說，250-290納米(UVC區(qū)域)被認為是致紅斑性最強的輻射，而在290-340納米(UVB和UVA1區(qū)域)造成的紅斑低1000倍。據(jù)教導，UVB/C造成的紅斑與總輻照量(而不是輻照強度)成函數(shù)關系類維生素A(retinoid)已經用于受日光照射損傷的皮膚中延緩光老化效應。美國專利No.4.877.805描述了在光老化臨床上變得明顯后，對光老化皮膚的治療方法。該專利指出，從光老化開始出現(xiàn)后才開始應用類維生素A治療光損傷皮膚的意義不大。
另一方面，我們的專利申請(基于未審定的美國專利申請No.08/588,771(1996年1月19日提交)和臨時申請60/048,520(1997年6月4日提交)和60/057,976(1997年9月5日提交)都涉及人皮膚的光老化，(出于種種目的它們的公開內容在此引用作為參考)，描述了基質金屬蛋白酶(MMP)對皮膚的損害作用，這些酶的活性在暴露于UV輻射后會大大增加，而且光老化能夠而且應當在光老化出現(xiàn)明顯的臨床癥狀之前進行處理。這些專利申請描述了對光老化皮膚(即已經在太陽UV輻射中暴露過的皮膚，無論紅斑或其他光老化的臨床癥狀是否明顯)的處理，即局部施用MMP的抑制劑(即蛋白酶的直接抑制劑)以及影響MMP表達的轉錄因子(即AP-1的抑制劑)。
基于上述論述，值得探討的是本領域目前仍堅持“陽光(尤其是UV輻射)導致紅斑，而且紅斑的反復發(fā)作和類似地長期暴露于太陽光造成了光老化的皮膚”這一原理。這一原理根據(jù)這樣的觀察結果，即在太陽下呆的時間長的人具有看上去老化的皮膚，好象那些因時間變老的人。然而，如上所指出，當對皮膚進行組織學和類似的直接測定時，年老皮膚和光老化皮膚之間的某些生理差異是很明顯的。
可以看出，本領域把注意力集中于防止和修復長期UV照射而外觀變老的皮膚的可覺察損傷。防曬劑可防止紅斑，因而通常被認為足以起防太陽的保護作用。上述專利述說了對光損傷皮膚的處理(盡管我們的專利是通過MMP的升高來定義光損傷，而Kligman的專利通過臨床癥狀來定義光損傷)。
目前為止，本領域還沒有提及過暴露于陽光，尤其是太陽光譜中的UV部分對膠原產生有何種效應(如果有的話)。膠原是一種由重復的肽[-X-Y-Gly-]n代表的多肽，式中Gly是甘氨酸，而X和Y是其他氨基酸。約20％的其余氨基酸是等量的脯氨酸和4-羥基脯氨酸。分析羥基脯氨酸(因為羥基脯氨酸是一種少見的氨基酸)是一種分析膠原或原膠原含量的方法。膠原還含有其他少見氨基酸，例如3-羥基脯氨酸和羥基賴氨酸。已經鑒定出19種不同的膠原。Ⅰ型(85+％)和Ⅲ型(8+％)膠原是人皮膚中主要的膠原類型，以原纖維形式存在。結構上，3種膠原多肽以螺旋形式相互纏繞，形成三重螺旋膠原分子。這些分子以類似5股繩的結構包在一起，其中每個膠原分子與下一個分子錯開1/4地相互排列，形成微原纖維。隨后，微原纖維與其他微原纖維纏繞，形成原纖維。原纖維再與其他原纖維纏繞形成更大的纖維。在體內產生膠原纖維需要激活膠原生物合成途徑，通過該途徑細胞核中的轉錄促進了經mRNA的翻譯而合成多肽，諸多肽在細胞質中組成原膠原三螺旋結構，從細胞分泌出原膠原，然后是切割反應，原纖維組裝和在細胞外的交聯(lián)。與儲藏于分泌顆粒中然后在需要時從細胞中分泌出去的眾多蛋白質不同，膠原是連續(xù)分泌的。根據(jù)Goldsmith,op.cit(492頁)所述，不僅視黃酸、糖皮質激素、和維生素D3衍生物都可降低膠原合成，而且其他類維生素A也可降低膠原合成。
發(fā)明概述出乎本領域預計，我們發(fā)現(xiàn)，暴露于UV輻射(無論是否足以造成紅斑)都會導致膠原合成相當徹底的和暫時性的喪失。這種膠原合成的喪失根據(jù)我們的發(fā)現(xiàn)，即在暴露于UV輻射(無論該UV輻射是否一次輻照就足以造成紅斑)后，在成纖維細胞和皮膚其他部位中，Ⅰ型和Ⅲ型原膠原的mRNA和Ⅰ型和Ⅲ型原膠原蛋白都會下降，如果不消失的話。
基于這些發(fā)現(xiàn)，我們的發(fā)明一般可歸納為局部施用可減少因暴露于UV輻射所介導的膠原合成抑制有效量的類維生素A，即在輻照之前至少16小時將類維生素A施涂在皮膚上。
在一個實施例中，我們的發(fā)明改善了因消遣性地暴露(即長時間暴露)于至少1MED(最小紅斑劑量)UV輻射所造成的膠原合成抑制，這種劑量當一個人白天大部分時間都呆在陽光下時通常都會發(fā)生。
在另一實施例中，我們的發(fā)明改善了因偶然暴露于通常小于1MED的UV輻射所造成的膠原合成抑制，這種UV輻照量在正?；顒?如上下班或上學和放學)中每天通常都會發(fā)生。
附圖簡述

圖1A-1E顯示了染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅰ型原膠原mRNA的表達情況，作為暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖2A-2F顯示了染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅰ型原膠原蛋白的存在情況，作為暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖3是一組織圖表(histograph)，顯示了體內人皮膚中Ⅰ型原膠原蛋白的Western分析結果，作為暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖4A-4E顯示了染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅲ型原膠原mRNA的表達情況，作為暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖5A-5F顯示了染色的人皮膚活檢組織剖面Ⅲ型原膠原蛋白的存在情況，作為暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖6是一組織圖表，顯示了體內人皮膚Ⅲ型原膠原蛋白的Western分析的結果，作為暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖7是一組織圖表，顯示了體內人皮膚中可溶性膠原蛋白的含量(用羥基脯氨酸測定法測定)，作為皮膚暴露于UV輻射后時間的函數(shù)。
