專利名稱：：作為膽固醇和其它脂類攝取抑制劑的兩親分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一些分子在藥物，尤其是作為從消化道攝取膽固醇和其它食物脂類的抑制劑中的用途。因此本發(fā)明應(yīng)用于包括高膽固醇血癥的高脂血癥，以及肥胖癥的治療。膽固醇為賈納斯面(Janus-faced)分子。一方面，雖然其確切的功能性作用仍然未定，但它為細胞質(zhì)膜的一個必需組成。另一方面，如果它存在太多，血液膽固醇水平高，它則沉積在動脈壁上，導致動脈粥樣斑塊并最終導致心肌梗死和中風。在西方工業(yè)國家，由動脈粥樣硬化導致的死亡數(shù)量大于任何其它疾病。動物細胞大約三分之二的膽固醇在細胞中通過從頭合成來提供；剩下的三分之一為飲食來源，通過消化道的上皮細胞攝取。由于膽固醇在水和水性介質(zhì)如血液中為不溶性的，因此它不得不以穩(wěn)定的形式來分散。這個過程稱為乳化，產(chǎn)生的穩(wěn)定的顆粒被稱為血清脂蛋白。血液中最重要的膽固醇的運輸載體為低密度脂蛋白(LDL)顆粒(Brown等，科學23234-47(1986))。細胞對膽固醇的需求是通過如上所述的細胞合成膽固醇的能力或另一方面通過已知為受體介導的胞吞作用由細胞從血流內(nèi)化LDL顆粒來維持。在血液高水平LDL與動脈粥樣硬化和隨后的心肌梗死和中風之間存在著一個明確的因果關(guān)系。需要強調(diào)LDL的雙重作用一方面LDL顆粒為細胞提供膽固醇，另一方面它們導致膽固醇在動脈壁的沉積以及動脈粥樣斑塊的產(chǎn)生。LDL的高血液水平是由于稱為家族性高膽固醇血癥(FH)的遺傳疾病或高脂肪飲食。Brown和Goldstein(Brown等，科學23234-47(1986))的工作強調(diào)了LDL受體在高膽固醇血癥中的中心作用。在這兩種情況下，細胞表面上的LDL受體的數(shù)同明顯減少在FH的情況下，由于遺傳性的基因缺陷，LDL受體僅部分可運轉(zhuǎn)或在最壞的情況下完全不發(fā)揮作用；和在高脂肪富含膽固醇飲食的情況下，LDL受體的合成在轉(zhuǎn)錄水平上被抑制。在各種情況下，無論是遺傳性的或獲得性的，產(chǎn)生了相同的結(jié)果，即LDL受體缺乏。結(jié)果，LDL顆粒不再有效地被從循環(huán)中除去，其血液水平增高，導致動脈粥樣硬化的發(fā)生?；加须s合FH的病人已用一類統(tǒng)稱為抑制素的藥物來治療，它們一個實例為西伐他停(simvastatin)，由Merck以ZOCORTM出售。這類化合物抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶，后者是膽固醇合成的限速酶，從而抑制細胞生物合成途徑。抑制素通常與描述為膽汁鹽螯合劑的樹脂如膽甾胺一起給藥。后者口服并以很大的量給藥時顯示出對血液膽固醇水平具有降低作用。然而，由于不得不大量使用以達到該效果且這些量導致不希望的副作用，因此這類化合物病人一直不歡迎并且未被廣泛使用。然而Brown和Goldstein表明(Brown等，科學23234-47(1986))如果將這些病人用抑制素和樹脂如膽甾胺的混合物治療，患有雜合FH的病人的LDL受體數(shù)量可被提高至正常水平。在1988年，美國全國膽固醇教育工程宣布了對全血膽固醇和LDL膽固醇水平的分類以及對被劃為高膽固醇血癥的人推薦的飲食治療。除開飲食措施，導致血液膽固醇降低的預防方法將是極受歡迎的。降低或抑制膽固醇在消化道中的吸收并從而以這種方式降低膽固醇的血液水平的想法是原有的，針對此目的制藥工業(yè)已投入了大量的努力，然而，目前收效甚微。作為一個實例，服用皂苷類作為飲食的補充，被顯示在實驗動物中降低血液膽固醇水平并預示可用于治療高膽固醇血癥(Harwood等，脂類研究雜志(34377-395(1993))。然而，由于皂苷類來源困難，該方法失敗了。從自然來源中獲得大量純的皂苷類從實踐上來說是不可能的。而至少到目前為止，使用合成的皂苷類的類似物以及取代物的方法也沒有成功。在1990年，我們報導消化道上皮細胞的刷狀緣膜(“BBM”)對膽固醇的攝取是蛋白質(zhì)介導的(Thurnhofer等，生物化學292142-2148(1990))。這對于膽固醇酯(Compassi等，生物化學3416473-(1995))和其它飲食脂類(Thurnhofer等，生物化學生物物理學雜志1024249-262(1990))也是如此。我們的發(fā)現(xiàn)與教科書及綜述文章中證實的被廣泛接受的觀點不同，即脂類的攝取是一個包含沿濃度梯度的飲食脂類擴散的被動過程。我們的發(fā)現(xiàn)開辟了干擾和可能抑制消化道中膽固醇攝取的新途徑和可能性。在1990年以前，針對該目標采取的方法可被劃分成非特異性的。實例為用聚合物如膽甾胺或植物皂苷類治療。這些化合物被推測與消化道中將膽固醇和其它飲食脂類轉(zhuǎn)運到攝取位點的膽汁鹽相互作用，這種相互作用使膽固醇和其它脂類不能進行脂類的攝取。在這種相互作用中需要大量的這些試劑表明該反應(yīng)是非特異性的。相反，在BBM中是蛋白質(zhì)催化膽固醇(或更一般地說脂質(zhì))攝取，這種途徑是不同的并且可被劃分為特異性的。這里，目標是發(fā)現(xiàn)或設(shè)計特異性與參與脂類攝取的蛋白質(zhì)相互作用的試劑，從而抑制脂類攝取。目前已發(fā)現(xiàn)一族蛋白質(zhì)可起膽固醇或其它脂類攝取抑制劑的作用，其中該蛋白質(zhì)的存在已為人熟知，其功能被認為已確定，但沒有提出其腸道的醫(yī)藥用途。這種蛋白為脫輔基蛋白質(zhì)。還發(fā)現(xiàn)脫輔基蛋白質(zhì)在本發(fā)明中看來有效的原因是由于在它們的結(jié)構(gòu)中存在兩親性α-螺旋，因此其它包含一個或多個具有蛋白質(zhì)兩親性α-螺旋的相關(guān)特性(尤其是大小，幾何學和極性)的兩親性區(qū)域的分子可用于本發(fā)明。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供包含一個或多個兩親性區(qū)域，尤其是兩親性螺旋的分子在制備用于抑制從消化道中攝取膽固醇或其它脂類的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供包含一個或多個兩親性區(qū)域，尤其是兩親性螺旋的分子在制備用于經(jīng)腸道給藥的治療或預防高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥和/或肥胖的藥物中的用途。這個或各個兩親性區(qū)域具有由至少13,14，或15個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)兩親性螺旋的相關(guān)特性(尤其是大小，幾何學和極性)，其中13、14和15個氨基酸殘基數(shù)目中優(yōu)選性遞增。因此，本發(fā)明能提供一種抑制從消化道攝取膽固醇或其它脂類的方法，該方法包括給予病人或個體包含一個或多個兩親性區(qū)域，尤其是兩親性螺旋的分子。本發(fā)明還可提供一種治療或預防高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥，和/或肥胖的方法，該方法包括經(jīng)腸內(nèi)給予病人或個體有效量的包含一個或多個兩親性區(qū)域，尤其是兩親性螺旋的分子。包含幾個兩親性α-螺旋的特殊的蛋白質(zhì)分子為脫輔基蛋白質(zhì)。如上所述，低密度脂蛋白(LDL)是血液中膽固醇的最重要的運輸載體。LDL是脂蛋白族系中的一員，該脂蛋白族系根據(jù)密度遞增被劃分為乳糜微粒、乳糜微粒殘余物、極低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)。各種脂蛋白都有其自身功能；例如，如上所述，LDL在血液中膽固醇的轉(zhuǎn)運中非常重要，HDL被認為是細胞和血管中膽固醇的清除劑，且它們在那些方面的作用是非常明確的。脂蛋白是一種由極性脂類的殼包圍的疏水性脂類中心和脫輔基蛋白質(zhì)(也稱為脫輔基脂蛋白，有時簡寫為apos)組成的顆粒。十種主要的脫輔基蛋白質(zhì)A-1,A-2,A-4,B-48,B-100,C-1,C-2,C-3,D和E已被分離并表征；它們通過肝臟和腸合成并分泌。Goodman和Gilman在“治療學的藥理學基礎(chǔ)”McGraw-Hill，第8版，1992中給出了如下的在各種脂蛋白中的脫輔基蛋白質(zhì)的分布。</tables>設(shè)想在原則上任何脫輔基蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明。脫輔基蛋白質(zhì)A和C(apoA和apoC)已表明在體外BBM模型中尤為有效。鑒于它們很大的大小以及由于它們在脫脂形式下相對缺乏可溶性，B脫輔基蛋白質(zhì)可能不是優(yōu)選的。雖然本發(fā)明在治療或預防人類疾病中具有特殊的應(yīng)用，但它還可用于其它動物(尤其是哺乳動物)。很有可能來自任何特定種類(包括人類)的脫輔基蛋白質(zhì)可能最適宜于治療同種的動物，但脫輔基蛋白質(zhì)的種間交叉使用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。天然脫輔基質(zhì)白質(zhì)(包括所有等位基因變異體)及其變異體的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。變異體包括插入、缺失和取代突變體；至少從膽固醇(更普通地說為脂類)攝取抑制來看，突變體可通常為保守突變體，并通常將與天然序列顯示顯著的氨基酸同源性。顯著的氨基酸同源性可包括在最佳配對基礎(chǔ)上至少40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％或甚至99％的同源性，增加的同源性是優(yōu)選的。可加入非干擾氨基酸序列，可缺失非必需氨基酸序列。簡而言之，適宜的突變體包括其二級結(jié)構(gòu)足以復制或模擬能抑制脂類尤其是膽固醇從消化道攝取的天然脫輔基蛋白質(zhì)的那些蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，具有其特性(如大小，幾何學和極性)相當于天然脫輔基蛋白質(zhì)的兩親性α-螺旋的一個或多個兩親性區(qū)域的其它分子可被認為是脫輔基蛋白質(zhì)的變異體。然而，通過參考它們所屬的那些化合物類別來考慮包含適宜兩親性區(qū)域的各種非脫輔基分子則更加方便。這些類別中最通用的一個是能形成一個兩親性螺旋或多個兩親性螺旋的天然或合成肽和蛋白。鑒于形成螺旋的氨基酸的側(cè)鏈的性質(zhì)和構(gòu)型，兩親性螺旋具有疏水面和親水面。在A類兩親性螺旋中，親水面的陽離子殘基靠近疏水面，陰離子殘基遠離疏水面。在R類兩親性螺旋中，親水性構(gòu)型被逆轉(zhuǎn)，這樣親水面的陰離子殘基靠近疏水面，陽離子殘基遠離疏水面。天然脫輔基蛋白質(zhì)包含A類兩親性螺旋ApoA-1具有8個。由于這個原因，包含一個或多個A類兩親性螺旋的化合物是優(yōu)選的。在肽或蛋白質(zhì)的右手α-螺旋中，一圈由3.6個氨基酸構(gòu)成。每圈的高度為5.4埃，這樣由18個氨基酸組成的α-螺旋的長度為27埃。15個氨基酸的α-螺旋的長度為22.5埃。該α-螺旋的肽骨架圍繞直徑為約5埃(±0.5埃)的理論上的圓柱體的表面(大約為環(huán)形截面)?？紤]氨基酸殘基的向外凸出的側(cè)鏈，圓柱體的直徑為約5-8埃。可能為極性、帶電或不帶電的側(cè)鏈伸出幾乎垂直于圓柱體的長軸。約一半的圓柱體表面被帶電和極性氨基酸殘基所覆蓋，另一半被非極性殘基覆蓋。如上所述，兩親性α-螺旋(A類或R類，視情況而定)具有平行朝向圓柱體軸的相反極性和非極性面?？捎糜诒景l(fā)明的肽和蛋白質(zhì)包括公開在EP-A-0162414和US-A-4643988中的那些，其中它們的內(nèi)容以法律所允許的最大程度被本文引作參考。能形成兩親性螺旋的優(yōu)選肽和蛋白質(zhì)包含序列A1-B1-B2-C1-D-B3-B4-A2-C2-B5-B6-A3-C3-B7-C4-A4-B8-B9(Ⅰ)其中A1,A2,A3和A4各自獨立地代表天冬氨酸或谷氨酸或其同系物或類似物；B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8和B9各自獨立地代表色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物；C1,C2,C3和C4各自獨立地代表賴氨酸或精氨酸；和D代表絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸或組氨酸，或其同系物或類似物。這些肽顯示出導致理想化的兩親性螺旋的特異性的氨基酸殘基排列。帶負電、正電以及疏水性殘基的特異性定位對于形成兩親性螺旋非常重要，并因此對于肽的預期的功能發(fā)揮也非常重要。具有與在天然脫輔基脂蛋白中的帶電殘基定位相反的陽離子和陰離子殘基的類似物顯示出很小的或不顯示脂類相關(guān)性。在上面肽的18殘基序列中，帶正電的殘基(式Ⅰ中的“C”組)應(yīng)在位置4,9,13和15，帶負電的殘基(或Ⅰ中的“A”組)應(yīng)在位置1,8,12和16。疏水性殘基(式Ⅰ中的“B”組)應(yīng)放置在位置2,3,6,7,10,11,14,17和18。殘基絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸或組氨酸優(yōu)選在位置5(“D”)。選擇用來占據(jù)特殊功能位置(如帶正電位置)的特異性殘基可發(fā)生變化，只要不對肽活性產(chǎn)生過分不利影響。例如，在其中需要帶負電殘基的序列的任何位置可將帶負電殘基天冬氨酸和谷氨酸互換。類似地，賴氨酸或精氨酸可排列在任何帶正電位置。優(yōu)選的疏水性殘基為色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和α-萘基丙氨酸。在一些優(yōu)選的肽中，許多疏水性殘基位置被α-萘基丙氨酸占據(jù)。