圖8是一組織圖表，顯示了體內人皮膚中可溶性膠原蛋白的含量(用羥基脯氨酸測定法測定)，作為輻照皮膚的UV輻射量的函數(shù)。
圖9是一組織圖表，顯示了對Ⅰ型原膠原蛋白和pN前體蛋白的Western分析結果，作為輻照皮膚的UV輻射量的函數(shù)。
圖10A-10D顯示了在皮膚暴露于UV輻射之前和之后，用視黃酸或僅用載體處理并染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅰ型原膠原mRNA的表達情況。
圖11A-11D顯示了用視黃酸或僅用載體處理的皮膚暴露于UV輻射之前和之后，染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅰ型原膠原蛋白的表達情況。顯示了類維生素A對原膠原蛋白合成的保護作用。
圖12是一組織圖表，顯示了在暴露于UV輻射之前和之后，人皮膚中Ⅰ型原膠原蛋白和pN前體蛋白含量的Western分析結果，其中暴露的皮膚已先用視黃酸或僅用載體處理過。
圖13A-13D顯示了在預處理的皮膚暴露于UV輻射之前和之后，用視黃酸或僅用載體處理并染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅲ型原膠原mRNA的表達情況。
圖14A-14D顯示了在預處理的皮膚暴露于UV輻射之前和之后，僅用視黃酸或僅用載體處理并染色的人皮膚活檢組織剖面中Ⅲ型原膠原蛋白的表達情況。
圖15是一組織圖表，顯示了體內人皮膚中Ⅲ型原膠原蛋白和pN前體蛋白的Western分析結果，其中皮膚先用視黃酸或僅用載體預處理，然后暴露于UV輻射。
圖16是一組織圖表，顯示了在暴露于UV輻射之前和之后，用視黃酸或僅用載體處理的人皮膚內可溶性膠原(通過羥基脯氨酸含量測定)含量的測定結果。
圖17是一組織圖表，顯示了在輻照之前8小時用視黃酸或僅用載體預皮膚，在暴露于UV輻射之前和之后，我們對人皮膚中可溶性膠原(通過羥基脯氨酸含量測定)的分析結果。
圖18是一組織圖表，顯示了在暴露于不同劑量的紫外線后，我們對人皮膚中Ⅰ型原膠原蛋白和pN前體蛋白的分析結果，其中所用的光源與太陽光的輸出相近。
圖19是一組織圖表，顯示了我們對膠原基因表達的分析，該分析是通過報道基因測定的，即將該基因引入人皮膚成纖維細胞然后照射刺激這些細胞。
優(yōu)選例的描述對于所有意圖和目的，膠原是支持皮膚的結構性化合物。膠原前體分子是在真皮的成纖維細胞中合成的；成纖維細胞是真皮中唯一產生膠原的細胞。成纖維細胞對表皮起營養(yǎng)作用，在正常條件下，它們分泌大量的生長因子(如其中包括FGF、IGF和KGH)并產生原膠原。原膠原進入皮膚基質，成為結構性膠原。原膠原是一種由成纖維細胞分泌的可溶性膠原前體，它接著在細胞外被轉化成不溶性的膠原，即人皮膚主要的胞外結構性成分。在分泌后，原膠原蛋白的羧基端被切割，產生pN膠原前體蛋白；隨后，該前體蛋白的氨基端被切割，產生不溶性的膠原，從而摻入到胞外的皮膚基質中。盡管有多種不同的膠原以及衍生出膠原的原膠原，然而Ⅰ型和Ⅲ型占了皮膚中總膠原的絕大多數(shù)(93+％)。Ⅰ型原膠原遷移到真皮-表皮交界處，并在此被轉化成Ⅰ型膠原。Ⅲ原膠原在真皮中被轉化成Ⅲ型膠原，并隨后在整個皮膚中都存在。
我們首先發(fā)現(xiàn)，暴露于2MED UV輻射最終可消除人皮膚中的膠原合成。1MED(即最小紅斑劑量)是造成人皮膚變紅所需的最小輻射劑量。對于恒定的照明源(如UV燈泡)，一個人受照射的UV輻射量是暴露(輻照)時間的函數(shù)。在現(xiàn)實生活暴露于陽光時，1MED與一天中所處的時刻、云量、濕度、空氣質量以及其他因素有關。1MED通常相當于在晴天，太陽基本上在頭頂時，皮膚暴露于陽光中約15分鐘。
我們的研究依靠了許多自愿者(所有的人都事先告知并同意)，他們的年齡通常為20-50歲，其皮膚暴露于UV輻射然后進行活組織檢查以便進一步分析。除非另外說明，在下列實施例中，用4只F36T12 ERE-VHO UV電燈泡照射人皮膚。在所有時間，在燈泡前4厘米安裝一個Kodocel TA401/407濾片以除去UVC輻射(＜290nm)。照射強度用IL443光治療輻射計和SED240/UVB/W光電探測器(International Light,NewBury,MA)進行監(jiān)測。用Optronic Labroatories OL 754系統(tǒng)進行輻射分光法。在離四個燈泡約43cm(17英寸)處的總輻射(290-800nm)為1.5mJ/cm2.s(1.49×10-3W/cm2)。用分光輻射法測定該燈泡的輻射輸出提供了約47％的UVB和約27％的UVA(由約9％的UVA1(340-400nm)和約18％的UVA2(320-340nm)組成)，其余為可見光和IR輻射。在這組四個燈泡下照射約160秒等價于受1MED照射。因此，當與0.5％UVB和6.5％UVA的自然日光(到達地球表面的自然目光的總幅射)相比，可以看出這些試驗中所用的一組四個燈泡所提供的UVA輻射遠遠少于暴露于等量UVB的日光時的UVA照射量。
UV輻射對膠原合成的影響我們讓自愿者在臀部的特定區(qū)域(即通常并不長期或偶然地暴露于陽光的區(qū)域)接受2MED的UV輻射，并且在輻照之前和輻照之后8、24、48和72小時，對每個自愿者的該區(qū)域進行活組織檢查。如圖1A染色所示，在UV輻照之前，真皮中的成纖維細胞在其細胞核中有Ⅰ型原膠原mRNA。在2MED輻照后8小時，在成纖維細胞細胞核中Ⅰ型原膠原mRNA的數(shù)量明顯下降(圖1B)；在輻照后24小時，在細胞中未見可檢測量的mRNA(圖1C)。因此，促進正常膠原合成的途徑在2MEDUV輻射后24小時被有效地停止。如上述光老化專利申請中所述，暴露于UV輻射還誘導產生MMP(基質金屬蛋白酶)，該酶降解膠原。因此，通過激發(fā)膠原降解以及抑制膠原合成，UV輻射破壞了皮膚的結構。與UV輻照之前相比(圖1A)，Ⅰ型原膠原mRNA的數(shù)量在UV輻照后48小時顯得更多(圖1D)，而且在輻照后72小時，Ⅰ型原膠原mRNA的數(shù)量有更顯著的增加(圖1E)，好象皮膚在愈合傷口。