尤其優(yōu)選的具體實例包括序列為下面的那些Asp-Trp-αNal-Lys-Ala-Phe-αNal-Asp-Lys-αNal-Ala-Glu-Lys-αNal-Lys-Glu-Ala-Phe(18naA)；或Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2(Ac-18A-NH2).該后一序列為Venkatachalapathi等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學15349-359(1993)的主題，它們的內(nèi)容在被法律所允許的最大程度上被本文引作參考。相應(yīng)的未封閉的肽18A也是優(yōu)選的化合物。采用的氨基酸可為天然存在的形式，或者可采用顯示所需意外特性的合成氨基酸。例如，合成的氨基酸α-萘基丙氨酸比任何天然存在的氨基酸都顯示出更大程度的疏水性，并在本發(fā)明的肽中特別有用。類似地，被取代的氨基酸二甲基賴氨酸比未取代的賴氨酸帶正電更多，并在一些具體實例中是優(yōu)選的。因此，還考慮到在目標肽中天然存在的氨基酸的有用的類似物或同系物的取代。D-或L-型氨基酸均適宜用于本發(fā)明。D-氨基酸的一個可能的優(yōu)點是在腸道中包含它們的肽和蛋白質(zhì)的酶解趨勢降低。如上所預測，C-或N-末端氨基酸可被以非干擾方式適當?shù)剡M行封閉或以其它方式衍生化；例如N-末端氨基酸可被乙酰化，C-末端氨基酸可被酰胺化。如在優(yōu)選肽Ac-18A-NH2中以這種方式封閉的N-和/或C-末端可在脂類存在的情況下穩(wěn)定α-螺旋。雖然上述優(yōu)選肽的功能性兩親性螺旋由18個氨基酸的序列組成，但在基本上不影響螺旋形成能力的情況下，可向18殘基肽的任一末端增添氨基酸。例如，在堿性兩親性肽鏈的各個末端可加上一個延伸三肽以將螺旋末端的作用減至最小。多個兩親性螺旋區(qū)也可證實是有用的。由例如脯氨酸連接的兩個18殘基肽組成的37殘基肽也顯示出與磷脂形成盤狀復合物并替代來自HDL的天然脫輔基蛋白的能力。然而，對于目前方案，總體看來這種18殘基單元對于形成適當?shù)穆菪侵匾摹＠缭谛蛄械牡?0位的氨基酸缺失將導致極性-非極性界面旋轉(zhuǎn)100°，并導致本質(zhì)上缺乏替代來自HDL的天然脫輔基質(zhì)蛋白質(zhì)能力的肽。然而，存在其中兩親性螺旋的一部分(如殘基A4-B8-B9)缺失的有用和功能性的分子。一個實例為Ac-15A-NH2，它包含Ac-18A-NH2的15個N-末端氨基酸，且其結(jié)構(gòu)如下Ac-lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-lys-Glu-Ala-Phe-NH2(Ac-15A-NH2)如在刷狀緣膜小泡模型中所測得，Ac-15A-NH2具有Ac-18A-NH2的油酸膽固醇酯攝取抑制活性的85％?？赏ㄟ^任何目前可用來合成簡單和復雜低分子量蛋白質(zhì)的方法來合成上述肽。一般來說，這些方法包括通過連續(xù)加入氨基酸的逐步產(chǎn)生較大分子的逐步合成法。通過一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間的縮合以形成肽鍵來將氨基酸連在一起。為控制這些反應(yīng)，必須封閉一個氨基酸的氨基和另一個的羧基。選擇封閉基團應(yīng)易于被去除而對多肽沒有不利影響，不會產(chǎn)生外消旋化或所形成肽鍵的水解。一些氨基酸具有另外的功能性基團，例如酪氨酸的羥基。通常必須用容易被去除的封閉劑來封閉這些另外的基團，這樣它不干擾用于形成肽鍵的所希望的縮合作用?，F(xiàn)有許多用于合成多肽的方法，并且也提出了許多封閉劑。這些方法大部分適用于本發(fā)明的肽。目前優(yōu)選的用于合成目標肽的方法為Merrifield方法。在此方法中，一個氨基酸以酯鍵與樹脂顆粒結(jié)合，通過向生長鏈中連續(xù)加入被保護的氨基酸以逐步合成的方式來產(chǎn)生肽。這種一般方法已為人熟知，并被描述于許多文章中，例如Merrifield,R.B.美國化學協(xié)會雜志(J.Amer.Chem.Soc)962986-2993,(1964)。然而，已知方法的改進通過用甲酸替代作為酸供體的轉(zhuǎn)移氫化方法從固體載體釋放肽避免了通常的HF步驟。該方法導致了幾乎是純肽的釋放以及保護基團從賴氨酸的ε-NH2基，芐基酯從酪氨酸中釋放。本發(fā)明設(shè)計的另一可能性是例如通過本領(lǐng)域已知的方法，通過非肽鍵的氨基酸殘基連接，該方法有可能導致腸中的酶水解降低。更概括地說，用于本發(fā)明的天然脫輔基蛋白質(zhì)可通過從天然來源(如血清)中分離，或通過其它方法來制備，如重組DNA技術(shù)或上面討論的肽合成法。脫輔基蛋白質(zhì)優(yōu)選但不必須被分離成為蛋白質(zhì)勻一性的(即意味著在制備物中不存在其它蛋白質(zhì))；而且，它們可以但不必須被分離成為完全勻一性的(即意味著根本不存在顯著量的其它分子)。分離至蛋白質(zhì)勻一性可能是最佳方案，因為一些脂類將在體內(nèi)自然地與脫輔基蛋白質(zhì)結(jié)合。確實，已發(fā)現(xiàn)apoA-1的脂化形式比脫脂形式更具活性，并且其由于此原因而被優(yōu)選。脂化可以是天然的，在這種情況下脫輔基蛋白質(zhì)可以其天然的脂蛋白等同物的形式來給藥。然而，部分脂化(或脫脂)的脫輔基蛋白質(zhì)或用另一種方式脂化(以非天然脂蛋白模式結(jié)合)的脫輔基蛋白質(zhì)也可能是有用的。重組DNA技術(shù)可能用來在任何適宜的宿主中產(chǎn)生脫輔基蛋白。如下面的代表性而非窮舉性列表所示，一些脫輔基蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)和DNA序列已被確定大鼠apoD:Spreyer等，EMBOJ9(8)2479-2484(1990)；大鼠apoA-4:Bogusli等，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA81(16)5021-5025(1984)；大鼠apoA-1:Boguski等，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA82992-996(1985)；人apoE(ε-4等位基因)Das等，生物化學雜志260(10)6240-6247(1985)人apoE(ε-2和ε-3等位基因)Zannis等，生物化學雜志259(9)5495-5499(1984)；人apoC-2:Wei等，生物化學雜志260(28)15211-15211(1985)和(erratum)261(8)3910(1986)；人apoB-100:Knott等，科學230(4721)37-43(1985)；人apoA-1:Shoulders等，核酸研究11(9)2827-2837(1983)；人apoC-3:Protter等，DNA3(6)449-456(1984)；人apoA-4:Elshourbagy等，生物化學雜志262(17)7973-7981(1987)；及人apoA-2:Knott等，核酸研究13(17)6387-6398(1985)。更全面的參考文獻可使用“apo”路徑從NIHENTREZ分子生物學數(shù)據(jù)庫中獲得。現(xiàn)有的序列信息應(yīng)能使得通過標準方法克隆任何仍未克隆的脫輔基蛋白質(zhì)的基因(如cDNA或基因組)。重組脫輔基蛋白質(zhì)、其它蛋白質(zhì)或肽的表達可在任何適宜宿主中進行，無論微生物(如細菌，例如大腸桿菌，或真菌，例如釀酒酵母)，昆蟲或哺乳動物。取決于所采用的宿主，任何翻譯后修飾(如糖基化)的性質(zhì)和程度可能是天然的，不同于天然的或不存在。任何功能性脫輔基蛋白質(zhì)，無論是否被按天然方式進行了翻譯后修飾，均可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的實踐中可用一種或多種不同分子給藥。事實上，如果用一些天然的脂蛋白(包括乳糜微粒，乳糜微粒殘余物，VLDL,IDL,LDL和HDL)，將存在一種以上類型的脫輔基蛋白質(zhì)；例如，如上所述，在用HDL時，可一起施用apoA-1和apoA-2，在用乳糜微粒時，可一起施用apoA-1,A-2,A-4和B-48。應(yīng)理解本發(fā)明不局限于肽和蛋白質(zhì)的用途。而且，本發(fā)明包括具有適宜大小、幾何學和極性，或具有如此的一個區(qū)域的任何分子的用途。合成肽模擬物或其它有機分子可能是有用的，如可以是基于糖、脂類或其它生物單位的分子?？捎糜诒景l(fā)明的分子通常與藥物學或獸醫(yī)學可接受的載體結(jié)合而配制以通過任何方便的途徑給藥。該制劑構(gòu)成了本發(fā)明的第三個方面。用于胃腸外給藥的制劑通常將是無菌的。適用于胃腸外給藥的藥物制劑包括可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得制劑與預期的接受者的血液等滲的溶質(zhì)的含水和不含水的無菌注射溶液，可能包含懸浮劑和增稠劑的含水和不含水的無菌懸浮液也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該制劑可存在于單劑或復劑容器中。例如密封的安瓿瓶或管形瓶中，并且可貯存在僅需要在使用前立即加入無菌液體載體例如注射用水的凍冷干燥(冷干)的條件下。可從無菌粉劑、顆粒劑和片劑來制備即時用注射溶液和懸浮液。然而，優(yōu)選可用于本發(fā)明的分子經(jīng)腸道給藥，尤其是口服，因為它們在本發(fā)明中的作用是防止或至少抑制從腸道的攝取?？诜推渌c道制劑不需要為無菌的，可以單劑或多劑形式存在?？诜苿┛蔀楣腆w形式，如粉劑，粒劑，片劑，膠囊劑(如硬或軟明膠膠囊劑)或錠劑，或液體劑，如糖漿或酏劑。填料和/或載體可在適當時存在，藥物制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員將能提供這些另外或其它可能為必需或所需的賦形劑；芳香劑為一個實例。打算口服給藥的任何制劑可配制成腸抗性的，以便通過避免或減輕脫輔基蛋白在胃或小腸近端的消化來輔助運輸至小腸。片劑或膠囊劑可例如通過常規(guī)方法進行腸衣包被。液體制劑可通過包含有或與適宜的試劑如中等鏈甘油三酯共同給藥來有效地提供腸抗性。非口服組合物的經(jīng)腸組合物包括可為拴劑形式的直腸組合物。拴劑通常包括拴劑基質(zhì)，如可可脂。包含活性成分的特殊制劑可通過藥物制劑領(lǐng)域技術(shù)人員按常規(guī)制備。在預防或治療中給藥的脫輔基蛋白質(zhì)或其它活性分子的量將受醫(yī)生或臨床大夫的控制。常規(guī)臨床試驗可確定最佳水平。本發(fā)明僅要求給藥量是有效的。然而，作為參考，體外實驗表明應(yīng)給予足夠量的脫輔基蛋白質(zhì)(以脫輔基蛋白質(zhì)A-1計)以提供腸中局部濃度1-5μM；在此基礎(chǔ)上，可給予1-10μMapoA-1，最佳值可能在2-5μM范圍內(nèi)。其它活性成分可以在上面的范圍內(nèi)或以確定為有效和能良好耐受的其它劑量來進行給藥。本發(fā)明可用于預防或治療任何起因的高膽固醇血癥或其它高脂血癥，無論是家族性的或飲食誘導的?？诜o藥對于兩者可能是優(yōu)選的。因此本發(fā)明提供對動脈粥樣硬化的可口服(或其它經(jīng)腸途徑)給藥的治療或預防。由于膽固醇的提供取決于內(nèi)源膽固醇的生物合成與從腸道外源膽固醇的攝取之間的平衡，同時給予膽固醇生物合成抑制劑可能是適宜的。甚至可將膽固醇生物合成抑制劑與可用于本發(fā)明的脫輔基蛋白質(zhì)或其它分子共同配制，但這不是必需的它可被分別或依次給藥，這樣它可通過包括上面討論的那些的任何常規(guī)方法獨立配制。根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供在高膽固醇血癥，或其它高脂血癥的預防或治療以及預防或治療肥胖中用于混合、分別或依次給藥的包含如上定義的具有兩親性區(qū)域的分子和膽固醇生物合成抑制劑的產(chǎn)品。膽固醇生物合成抑制劑可為HMG-CoA還原酶抑制劑。抑制素為這些化合物的實例。尤其有意義的HMG-CoA還原酶抑制劑包括天然發(fā)酵產(chǎn)物密實菌素(compactin)和mevinolin(也稱為洛伐他汀)、二氫密實菌素，二氫洛伐他汀，eptastatin，公開在US-A-4293496中的mevinolin的半合成類似物及公開在US-A-4444784,US-A-4661483,US-A-4668699和US-A-4771071的化合物(包括西伐他停)以及公開在WO-A-9100280和WO-A-9115482中的那些作為一些實例。適當時可使用一種或多種膽固醇生物合成抑制劑。如果需要，可存在或至少另外施用膽汁酸螯合物，如膽甾胺。然而，由于本發(fā)明優(yōu)點之一是可避免或至少減少它們的應(yīng)用，因此這些試劑通常不存在。本發(fā)明各個方面的優(yōu)選的特征對于其它各個方面也是優(yōu)選的，反之亦然。本說明書中參考的所有專利或文獻資料在此被以法律允許的最大限度地引作參考。本發(fā)明現(xiàn)將通過下面的實施例來說明。實施例使用各種縮寫，其含義如下apoA-1脫輔基脂蛋白A-1(或A-Ⅰ)apoA-2脫輔基脂蛋白A-2(或A-Ⅱ)BBM刷狀緣膜BBMV刷狀緣膜小泡DMPC二肉豆寇酰磷脂酰膽堿EDTA二乙胺四乙酸二鈉鹽FH家族性高膽固醇血癥HDL高密度脂蛋白LDL低密度脂蛋白PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳PC磷脂酰膽堿rpm每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)SDS十二烷基硫酸鈉SUV單層小泡TCA三氯乙酸Tris三[羥基甲基]氨基甲烷實施例還提到附圖，其中圖1表明部分純化的甾醇攝取抑制劑蛋白在PBE94上的層析聚焦。條件描述在實施例1中。在級分28洗脫活性峰。用PierceBCA*蛋白分析試劑測定蛋白濃度。