圖2A-2F與圖1A-E類似，描述了皮膚中Ⅰ型原膠原的免疫組織學染色結果。與圖1相一致，沒有UV輻照時，Ⅰ型原膠原蛋白存在于成纖維細胞和乳頭真皮(真皮-表皮交界處)中，這可從圖2A中的黑色條帶看出。在UV輻照后4小時，Ⅰ型原膠原蛋白的含量在兩個區(qū)域都下降(圖2B)，輻照后8和24小時之間，皮膚中沒有可檢測的Ⅰ型原膠原存在(分別為圖2C和2D)。類似地，與輻照前相比，皮膚中Ⅰ型原膠原的數(shù)量在輻照后48小時和72小時更多(圖2E和2F)；這似乎是一種“反彈”效應。
圖3是一組織圖表，顯示了在暴露于UV輻射之后的各具體時間，我們對皮膚內Ⅰ型原膠原蛋白和pN膠原前體蛋白(即已在胞外切去羧基端的Ⅰ型原膠原蛋白)含量進行Western印跡分析的結果。圖3中的橫坐標將未輻照的皮膚值歸一化為1.0。在該圖表中可看出，這些蛋白的數(shù)量在輻照之前和約4小時后基本上是相同的，而在輻照后8小時有顯著的下降。至少在UV輻照后1天，原膠原和pN前體蛋白的數(shù)量都停留在非常低的水平，并且在輻照后3天恢復至最初含量的約一半。
與圖1A-1E類似，圖4A-4E顯示了對Ⅲ型原膠原mRNA的分析結果。類似地，這些照片顯示，Ⅲ型原膠原mRNA在暴露于UV輻射后1天基本上在皮膚中不存在，并且在約2天后恢復至較正常的值，在3天(72小時)后似乎表現(xiàn)出反彈效應。即，我們的分析技術揭示，Ⅲ型原膠原mRNA的數(shù)量在從UV誘導的膠原合成抑制中恢復之后，明顯高于輻照前，這可通過比較圖4A(輻照前)和圖4D(輻照后2天，基本上恢復)和圖4E(輻照后3天，mRNA水平大于輻照前)而看出。
與圖2A-2F中所示的相類似，圖5A-5F顯示了對Ⅲ型原膠原蛋白進行染色的活組織剖面的顯微照片。同樣，這些數(shù)據(jù)顯示，在2MED輻照后8小時以及在輻照后至少24小時之內，Ⅲ型原膠原在皮膚中幾乎不存在，而且從輻照前大量存在于皮膚中變成大幅減少。類似地，在UV輻照后2天，Ⅲ型原膠原在皮膚中恢復到過度豐富狀態(tài)(明顯的反彈效應)。
與圖3一樣，圖6顯示了我們對在UV輻照后各設定時間采集的自愿者活組織樣品中，原膠原蛋白和pN前體蛋白進行Western印跡分析的結果。與Ⅰ型和Ⅲ型原膠原的其他結果總體相符，短至輻照后8小時以及在輻照后持續(xù)至少3天，人皮膚中Ⅲ型原膠原蛋白的輻照后水平是從其穩(wěn)定狀態(tài)值大幅下降。
如上所述，膠原和原膠原都含有羥基脯氨酸這種氨基酸，這是一種少見的氨基酸，分析羥基脯氨酸的存在就可表示膠原的存在數(shù)量。圖7顯示了我們對UV輻照后不同時間獲取的自愿者活組織樣品羥基脯氨酸分析結果的總結；橫坐標顯示了每毫克總蛋白中可溶性羥基脯氨酸的皮摩爾數(shù)，這代表了人皮膚中可溶性膠原(即原膠原)的數(shù)量。如圖7所示，僅在4小時后，就可檢測到皮膚中可溶性膠原的喪失，這種喪失在UV輻照后8小時可清楚地檢測到?？扇苄阅z原數(shù)量的這種缺損在暴露于UV輻射后約2天維持在大約相同水平。
我們研究了膠原合成抑制程度與UV劑量之間的關系(如果有的話)。使用了我們的5位自愿者，我們活組織檢查了每個人的不曬太陽的皮膚，而且通過測量暴露過的皮膚樣品中可溶性羥基脯氨酸的含量并與未暴露皮膚樣品比較，分析了活于組織中的可溶性膠原。我們將這些自愿者皮膚的不同的受保護不曬太陽的部位，暴露于0.1、0.5、1和2MED UV輻射，然后在UV輻照后24小時取這些區(qū)域活組織檢查，以確定UV劑量對自愿者皮膚中可溶性膠原量的影響。這些結果示于圖8和9。
圖8是一組織圖表，顯示了在輻照后24小時，我們對不同劑量的UV輻射對免曬太陽的人皮膚中可溶性膠原喪失的影響的測定結果(測定我們的自愿者活檢組織中羥基脯氨酸的含量)。該圖顯示，0.5MED紫外線輻射造成可檢測的可溶性膠原喪失，而1MED輻照基本上與2MED輻照在造成可溶性膠原喪失方面基本上等價。
圖9是一組織圖表，顯示了在接受了與圖8相同劑量的UV輻照后，我們對人皮膚中Ⅰ型原膠原蛋白和pN前體蛋白的Western分析結果。圖9顯示，在24小時后，0.1MED輻照對皮膚中可溶性膠原和Ⅰ型原膠原蛋白含量的影響可忽略，而0.5MED有更明顯的效應。而且1MED和2MED輻照基本上等價，它們造成約60％可溶性膠原的喪失和80％原膠原蛋白和pN前體蛋白的喪失。因此，暴露于亞MED紫外線輻射的人皮膚會導致膠原合成喪失，即使沒有發(fā)生紅斑。這些結果意味著，不足以造成紅斑的偶然UV輻射輻照(這種輻照預計是每天發(fā)生的，例如上下班或上學/放學)，仍然會導致膠原合成喪失。
這些結果顯示，人皮膚暴露于1MED或更低的UV輻射，會導致在細胞中相當大程度地喪失編碼產生Ⅰ型和Ⅲ型原膠原的mRNA，以及在皮膚基質中相當大程度地喪失Ⅰ型和Ⅲ型原膠原。我們已在上述有關光老化的專利申請中表明，在受到2MED UV輻照后MMP上升。盡管不想局限于某一特定的實踐理論，然而我們相信，原膠原的喪失或者是因為其轉化為膠原，然后膠原又被MMP降解，或者是因為某些機制阻止了原膠原的合成或者原膠原轉化為不溶性膠原。很清楚，暴露于UV輻射還引起伴隨的膠原合成信號傳遞的mRNA的喪失。這種信號傳遞的減少可歸咎于mRNA的轉錄下降，或者所產生的原膠原mRNA被更快地降解。無論原膠原mRNA和蛋白下降通過何種實際機制(出于專利性理論，并不依賴于這些機制)，顯然與原膠原產生有關的mRNA信號的下降導致不能補充暴露于UV輻射后皮膚基質中原膠原的喪失。