正方形代表蛋白質(zhì)的量，菱形代表抑制活性。圖2表明實施例1中描述的從PBE94柱中洗脫的級分的SDS15％PAGE凝膠圖。根據(jù)制造商的說明，在Mini-ProteanⅡDualSlabCell中進行電泳。銀染凝膠。在凝膠的每一側(cè)，標準蛋白的電泳遷移率與它們的分子量(kDa)一起給出。Ap用于PBE94柱的部分純化的甾醇攝取抑制劑蛋白。FT通過級分的流速。11-42從PBE94柱中洗脫的級分。存在于各泳道中的在45和66K之間的雙帶為人為銀染物。圖3棒狀直方圖顯示在實施例3中描述的條件下，脫輔基蛋白質(zhì)A-1的不同形式對從包含1mol％放射性標記的膽固醇作為供體及兔BBMV作為受體的卵PCSUV中攝取膽固醇的影響。棒條表示相對于缺乏抑制時的膽固醇攝取的膽固醇攝取的抑制百分數(shù)。由頂端的黑色棒條給出三次不同測定的標準偏差。ApoA-Ⅰ人脫輔基蛋白質(zhì)A-1。ApoA-1/DMPC重新?lián)饺隓MPC雙層的人脫輔基蛋白質(zhì)A-1(2.5mgDMPC/mgapoA-1)。Fr.28-PBE94在PBE94層析聚焦柱的級分28中洗脫出的純化的抑制劑。HDL3密度d=1.125-1.21g/ml的人高密度脂蛋白。圖4A表明從包含1mol％油酸膽固醇酯和痕量[3H]-膽固醇油酰醚的卵PCSUV作為供體及兔BBMW作為受體油酸膽固醇酯的攝取對抑制劑蛋白遞增量的劑量應(yīng)答。菱形由于人脫輔基蛋白質(zhì)A-1的抑制。正方形由于fr.28-PBE94的抑制。誤差棒條表明三次獨立測定的標準偏差。圖4B以類似于圖4A的方式表明作為遞增濃度的人apoA-1、人apoA-2和羊HDL函數(shù)的抑制效果。圖5表明在不存在抑制劑(●)和存在60μMAc-18A-NH2(■)時，由正常人十二指腸制備的BBMV對膽固醇的攝取。將包含1mol％[14C]膽固醇的0.01mg脂類/ml的磷脂小泡和為0.25mg脂類/mL的BBMV一起保溫，并如實施例7所描述的測定膽固醇的攝取。將Ac-18A-NH2加入至供體和受體小泡的懸浮液中。數(shù)據(jù)點代表3次測定的平均值±標準偏差。虛線代表單指數(shù)計算機配合。圖6表明增加Ac-18A-NH2濃度對正常(●)和無β脂蛋白(O)BBMV的蛋白介導的膽固醇攝取的影響。在存在遞增濃度的Ac-18A-NH2時，使用天然和蛋白酶K處理的BBMV來測定從磷脂小泡的[14C]膽固醇的攝取。通過天然和蛋白酶K處理的BBMV的膽固醇攝取之間的差異被稱為蛋白質(zhì)介導的膽固醇攝取。實驗條件如實施例7中所描述；保溫時間為20分鐘。正常BBMV的數(shù)據(jù)點代表3次測定的平均值±標準偏差，虛線代表由根據(jù)Rodbard等，酶學方法373-22(1975)的實驗數(shù)據(jù)擬出的曲線。實施例材料葡聚糖硫酸鈉，PhenylSEPHAROSE6FastFlow(lowsub),SEPHADEXG-50,PBETM94和POLYBUFFER74購自Pharmacia(Dubendorf，瑞士)，卵PC和二肉豆蔻酰PC購自LipidProducts(Nutfield,UK)，小鼠單克隆抗人脫輔基脂蛋白A-1抗體(未偶聯(lián))及BCATM蛋白質(zhì)分析試劑購自Pierce(Lausanne，瑞士)，膽固醇(純度≥99％)和?；悄懰徕c(純度≥97％)購自Fluka(Buchs，瑞士)，油酸膽固醇酯(純度≥98％)，油酸(純度≈99％)和羊抗小鼠免疫球蛋白G(與堿性磷酸酶偶聯(lián)的)購自Sigma(Buchs，瑞士)，使用的所有放射性化學物質(zhì)購自Amersham(Bucks,UK)，聚丙烯ECONO-COLUMNSTM(0.7*4cm)，MINI-PROTEINⅡDualSlabCell，低分子量標準物和30％丙烯酰胺/bis溶液購自BioRad實驗室(Glattbrugg，瑞士)。所有其它化學品為現(xiàn)有最好的質(zhì)量。水總是雙蒸餾水。冷凍羊血清從Basle免疫研究所(Basle，瑞士)獲得并在使用前在-80℃下貯存。人脫輔基蛋白質(zhì)A-1和A-2及人HDL3是賓西法尼亞醫(yī)學院(費城，PA,USA)M.C.Phillips博士的贈品。實施例1膽固醇攝取抑制劑的分離在使用包含1mo1％[3H]-膽固醇的卵PCSUV作為供體和兔BBMV作為受體的交換反應(yīng)中測定甾醇攝取活性的抑制。根據(jù)Hauser等生物化學生物物理學雜志602567-577(1980)制備兔BBMV。通過如前面描述的(Thurnhofer等，生物化學生物物理學雜志1024249-262(1990))，將脂類分散體在Tris/NaCl(50mMTris,pH=7.4,150mMNaCl,0.2％NaN3)中進行頂端超聲破碎來制備分別包含痕量膽固醇和膽固醇油醇醚的卵PC的SUV。4℃下，將在Tris/NaCl中的供體和受體分散體在BeckmanAIRFUGETM中以100000g離心2分鐘。受體分散體產(chǎn)生一沉淀，該沉淀被用Tris/NaCl重新懸浮至1.7mg蛋白/ml的最終濃度并在相同緩沖液中變化抑制活性的量。在起始時將該懸浮液與供體分散體的上清(頂端80％)的等分試樣混合?；旌衔镏械墓w的最終濃度為0.2mg總脂類/ml。25℃下，將混合物保溫20分鐘，通過用兩體積的Tris/NaCl稀釋樣品來終止交換反應(yīng)，通過4℃下，在airuge中以100000g離心2分鐘來分離供體和受體。在BeckmanLS7500閃爍計數(shù)器中測定包含供體小泡的上清和包含BBMV(受體)的沉淀中的放射活性。結(jié)果以與在不存在抑制活性時的攝取相比，在存在抑制活性時受體攝取的甾醇的百分數(shù)來表示。從羊血清中分離抑制活性。如下用葡聚糖硫酸鹽將血清進行分級分離室溫下將100ml血清解凍，并與0.5ml10％葡聚糖硫酸鈉的0.15MNaCl溶液和5ml1MMaCl2溶液混合。除非另有說明，所有操作均在室溫下進行。沉淀立即開始并通過將樣品以6000rpm離心10分鐘完成沉淀過程，產(chǎn)生上清S1和沉淀P1。回收S1，并加入6ml10％葡聚糖硫酸鹽溶液和15ml1MMnCl2。將混合物保溫2小時，接著以20000g離心30分鐘。輕輕倒出上清(S2)。通過用50ml包含0.1％葡聚糖硫酸鹽和0.1MMnCl2的Tris/NaCl重新懸浮并如上進行離心來洗滌沉淀(P2)。棄去上清(S3)，將沉淀(P3)用10ml包含1％NaCl的2％檸檬酸鈉來分散，并在攪拌下滴加1MNaOH將pH調(diào)至8。將渾濁分散體的6000rpm離心10分鐘以除去MnO?；厥丈锨?S4)。將P1用2ml10％NaHCO3重新溶解。形成MnCO3，并通過在MSE旋轉(zhuǎn)離心機中以500g離心2分鐘將它除去?；厥丈锨?S5)，并通過加入100ml50mMTrispH7.4和2.5ml2MMgCl2將其沉淀，以6000rpm離心10分鐘。將沉淀(P6)用2ml5％NaCl重新懸浮并如上重新沉淀兩次。將最終的沉淀(P7)用1.5ml10％檸檬酸鈉重新懸浮并對包含1％NaCl的TrispH7.4進行透析以除去Mg2+。將S2，S4和透析過的P7對1％BaCl2,1％NaCl進行透析，以6000離心10分鐘以除去沉淀的葡聚糖硫酸鋇鹽并對Tris/NaCl進行透析。測定蛋白濃度及抑制活性，結(jié)果總結(jié)于表1中。表1表1-注解。羊血清葡聚糖硫酸鹽分級分離如本實施例上面所描述的，將羊血清用葡聚糖硫酸鹽依次進行分級分離。用PierceBCATM蛋白質(zhì)分析試劑測定蛋白濃度。抑制活性定義為相對于在不存在抑制劑時的攝取，在存在抑制劑時由受體攝取的甾醇的百分數(shù)，并且以任意單位(au)來表示。括號中的值為該量相對于羊血清的百分數(shù)。通過疏水作用層析進一步純化包含最大抑制活性的S4。將柱(內(nèi)經(jīng)=2.8cm)用40mlPhenylSepharose6FastFlow填裝，并平衡在包含2MNaCl的50mMTrispH7.4中。在整個層析實驗中使用4ml/分的流速。將足夠的固體NaCl加入S4(600mg蛋白)以達到2MNaCl的濃度。將流過蛋白用相同緩沖液洗脫。然后將NaCl濃度降至0.15M(級分1)洗滌該柱，并用水(級分2)和15％乙醇(級分3)來進行洗脫。測定蛋白濃度和抑制活性，結(jié)果總結(jié)在表2中。表2表2-注解。S4的疏水作用層析將從羊血清的葡聚糖硫酸鹽分離獲得并富含甾醇攝取抑制活性的級分S4進一步通過如本實施例上面描述的在PhenylSepharose6FastFlow上的疏水作用層析來進行純化。用PierceBCA*蛋白質(zhì)分析試劑來測定蛋白濃度。抑制活性以相對于不存在抑制活性時的攝取，在存在抑制活性時由受體攝取的甾醇的百分數(shù)來定義并以任意單位(au)來表示。括號中的值為該量相對于級分S4的百分數(shù)。級分2最后通過層析聚焦純化。柱(內(nèi)徑≈1cm)用20mlPBE94裝填，并平衡在25mM咪唑-HClpH7.3中。在整個層析實驗中使用0.5ml/分的流速。將級分2(34mg蛋白)上柱，洗滌柱直至280nm的吸光率達到基線(級分PBE-FT)。將蛋白用通過將POLYBUFFER74用水以1∶8稀釋并用HCl平衡在pH=4.0而產(chǎn)生的線性pH梯度來進行洗脫。收集8ml的各級分。在確定級分的蛋白和抑制活性之前，通過向2.0ml填裝在用Tris/NaCl平衡的聚丙烯ECONO-COLUMN中的SEPHADEXG-50中加入0.5ml級分來除去Polybuffer74。蛋白和抑制活性的回收分別為100％和82％(圖1)。如圖2所示，通過SDS-PAGE分析各級分。實施例2被純化的抑制劑鑒定為脫輔基蛋白質(zhì)A-1從如實施例1描述的PBE94柱獲得的級分28(fr.28-PBE94)的物理特性總結(jié)在表3中。表3表3-注解。被純化的抑制劑(fr.28-PBE94)的一些物理特性測定了fr.28-PBE94的等電點，即為從PBE94柱洗脫的pH，通過SDS-PAGE或質(zhì)譜法(MS)測定了分子量。這里包括了從Chapman,AcademicPress,Inc.SanDiego,NewYork,Roston,London,Sydney,Tokyo,Toronto70-143(1986)獲得的人和兔apoA-1的數(shù)值以用于比較。由于仍未報導羊apoA-1的特性，所以這里報導了人和兔apoA-1的物理特性以用于比較(Chapman.AcademicPress,Inc.SanDiego,NewYork,Boston,london,Sydney,Tokyo,Toronto70-143(1986))。將Fr.28-PBE94進行N-末端氨基酸分析。fr28-PBE94的頭29個氨基酸的79.3％與大鼠apoA-1相同，69.0％與兔apoA-1相同，86.2％與牛apoA-1相同及65.0％與人apoA-1相同。在蛋白質(zhì)印跡實驗中，F(xiàn)r.28-PBE94與小鼠單克隆抗人apoA-1抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。Fr.28-PBE94被顯示包含0.26mg總膽固醇(游離和酯化)/mg蛋白，在密度d=1.21g/ml的NaBr溶液離心時浮起。這是高密度脂蛋白的漂浮密度。在將fr.28-PBE94根據(jù)Nichols等(Nichols等，生物化學生物物理學雜志446226-239(1976))進行鹽酸胍處理后，fr.28-PBE94被脫脂，顯示出與人apoA-1相同的行為。為了證明抑制活性的確是由于蛋白質(zhì)的緣故，將Fr28-PBE94和作為對照的人apoA-1用10％三氯乙酸沉淀或經(jīng)過四次煮沸5分鐘并在冰上冷卻5分鐘的循環(huán)。離心除去變性的蛋白，測定留在上清中的蛋白和抑制活性(表4)。表4表4-注解。抑制活性的變性通過暴露于10％TCA或經(jīng)如本實施例中所描述的4次煮沸/冷卻循環(huán)將抑制活性變性。這里產(chǎn)生的結(jié)果以在用離心除去變性蛋白后留在上清中的蛋白和甾醇攝取抑制活性的百分數(shù)來表示。實施例3apoA-1和apoA-2對兔BBMV膽固醇攝取的影響在存在人apoA-1、重新?lián)饺氲紻MPC雙層中的人apoA-1(2.5mgDMPC/mgapoA-1)、fr28-PBE94和人HDL3各20μg時，如實施例1所描述測定兔BBMV從作為供體的SUV中攝取的膽固醇(游離或酯化的膽固醇)圖3為顯示在存在下面物質(zhì)時的膽固醇攝取被抑制的棒形直方圖(a)人apoA-1；(b)根據(jù)Brouillette和Anantharamaiah，生物化學生物物理學雜志1256103-109(1995)；從人apoA-1和DMPC(1∶25=重量比)重新組成的脂蛋白復合物；(c)如上面實施例1所述純化的羊apoA-1；和(d)密度范圍為d=1.125-1.21g/ml的人HDL3。在25℃下，在不存在和存在抑制劑時，使用包含1mol％放射性標記的膽固醇的卵PC的SUV作為供體和兔小腸BBMV作為受體來測定膽固醇的攝取。將分散在50mMTris緩沖液pH7.4,0.15mNaCl,0.2％NaN3中的供體和受體混合至最終濃度分別為0.05mg總脂類/ml和1.7mg蛋白/ml。在所有這些樣品中的apoA-1的量保持恒定在20μg蛋白/ml。存在apoA-1時的抑制以占不存在抑制劑時測得的膽固醇攝取的百分數(shù)來表示。各個棒條頂端的黑色部分代表三次測定的標準偏差。圖4A表明在存在遞增量的fr.28-PBE94(正方形)和人apoA-1(菱形)時，甾醇攝取的抑制。如實施例1中所述制備作為供體的包含1mol％油酸膽固醇酯和痕量[1,2-3H2(N)]-膽固醇油醇醚(37ci/mmol，來自Amersham,UK)的卵磷脂酰膽堿的小單層小泡，作為受體的BBMV從兔小腸制備(參見實施例1)。在起始時將分散在Tris/NaCl緩沖液(0.05MTrisHClpH7.4,0.15MNaCl,0.02％NaN3)中的供體和受體和人apoA-1或羊HDL的相同緩沖液溶液混合(總體積0.1ml)，這樣供體和受體的最終濃度分別為0.05mg/ml總脂類和1.7mg蛋白/ml。