類維生素A預處理我們測試了類維生素A(尤其是全反式視黃酸)是否對暴露于UV輻射之后人皮膚中原膠原mRNA和/或原膠原蛋白質的喪失有影響。(除非另有說明，在本文實驗中所用的視黃酸都是全反式的)我們的每個自愿者的不同皮膚區(qū)域用0.1％載體中的視黃酸或僅用載體進行處理。載體是由乙醇和聚乙二醇(體積比70∶30)混合物構成的。之后，使這些皮膚區(qū)域暴露于2MED(通常)UV輻射，接著在輻照后特定時間進行活組織檢查。對活組織如前所述進行分析。在UV輻照之前，待暴露于UV輻射的自愿者皮膚部位先用全反式視黃酸或對照載體進行處理。輻照前預處理時間8個小時看來并不能有效地防止膠原合成的下降，而輻照前預處理時間24個小時時給出了我們下述結果(其中膠原生物合成的下降被阻止了)。然而，應理解，用類維生素A進行預處理的時間為UV輻照前8-24個小時，可能足以防止我們所觀察到的膠原生物合成的下降。此外，應理解，在所有下列實施例中，用類維生素A處理(如“視黃酸處理的”)或用載體處理(如“載體處理的”)應被理解為在UV輻照前預處理24個小時。
我們使用類維生素A來阻止UV誘導型Ⅰ型和Ⅲ型原膠原喪失這一發(fā)明，在圖10中更形象地加以描述。圖10顯示了用載體和類維生素A處理過的皮膚在暴露于UV輻射之前和之后，染色的活組織剖面(與圖1所示的類似)。圖10顯示了對Ⅰ型原膠原mRNA進行染色的剖面(真皮-表皮交界處用電子方式以實線標出)。圖10A是用載體處理的皮膚，而圖10B是用全反式視黃酸處理的皮膚，兩張圖都是在UV輻照之前。在這一對照片中，原膠原mRNA在真皮的各種成纖維細胞中表達；而用視黃酸處理(圖中標題為“RA”)的皮膚表現(xiàn)出更深的染色，產生用于原膠原生物合成的mRNA的成纖維細胞的數(shù)目和密度在兩張圖中基本上相同。在UV輻照后，僅用載體處理的皮膚表現(xiàn)出mRNA的大幅下降(如圖10C所示)，因此可以推測出沒有原膠原合成。然而，用類維生素A預處理過(24小時)然后暴露于UV輻射的皮膚，并沒有表現(xiàn)出原膠原生物合成所必需的mRNA信號的任何下降(如圖10D所示)。比較圖10C和10D，令人驚奇地注意到，用類維生素A處理過的皮膚看來不受暴露于UV輻射的影響，其程度為在UV輻照之后Ⅰ型原膠原mRNA的表達與UV輻照之前相同。未經類維生素A處理(載體處理)的皮膚基本上表現(xiàn)出膠原合成的完全抑制。
圖11A-11D顯示了對我們自愿者皮膚中Ⅰ型原膠原蛋白存在與否進行免疫染色的剖面，其中皮膚用類維生素A或僅用載體處理并在暴露于UV輻射之前和之后進行活組織檢查。在圖11A和11B中，可看到Ⅰ型原膠原蛋白的存在情況與圖2A中所示的類似；該蛋白質存在于真皮的成纖維細胞中和真皮-表皮交界處。在圖11A和11B中沒有可覺察的差異。在暴露于2MED UV輻射后24小時所采集的活組織，在對照和用類維生素A處理的區(qū)域之間產生了令人吃驚的差異。圖11C顯示了對照(載體處理)的皮膚活檢組織，其中在真皮-表皮交界處的染色遠低于輻照前，而且在真皮中幾乎沒有染色(這暗示在成纖維細胞中沒有原膠原)。另一方面，圖11D中所示的類維生素A處理過的切片，在真皮-表皮交界處和真皮中的成纖維細胞中都有比對照活檢組織明顯更多的Ⅰ型原膠原蛋白染色。圖11D中的染色，與UV輻照之前的圖11A和11B所示的染色相當，盡管稍微有些下降。因此，類維生素A可防止在UV輻照后成纖維細胞和真皮-表皮交界處發(fā)生的Ⅰ型原膠原蛋白和Ⅰ型原膠原mRNA的下降。
圖12是一組織圖表，顯示了我們對我們自愿者的活檢組織進行Western印跡分析的結果，其中皮膚用視黃酸或僅用載體預處理，活組織檢查，暴露于UV輻射，然后再進行活組織檢查。如圖所示，在UV輻照之前，用載體處理的區(qū)域有一定量的Ⅰ型原膠原和pN膠原前體，數(shù)量歸一化為數(shù)值1.0。未暴露的、經視黃酸處理的皮膚有基本上相同數(shù)量的Ⅰ型原膠原和pN前體蛋白。在2MED輻照后24小時對UV輻照過的皮膚取活組織檢查顯示，載體處理過的區(qū)域中Ⅰ型原膠原和pN前體蛋白的數(shù)量比輻照之前低了一半。這些結果與前面論述的結果是一致的。然而，用視黃酸處理過的區(qū)域表現(xiàn)出Ⅰ型原膠原和pN膠原前體蛋白兩者非常少的喪失，兩者的數(shù)值都大于對照的80％。
使用類維生素A來防止UV誘導型的Ⅲ型原膠原喪失，也在圖13中示出。圖13顯示了用視黃酸或僅用載體處理過的皮膚，在暴露于UV輻射之前和之后，對Ⅲ型原膠原mRNA表達情況進行染色的人皮膚活檢組織剖面(與圖4所示的相類似)。在UV輻照之前，在載體處理(圖13A)和視黃酸處理(圖13)的皮膚中，Ⅲ型原膠原mRNA在真皮的成纖維細胞中都有表達。在暴露于UV輻射之后，載體處理的皮膚顯示出Ⅲ型原膠原mRNA表達的完全缺乏(圖13C)，而用視黃酸處理的皮膚僅顯示出Ⅲ型原膠原mRNA表達的小幅(如果有的話)下降(圖13D)。
圖14A-14D與剛描述過的圖13A-13D類似，但是是對Ⅲ型原膠原蛋白的存在與否進行染色。如圖14A和14B所示，在對照區(qū)域和視黃酸處理區(qū)域的染色活檢組織中，在暴露于UV輻射之前，Ⅲ型原膠原蛋白在整個真皮中都存在。在暴露于2MED UV輻射后24小時，在對照(載體處理)的活檢組織切片中(圖14C)，Ⅲ型原膠原蛋白的數(shù)量在整個真皮中急劇下降。形成鮮明對比的是，類維生素A處理的區(qū)域在暴露于UV輻射后(圖14D)，其染色模式和強度與UV輻照之前圖14A和14B中所示的幾乎相同。因此，在UV輻照之前局部施用類維生素A可防止在暴露于UV輻射后發(fā)生的Ⅲ型原膠原蛋白(圖14)和Ⅲ型原膠原mRNA(圖13)的下降。
圖15是一組織圖表，顯示了我們對人皮膚中Ⅲ型原膠原蛋白和pN前體蛋白進行Western分析的結果(與圖12類似)，其中皮膚在輻照之前先用視黃酸或僅用載體預處理，并在UV之前和之后進行活組織檢查。同樣，在UV輻照之前，載體(VEH)和視黃酸(RA)處理過的皮膚有基本上相同數(shù)量的這些蛋白。在2MEDUV輻照之后，皮膚中的這些蛋白的數(shù)量基本上減半，如VEH+UV直方柱所示。然而，用視黃酸處理的UV輻照切片(RA+UV)所具有這些蛋白質的數(shù)量，與輻照之前的對照區(qū)域和視黃酸處理區(qū)域基本上相同。
我們還分析了載體處理的以及視黃酸處理的皮膚中，在UV輻照之前和之后，我們自愿者的活檢組織中的可溶性膠原(以羥基脯氨酸含量進行測定)。如圖6所示，在輻照之前，在對照和類維生素A處理的皮膚中，可溶性膠原的數(shù)量基本上都相同(載體處理的皮膚被歸一化為數(shù)值1.0)。在UV輻照之后，載體處理的皮膚(VEH+UV)僅具有輻照之前的約40％的可溶性膠原。與UV輻照之前的皮膚相比，類維生素A處理過的區(qū)域(RA+UV)中可溶性膠原的數(shù)量也下降，但是其水平幾乎是載體處理并UV輻照過的皮膚中水平的2倍。