在25℃下，在存在抑制劑時，將供體和受體的懸浮液保溫20分鐘，通過用2體積Tris/NaCl緩沖液稀釋來終止反應(yīng)。4℃下，通過在airfuge中以115000g離心2分鐘分離供體和受體，在BECKMANTMLS7500閃爍計數(shù)器中測定包含供體小泡的上清和包含BBMV的沉淀的放射活性。通過脫脂(Scanu和Edelstein，分析性生物化學(Anal.Biochem)44576-588(1971))和在Q-SepharoseTM上離子交換層析(Weisweiler，臨床化學雜志169249-254(1987))從人HDL制備純?nèi)薬poA-1和apoA-2。用8-25％梯度凝膠的SDS-PAGE，使用PHASTTM電泳系統(tǒng)(來自Pharmacia)檢查apoA-1和apoA-Ⅱ的純度。在過載的凝膠上兩種蛋白產(chǎn)生一條帶。使用前，將蛋白溶解在3M鹽酸胍中并對Tris/NaCl緩沖液透析。圖4B顯示作為遞增濃度的人apoA-1、人apoA-2、羊HDL和人LDL函數(shù)的抑制劑效果。實驗條件如圖4A所描述。將不存在抑制時測得的BBMV的膽固醇攝取活性作為100％，在存在抑制劑時的觀察到的活性的損失以％表示。通過Rodbard和Frazier(酶學方法373-22(1975)的方法擬合實驗點，產(chǎn)生實線。羊HDL(◆)，人apoA-1(■)，人apoA-2(△)，羊LDL(▲)。IC50為觀察到50％抑制時的抑制劑濃度。IC50值來自圖4B顯示圖的曲線擬合，并示于下表5中表5抑制劑IC-50(μg/ml)羊HDL17apoA-Ⅰ25apoA-Ⅱ66LDL143實施例4兔BBMV與apoA-1預保溫的效果為了證明甾醇攝取的抑制不是簡單地由于apoA-1(無脂類或部分脫脂形式的Fr.28-PBE94)與供體的相互作用，將兔BBMV以1.7mg蛋白/ml與0.46μM人apoA-1或0.59μMfr.28-PBE94一起保溫5分鐘。4℃下，將分散體在Beckmanairfuge中以100000g離心2分鐘，除去上清，并將包含兔BBMV沉淀和結(jié)合的抑制劑蛋白重新懸浮在等體積的Tris/NaCl中。加入供體SUV，如實施例2所述測定膽固醇的攝取。測定在存在0.46μM人apoA-1或0.59μMfr.28-PBE94時的攝取抑制作為對照。在攝取測定之前暴露于抑制劑蛋白的兔BBMV保留在對照樣品中測得的抑制劑活性的30±4％。實施例5使用混合的膽汁鹽微團為供體的甾醇攝取的抑制由于膽汁鹽微團是小腸中最重要的脂類載體，使用混合的膽汁鹽微團作為供體測定甾醇攝取抑制是有意義的。如下制備由50mM牛磺膽酸鹽，6mM油酸和20μM放射性標記的膽固醇組成的供體微團將脂類以這些濃度混合在2∶1氯仿甲醇中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑。高真空下將產(chǎn)生的脂膜干燥至少1小時。將干燥的膜分散在適量的Tris/NaCl中以產(chǎn)生所需的微團濃度。將如實施例2所述制備的受體兔BBMV與1.56μM人apoA-1或1.98μMfr.28-PBE94混合。將供體混合微團加入受體/抑制劑分散體中至最終濃度為5mM牛磺膽酸鹽，0.6mM油酸和2μM放射性標記的膽固醇中。25℃下，將混合物保溫10分鐘。通過4℃下，在Beckmanairfuge中以100000g將混合物離心2分鐘來終止反應(yīng)。測定沉淀和上清中的放射活性，如實施例2中所述評價結(jié)果。與apoA-1的保溫產(chǎn)生在相同的抑制劑濃度下，使用SUV作為供體所測得的抑制活性的12％，與fr.28-PBE94的保溫產(chǎn)生在相同的抑制劑濃度下，使用SUV作為供體測得的抑制活性的23％。實施例6各種天然和變異體脫輔基蛋白質(zhì)對刷狀緣膜油酸膽固醇酯攝取的IC50值。測定天然(人)脫輔基蛋白質(zhì)apoA-Ⅰ,apoA-Ⅱ,apoA-Ⅲ,apoA-Ⅳ,apoC-I,apoC-Ⅱ,apoC-Ⅲ1,apoC-Ⅲ2和apoE及變異體脫輔基蛋白質(zhì)Ac-18A-NH2的IC50值。Ac-18A-NH2為Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2并公開在Venkatachalapathi等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學15349-359(1993)中。起始時，在Eppendorf試管中將溶解在84.5μl緩沖液(0.05MTrispH7.4,0.15MNaCl)的適宜量的抑制劑與5μl在相同緩沖液溶液中的供體分散體和10.5μl受體分散體(即刷狀緣膜小泡(BBMV))混合。供體小泡的最終濃度為0.1mg總脂類/ml，受體的最終濃度為2mg蛋白/ml。25℃下，將產(chǎn)生的混合物保溫20分鐘，通過將60μl保溫物質(zhì)加入airfuge管中120ul冰冷緩沖液中來停止反應(yīng)。4℃下，立即在airfuge中以100000g將稀稀的分散體離心2分鐘以將BBMV與供體小泡分離。在BeckmanLS7500液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)兩份60μl供體(上清)的等分試樣以確定留在供體中的放射活性。供體小泡的制備通過將適量的脂類溶解在CHCl3/CH3OH(2∶1，體積比)中來制備包含1mol％油酸膽固醇酯和痕量的3H-膽固醇油醇醚的小單層卵磷脂酰膽堿(PC)小泡，溶解后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將溶液蒸發(fā)至干，并真空干燥殘留物。通過手搖將干燥的脂膜分散在適宜體積的緩沖液中。如Brunner等，生物化學雜志2537538-7546(1978)所描述，將脂類分散體進行頂端超聲破碎。4℃下，在airfuge中以100000g將產(chǎn)生的供體在緩沖液中的分散體離心2分鐘。離心后僅供體分散體頂部的80％被用于脂類攝取實驗。BBMV分散體的制備根據(jù)Hauser等(生物化學生物物理學雜志602567-577(1980))，從冷凍的兔小腸制備BBMV。在用于攝取實驗測定IC50之前，洗滌BBMV以除去BBM釋放的任何游離蛋白。為了此目的，在airfuge中將BBMV分散體用緩沖液以1∶1稀釋，4℃下，在airfuge中以100000g將稀釋的分散體離心2分鐘。小心倒去上清，并將沉淀重新懸浮在緩沖液中至BBMV分散體的最初體積，該分散體是均質(zhì)的。脫輔基脂蛋白溶液的制備通過將脫輔基脂蛋白溶解在3M鹽酸胍中至約1mg/ml并使用8kDa截留值的透析管將產(chǎn)生的溶液對緩沖液徹底進行透析制得脫輔基脂蛋白在緩沖液中的溶液。IC50值示于下面表6中。表6對刷狀緣膜的油酸膽固醇酯攝取的IC50值實施例7對Ac-18A-NH2的進一步實驗小泡的制備將20-30mg濕組織的來自人十二指腸的各個活檢樣品懸浮在200ul緩沖液中(12mMTris-HClpH7.2,300mM甘露醇，5mMEGTA,1mM苯甲基磺酰氟)，液氮冷凍并在使用前貯存在-80℃。