如上所述，在UV輻照之前用類維生素A處理的自愿者的皮膚區(qū)域，是在輻照之前24小時進行預處理的。我們還在暴露于2MED UV輻射之前8小時，用0.1％全反式視黃酸預處理了某些自愿者的未曬太陽的皮膚。如圖17所示，在載體處理和類維生素A處理的皮膚中，未曬太陽皮膚中可溶性膠原的水平(以羥基脯氨酸含量進行測定)在8小時后以及未暴露于UV輻射時是相同的(歸一化為數(shù)值1.0)。在2MED輻照之前8小時進行預處理不提供可覺察的好處正如圖17右側部分所示，在UV輻照之后24小時(其中，輻照之前8小時用類維生素A預處理并輻照皮膚)，類維生素A處理的皮膚和對照(載體處理的)皮膚中可溶性膠原數(shù)量基本上相同。因此，如上所述，為了用類維生素A來防止UV誘導型膠原合成喪失，應在輻照之前24小時進行預處理才可產生所需的預防效果，而在輻照前8小時進行預處理不產生明顯的預防效果。
上述實施例是用上述的燈泡和濾色鏡進行的。我們已確定，這種系統(tǒng)所提供的UV輻照中的UVA輻射，比相同入射能量的正常太陽光低約20倍。這些燈泡發(fā)出的輻射包括約50％UVB、約25％UVA和約25％IR/可見光。在天然陽光中，僅約4-5％UV輻射是UVB，其余的是UVA。我們現(xiàn)在采用“太陽模擬器”，它在290-400納米(UVA和UVB區(qū)域)提供的光輻射具有與天然陽光相等的相對數(shù)量的UVA和UVB(即UVA∶UVB之比約為9∶1)。我們還檢查了這種模擬太陽的UV輻射(模擬太陽的光譜輸出)對人體皮膚內的Ⅰ型原膠原蛋白水平的影響。如圖18所示，我們發(fā)現(xiàn)，1MED和2MED輻照劑量的模擬太陽UV，可導致Ⅰ型原膠原蛋白的明顯下降，這與早先用主要為UVB源的UV輻射所顯示的結果相同。因此，這證實了太陽光的UV輻射可造成人體皮膚內原膠原的喪失。
如上所述，在人皮膚中產生Ⅰ型原膠原的細胞是成纖維細胞。我們利用了培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，以便更好地了解UV是如何在人皮膚中造成原膠原合成抑制的。在培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞中，UV輻照抑制Ⅰ型原膠原基因的表達，這與人體皮膚中相同。UV輻照還在培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞中誘導c-JUN轉錄因子，這與體內相同。c-JUN的誘導導致了MMP的產生，而MMP降解膠原。我們將Ⅰ型原膠原的膠原(Iα2型)報道基因引入人皮膚成纖維細胞；即用名稱為TAM-67的顯性負c-jun質粒(P.H.Brown,T.K.Chen,和M.J.Birrer在Oncogene,9(3):791-9,1994中所述)，將基因-722 COL1A2缺失型質粒(H.Ihn,E.D.LeRoy,和M.Trojanowska在J.Biological Chem.,272:24666-672,1997中所述)插入。轉化后，該顯性的負質粒導致產生無功能的c-JUN因子，該因子干擾正常c-JUN發(fā)揮功能，盡管它是無功能的，它可有效地中和細胞中有功能的c-JUN。因此，當膠原合成基因表達時，該報道基因就表達。圖19顯示了將這些轉化后的細胞暴露于UV輻射所獲得的結果。對照(CTRL)顯示提供了一條在這些修飾細胞中正常存在的活性膠原基因表達基線。在這些細胞用太陽模擬器的紫外線輻照后(約30mJ/cm2)，分析報道基因的表達情況。如圖中所示，它降至約50％；因此，太陽輻射可降低膠原基因的表達。在突變型c-JUN干擾正常c-JUN表達的轉化細胞中，在暴露于UV輻射后(來自上述燈泡的UV輻射，而不是來自太陽模擬器的UV輻射)。膠原基因表達沒有下降。因此，在這些改變的細胞中，當膠原膠原的轉錄發(fā)生時，干擾c-JUN的報道基因被激活，從而防止了膠原合成受抑制。這些數(shù)據(jù)表明，c-JUN介導了UV輻射對Ⅰ型原膠原基因表達的抑制作用。因此，可阻斷UV輻射對c-JUN的誘導作用的制劑(如類維生素A)可有效地用于保護暴露于UV的皮膚，避免發(fā)生原膠原喪失。其他的c-JUN抑制劑在下面描述。
綜上所述，我們已表明，UV輻射可減少皮膚中膠原、原膠原蛋白、pN前體蛋白和原膠原mRNA的數(shù)量并抑制膠原合成。我們已表明，亞MED劑量UV輻射以及超MED劑量的輻照都會導致可溶性膠原、原膠原、pN前體蛋白和mRNA信號的喪失。我們已表明，原膠原蛋白水平的下降直到輻照后一段時間后才可覺察。而且，我們還已表明類維生素A可在體內保護人皮膚避免UV誘導的對膠原合成的抑制。應理解，本發(fā)明可用于在沒有明顯光老化的皮膚以及在已表現(xiàn)出光損傷的皮膚中(或者是因長期慢性暴露或是短期暴露(如在海濱曬傷之后))，防止UV誘導的膠原合成的抑制。無論皮膚是否有實際的或可見的光損傷，暴露于太陽會抑制原膠原合成。對于未表現(xiàn)出光損傷的皮膚，使用本發(fā)明可防止對膠原合成的抑制。太陽曬傷的皮膚(其中原膠原合成已經被抑制)是處于修復階段，而進一步暴露于太陽會因降解膠層(其作為修復過程一部分而被置換)和繼續(xù)抑制膠原合成，而有效地阻止修復。因此，本發(fā)明可用于所有皮膚，而不論已有的光損傷程度。
可用于實施本發(fā)明的類維生素A，包括例如美國專利No.4,877,805中描述的那些，以及如Fanjul等人在Nature(1994)372:104-110中描述的那些解離的類維生素A。類維生素A通常包括維生素A(視黃醇)、維生素A醛(視黃醛)、維生素A酸(視黃酸(RA)，包括全反式、9-順式和13-順式視黃酸)、苯壬四烯酯的天然和合成類似物，以及EP-A2-0379367、US4,887,805和US4,888,342中描述的其它化合物(這些專利全部納入本文作參考)。各種合成的類維生素A和具有類維生素A活性的化合物，預計可用于本發(fā)明只要它們在體內表現(xiàn)出類維生素A活性的程度，并且這些物質在下列已轉讓給Allergan Inc.各美國專利中有所描述，這些專利是5,514,825；5,698,700；5,696,162；5,688,957；5,677,451；5,677,323；5,677,320；5,675,033；5,675,024；5,672,710；5,688,175；5,663,367；5,663,357；5,663,347；5,648,514；5,648,503；5,618,943；5,618,931；5,618,836；5,605,915；5,602,130。具有類維生素A活性的其它化合物在其它美國專利中有所描述，它們是5,648,563；5,648,385；5,618,839；5,559,248；5,616,712；5,616,597；5,602,135；5,599,819；5,556,996；5,534,516；5,516,904；5,498,755；5,470,999；5,468,879；5,455,265；5,451,605；5,343,173；5,426,118；5,414,007；5,407,937；5,399,586；5,399,561；5,391,753等，所有前述和下述專利和參考文獻均納入本文作參考。盡管視黃醇是用于局部施用的優(yōu)選化合物，然而預計可用于實施本發(fā)明的視黃醇的有效衍生物包括視黃醛、視黃酸(包括全反式、9-順式和13-順式異構體)及其衍生物(如7,8-二脫氫視黃酸)、以及Kligman等人(該文獻在此引用作為參考)所描述的物質，其中包括化妝上可接受的鹽、酯、反酯(reverse esters)、醚、其偶聯(lián)物、以及它們的混合物。
施用于皮膚的活性成分的有效量宜為0.001-5重量％，較佳地約為0.01-2重量％，更佳地為0.1-1重量％。配制的組合物在施用時宜提供約5微克±2.5微克/平方厘米皮膚。例如，優(yōu)選的用于本發(fā)明的組合物是Retin-A視黃酸凝膠和雪花膏(可從Ortho Pharmaceuticals獲得)，目前用于治療播散性痤瘡，其濃度為0.01％-0.1％。取決于具體的劑型，載體宜包括至少下列一種物質丁基羥基甲苯、醇(用叔丁醇和番木鱉堿硫酸鹽變性)、硬脂酸、肉豆蔻酸異丙酯、硬脂酸-40-聚烴氧基酯、十八烷醇等、以及它們的相容混合物。
可用于實施本發(fā)明的其他化合物包括那些抑制激酶級聯(lián)反應途徑中信號傳遞的物質，例如在c-JUN存在處或上游的應力誘導途徑(SAP)，該途徑導致形成c-JUN。較佳地，這些化合物局部施用。作為c-JUN抑制劑的代表性化合物包括香葉基轉移酶抑制劑和lisofylline，它們可抑制JNK級聯(lián)反應的活化?；衔锶鏢B202190(J.C.Lee等在Natrue(1994)372:739-746中有敘述)和PD98059(D.T.Dudley等在美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1995)92:7686-7689中有敘述)可抑制上述SAP級聯(lián)反應中的特異性激酶，它們也可用于本發(fā)明。其他可抑制c-JUN形成的化合物是在暴露于UV輻射后防止或減少c-JUN增加的細胞表面受體抑制劑。這些受體抑制劑(可從BIOMOL Res.Labs.,Inc.,Plymouth Metting,PA購得)包括G-蛋白偶連受體和離子載體的拮抗劑(如蘇拉明，一種已知的抗原生動物藥)；表皮生長因子受體拮抗劑(如AG-494；Erbstatin類似物；染料木黃酮；Lavendustin A；Tyrphostin 1,9,23,25,46,47和51；以及PD153035)。
抗氧化劑可視為UV輻射膠原合成抑制作用的抑制劑。盡管不希望受特定理論的束縛，據(jù)信這些化合物是通過淬滅或減少自由基和活性氧物質而起作用的，而這些自由基和活性氧物質可引發(fā)或導致形成c-JUN的激酶級聯(lián)反應，從而導致產生MMP，并據(jù)信導致了對膠原合成的抑制?？捎糜诒景l(fā)明的抗氧化劑包括谷胱苷肽及其前體，如N-乙酰半胱氨酸(NAC)，更廣泛的定義是N-CH3(CH2)nCO半胱氨酸(其中n是0至8的一個整數(shù)，更佳的不超過4)，以及美國專利No.5,296,500中描述的相關化合物及其衍生物(該專利納入本文作參考)?？寡趸瘎┻€包括(ⅰ)脂溶性化合物，如β-胡蘿卜素及其衍生物或其它類胡蘿卜素；和維生素E和相關的生育酚；(ⅱ)水溶性化合物，如維生素C及其衍生物(如抗壞血酸葡萄糖胺)，谷胱苷肽和NAC和；(ⅲ)其他化合物，如產生番茄紅色的顏料中的一種，硫辛酸，genistein，伊布硒啉(ebselen)和其他硒化合物。谷胱苷肽及其前體，如N-乙酰半胱氨酸(NAC)，更廣泛的定義是N-CH3(CH2)nCO半胱氨酸(其中n是0至8的一個整數(shù)，更佳的不超過4)，以及相關化合物及其衍生物，描述于美國專利No.5,296,500中(該專利納入本文作參考)。
如上所述，用于本發(fā)明的組合物可包含上述一種或多種作為陽光阻斷劑(sunblock)(如鋅雪花膏)或防曬劑(如氧苯酮、烷氧基肉桂酸酯等)的化合物。一種優(yōu)選的防曬劑是PARSOL1789，可單獨使用或與PARSOL MCX或其他防曬劑聯(lián)用。PARSOL1789(也稱為PARSOL A)是4-叔丁基-4′-甲氧基二苯甲酰甲烷，其在美國專利No.4,387,089中有描述(該專利納入本文作參考)。(PARSOL MCX和PARSOLMOX都是對甲氧基肉桂酸2-乙基己酯的商標，它是一種常用于商品防曬劑的UVB阻斷劑，并且公開在美國專利No.4,713,473中，該專利的公開內容納入本文作參考)。
前面的描述是用于說明的而不起限制作用。細閱本說明書后，各種變化、修改和添加對于熟練技術人員來說是顯而易見的，這意味著這些變化、修改和添加均在本權利要求書限定的本發(fā)明的范圍和精神實質中。
實施例中所用的方法組織學和形態(tài)測定法從每人的臀部皮膚獲取雙份4mm鉆取活檢樣本。隨機和盲法地用福爾馬林固定，組織切片，用蘇木精和曙紅染色。用Olympus BX40顯微鏡結合Sony DCX-151高分辨照相機對切片進行檢測。用NIH Imager Software隔離每邊200μm的方框區(qū)，對兩塊這樣區(qū)域的每塊中的4個位點(隔開25μm)評估表皮深度。用相同的兩塊方框區(qū)域作表皮細胞計數(shù)。測定整個組織切片上間質細胞核(即不與毛細管相連且位于真皮-表皮交界處下方的核)的數(shù)目，作為真皮細胞構成的度量。將同樣的盲法制成的切片對結締組織纖維間隙、厚度、結構破壞程度和結構破壞深度進行計分，每個參數(shù)分值1-9分。
RNA的Northern分析通過鹽酸胍裂解和超離心(如G.J.Fisher等，“局部視黃酸處理的人皮膚的細胞、免疫和生化特征”，J.Investig.Dermato1.,96:699-707(1991)所述)，從皮膚樣品中分離總RNA(如原膠原α1(Ⅲ)的RNA)。按G.J.Fisher等(“全反式視黃酸體內誘導人皮膚中細胞視黃醇結合蛋白”，J.Investig.Dermatol.,105:80-86(1995))所描述的方法，用針對待測的特定mRNA的隨機引導的32P標記cDNA探針，進行總mRNA的Northern分析(40μg/泳道)。用逆轉錄聚合酶鏈反應測定Ⅲ型原膠原mRNA。
蛋白質的Western分析用G.J.Fisher等(“人皮膚中視黃酸和類維生素AX受體蛋白的免疫學鑒定和功能定量測定”，J.Biol.Chem.,269:20629-20635(1994))所描述的Western分析法，檢測人皮膚提取物中的Ⅰ型原膠原和pN前體蛋白以及Ⅲ型原膠原。
免疫反應性蛋白用強化的化學發(fā)光檢測法顯影，并用激光密度測定法定量測定，或用強化的化學熒光檢測法顯影，并用Storm圖象儀(Molecular Dynamics,Sunyvale,CA)定量測定。
免疫組織學Ⅰ型和Ⅲ型pN膠原的免疫組織學，是按Griffiths,C.E.M.等人，新英格蘭醫(yī)學雜志(N.Engl.J.Med.),329:530-535(1993)中所述的方法進行。Ⅰ型pN膠原是用小鼠單克隆IgG1抗體(SP1.D8；可從Univ.Of Iowa Dept.Of BiologicalSciences Developmental Studies Hybridoma Bank,Iowa City,IA獲得)檢測，該抗體抗人Ⅰ型原膠原的氨基前肽區(qū)域(Foellmer,H.G.等人，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.),134:183-189(1993))。Ⅲ型pN膠原用親和純化的、針對Ⅲ型原膠原的氨基肽的家兔多克隆抗體(與Western分析中所用的相同)進行檢測。適當稀釋的IgG1被用作SP1.D8抗體的對照，而家兔血清被用作Ⅲ型原膠原抗體的對照。
原位雜交用于檢測Ⅰ型和Ⅲ型原膠原RNA(mRNA)的含地高辛毒苷的有義和反義核糖核酸探針，通過使用T3和T7核糖核酸聚合酶加以合成。按Fisher,G.H.等人，J.Invest Dermatol.,105:80-86(1995)所述的方法，對冷凍的皮膚切片(5微米)進行安裝、固定、處理、和雜交。雜交信號用偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛毒苷的抗體進行免疫組織化學檢測。
羥基脯氨酸分析羥基脯氨酸分析使用420H型氨基酸分析儀(AppliedBiosystems,Foster City,CA)，自動化地進行前柱苯硫氨甲?；?氨基酸(PTC-AA)分析。420H型分析儀先將蛋白質水解，釋放游離氨基酸。一旦被水解，游離氨基酸就與異硫氰酸苯酯(PITC)發(fā)生衍生反應，形成PTC-AA衍生物。通過控溫爐中的反向柱將PTC-AA分離出。在皮膚提取物中的羥基脯氨酸濃度，根據(jù)羥基脯氨酸標準品加以測定。
權利要求
1．一種預防因皮膚暴露于UV輻射而導致人皮膚中膠原生物合成下降的方法，其特征在于，該方法包括提供含有有效量類維生素A的組合物，以及在皮膚暴露于UV輻射之前將所述類維生素A局部施用于皮膚，其中局部施用是在暴露之前有效防止UV誘導的膠原生物合成下降的一段時間進行的。
2．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述類維生素A是全反式視黃酸、視黃醇、或它們的混合物。
3．如權利要求1所述的方法，其特征在于，此法防止了Ⅰ型原膠原合成的下降。
4．如權利要求1所述的方法，其特征在于，此法防止了Ⅲ型原膠原合成的下降。
5．如權利要求1所述的方法，其特征在于，UV輻射源是太陽。
6．如權利要求1所述的方法，其特征在于，類維生素A有規(guī)律地施涂在皮膚上。
7．如權利要求1所述的方法，其特征在于，類維生素A至少每天施涂于皮膚一次。
8．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的暴露包括至少1MED UV輻射。
9．如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的暴露包括至少2MED UV輻射。
10．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的暴露包括小于1MED UV輻射。
11．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的局部施用是在暴露前至少16小時進行。
12．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的局部施用是在暴露前至少24小時進行。
13．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物還包括防曬劑、陽光阻斷劑、抗氧化劑、或它們的混合物。
14．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有抗氧化劑。
15．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有(ⅰ)抗氧化劑和(ⅱ)防曬劑或陽光阻斷劑構成的混合物。
16．如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述防曬劑是4-叔丁基-4′-甲氧基二苯甲酰甲烷。
17．如權利要求16所述的方法，其特征在于，防曬劑是4-叔丁基-4′-甲氧基二苯甲酰甲烷和對甲氧基肉桂酸2-乙基己酯的混合物。
18．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述局部施用是在暴露前8小時以前進行。
19．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述局部施用是在暴露前16小時以前進行。
20．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述局部施用是在暴露前24小時以前進行。
21．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮膚在進行本方法之前沒有光損傷的表觀跡象。
22．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮膚在進行本方法之前有光損傷的表觀跡象。
23．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮膚在進行本方法之前有紅斑。
24．如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中c-JUN的誘導被抑制。
25．一種預防因皮膚暴露于UV輻射而由c-JUN介導的人皮膚中膠原生物合成下降的方法，其特征在于，該方法包括提供含有有效量c-JUN抑制劑的組合物，以及在皮膚暴露于UV輻射之前將該抑制劑局部施用于皮膚，其中局部施用是在暴露之前有效防止UV誘導的膠原生物合成下降的一段時間進行的。
26．如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述的抑制劑是香葉基轉移酶抑制劑、lisofylline、SB202190、PD98059、離子載體拮抗劑、G-蛋白偶連受體拮抗劑、或表皮生長因子受體拮抗劑
27．如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述的拮抗劑是蘇拉明；AG-494；Erbstatin類似物；染料木黃酮；Lavendustin A；Tyrphostin 1,9,23,25,46,47或51；或PD153035。
28．一種局部用藥物組合物，它用于預防因皮膚暴露于UV輻射而引起的人皮膚中膠原生物合成下降，其特征在于，該組合物包括有效量的類維生素A以及藥學上可接受的載體，條件是在皮膚暴露于UV輻射之前將該組合物施用于皮膚。
29．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述類維生素A是全反式視黃酸、視黃醇、或它們的混合物。
30．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述類維生素A防止了Ⅰ型原膠原合成的下降。
31．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述類維生素A防止了Ⅲ型原膠原合成的下降。
32．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，UV輻射源是太陽。
33．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括防曬劑、陽光阻斷劑、抗氧化劑、或它們的混合物。
34．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有抗氧化劑。
35．如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有(ⅰ)抗氧化劑和(ⅱ)防曬劑或陽光阻斷劑構成的混合物。
36．如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述防曬劑是4-叔丁基-4′-甲氧基二苯甲酰甲烷。
37．如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述防曬劑是4-叔丁基-4′-甲氧基二苯甲酰甲烷和對甲氧基肉桂酸2-乙基己酯的混合物。
38．一種局部用藥物組合物，它用于預防因皮膚暴露于UV輻射而由c-JUN介導的人皮膚中膠原生物合成下降，其特征在于，所述組合物包括有效量的c-JUN抑制劑和藥學上可接受的載體，其中在皮膚暴露于UV輻射之前有效防止UV誘導的膠原生物合成下降的一段時間前將所述組合物局部施用于皮膚。
39．如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述的抑制劑是香葉基轉移酶抑制劑、lisofylline、SB202190、PD98059、離子載體拮抗劑、G-蛋白偶連受體拮抗劑、或表皮生長因子受體拮抗劑。
40．如權利要求39所述的方法，其特征在于，所述的拮抗劑是蘇拉明；AG-494；Erbstatin類似物；染料木黃酮；Lavendustin A；Tyrphostin 1,9,23,25,46,47或51；或PD153035。
全文摘要
人皮膚暴露于太陽光中的紫外線(UV)輻射,不僅誘導產生降解膠原的酶(基質金屬蛋白酶),而且還通過抑制原膠原的合成來抑制新膠原的合成。通過在暴露于UV輻射之前在皮膚上局部施用類維生素A或c－JUN抑制劑,可以防止這種UV誘導的、對膠原合成的抑制作用。
文檔編號A61K31/167GK1303282SQ99806699
公開日2001年7月11日 申請日期1999年4月2日 優(yōu)先權日1998年4月2日
發(fā)明者G·J·費希爾, J·J·沃里斯 申請人:密執(zhí)安州立大學董事會