通過如Booth等(柳葉刀11066-1069(1985))中詳述的Mg2+沉淀法來制備BBMV。根據(jù)Thurnhofer和Hauser(生物化學生物物理學雜志1024249-262(1990))來進行BBMV的蛋白酶K處理。蛋白酶解處理將蛋白含量和BBMV的蔗糖酶比活性降低約60％。通過頂端超聲破碎(Schulthess，生物化學334500-4508(1994))來制備小單層磷脂小泡。動力學實驗根據(jù)公開的方法(Compassi，生物化學3416473-16482(1995)和Tso等，美國生理學雜志241G487-497(1981))進行動力學實驗。(Ⅰ)室溫下保溫包含分散在10mMTris-HClpH7.2,0.15MNaCl,5mMEDTA中的含1mol％[14C]膽固醇的卵PC小單層小泡和BBMV。規(guī)定的時間間隔后，通過在Beckmanairfuge中以115000g離心2分鐘分離磷脂小泡和BBMV。通過在BeckmanLS7500液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)等分試樣來測定存在于沉淀和上清中的放射活性。如在以前研究中詳細討論的(Thurnhofer和Hauser，生物化學292142-2148(1990)；Compassi，生物化學3416473-16482(1995)和Schulthess，脂類研究雜志372405-2419(1996))，排除了卵PC單層小泡與BBMV融合作為膽固醇攝取的可能機制。(Ⅱ)類似地，室溫下保溫作為供體的包含1mol％[14C]膽固醇的卵PC單層小泡和作為受體的卵PC/卵PA(85∶15，摩爾比)的單層小泡。在規(guī)定的時間間隔后，將保溫混合物的等分試樣通過DEAESepharoseC1-CB柱過濾，其中該柱保留帶負電小泡。洗脫純卵PC運輸小泡并測定它們的放射活性。結(jié)果示于圖5中。使用適用于單指數(shù)交換反應(yīng)如下等式將實驗數(shù)據(jù)進行計算機校正X=X∞+[Xo-X∞]e-k1[(a+b)/a]t，其中XO,X和X∞分別代表在時間O,t及平衡時在供體中的被標記脂類的級分。K1為反應(yīng)的準一級反應(yīng)速率常數(shù)，a和b分別為受體和供體的脂類總和(McKay，自然142997-998(1938)和Mutsch等，生物化學252134-2140(1986)。還在存在抑制劑時進行了動力學測定；將合成肽或脫輔基脂蛋白加入作為供體和受體小泡的抑制劑。在存在遞增濃度的Ac-18A-NH2時，測定天然和蛋白酶K處理的BBMV的膽固醇攝取，天然和蛋白酶K處理的BBMV之間的膽固醇攝取的差值為圖6中的蛋白介導的膽固醇攝取。根據(jù)“酶學方法”373-22(1975)測定IC50值。結(jié)果在存在兩親性肽化合物Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH2(Ac-18A-NH2)時，測定人十二指腸BBMV的膽固醇攝取。該肽形成A類的兩親性α-螺旋，并顯示出模擬脫輔基脂蛋白A-1(apoA-1)的一些特性(酶學方法128627-647(1986))。在溶液中以及當與脂類結(jié)合時，氨基末端的?；汪然┒说孽０坊伙@示出增加肽的螺旋性(蛋白質(zhì)15349-359(1993))。Ac-18A-NH2有效地完全抑制蛋白介導的膽固醇攝取(圖3和4)。將蛋白介導的膽固醇攝取降低50％所需的Ac-18A-NH2的濃度(IC50)經(jīng)測定為23±1μM(圖6)。使用正常無β脂蛋白BBMV觀察到類似的抑制(圖6)。相反，Ac-18A-NH2對被動膽固醇轉(zhuǎn)運沒有抑制效果。在Ac-18A-NH2濃度為60μM時不能被抑制的天然BBMV的殘余膽固醇攝取活性是由于被動膽固醇攝取的緣故(圖3中的正方形)。它在實驗誤差內(nèi)與蛋白酶K處理的BBMV的膽固醇攝取相等，特征在于半數(shù)時間為6.7±1.4h。同樣，Ac-18A-NH2的無抑制效果可用蛋白酶K處理的BBMV的膽固醇攝取及磷脂小泡之間的膽固醇轉(zhuǎn)移得以說明(表7)。表A人小腸刷狀緣膜運輸小泡攝取的[14C]膽固醇及其由Ac-18A-NH2導致的抑制供體受體膽固醇攝取的半抑制(0.01mg脂/ml)(0.25mg脂/ml)數(shù)時間(*)IC50(**)卵PC小泡正常人BBMV1.0±0.2h23±1μM卵PC小泡無β脂蛋白BBMV1.1±0.2h23±3μM卵PC小泡蛋白酶K處理的正常7.4±1.2h沒有抑制BBMV卵PC小泡卵PC/卵PA小泡7.8±1.6h沒有抑制(*)平均值±4次實驗的標準偏差(參見圖1)；對于無β脂蛋白BBMV，實驗誤差是給定的。(**)將蛋白介導的膽固醇攝取降低50％所需的抑制劑濃度。誤差來自劑量應(yīng)答曲線的擬合(參見圖6)。肽Ac-Asp-Trp-Leu-Ala-Lys-Asp-Tyr-Phe-Lys-Lys-Ala-Leu-VaL-Glu-Glu-Phe-Ala-Lys-NH2無活性的觀察支持兩親性α-螺旋是決定抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)這一觀點。該肽為“雜序Ac-18A-NH2”，指它具有與Ac-18A-NH2相同的氨基酸組成，但其氨基酸序列被隨機化以消除該肽的兩親性特征。體外觀察到的抑制作用的生物相關(guān)性被體內(nèi)實驗所證實，其中該體內(nèi)實驗表明在Sprague-Dawly大鼠的小腸中的膽固醇攝取可被兩親性結(jié)構(gòu)抑制大于80％。由于ApoA-Ⅰ可從人血清以足夠的量純化，故該蛋白可加入到飲食中用作抑制劑。根據(jù)存在的實驗證據(jù)，我們提出對膽固醇攝取的抑制效果不局限于特定的兩親性分子。可能兩親性化合物的化學性質(zhì)是次要的，而化合物的幾何學和極性是主要的決定因素。這里給出的結(jié)果具有重要的意義，因為屬于生物化合物任何類型的兩親性分子，如脂類、蛋白質(zhì)或糖類可能抑制刷狀緣膜的膽固醇攝取。實施例8不同長度的兩親性螺旋肽的抑制效果測定Ac-15A-NH2,Ac-12A-NH2和Ac-9A-NH2的活性(抑制效果)。這些肽的氨基酸序列如下Ac-18A-NH2:CH3CO-DWLKAFYDKVAEKLK-EAF-NH2Ac-15A-NH2:CH3CO-KAFYDKVAEKLKEAF-NH2Ac-12A-NK2:CH3CO-YDKVAEKLKEAF-NH2Ac-9A-NH2:CH3CO-VAEKLKEAF-NH2在一個肽和另一個肽之間(從上至下)，從N-末端除去3個氨基酸。比較上面列出的四個肽在120μg肽/ml時的抑制效果。如下所描述，在存在120μg肽/ml時，測定BBMV的脂類攝取。4℃下，在Beckmanairfuge中以115000g將分散在Tirs/NaCl緩沖液中的供體和受體顆粒離心2分鐘。供體分散體產(chǎn)生一沉淀，該沉淀被重新懸浮在Tris/NaCl緩沖液中。將溶解在相同緩沖液中的變化量的抑制劑加入受體分散體中，起始時，將含或不含抑制劑的受體分散體與通過離心供體分散體而獲得的上清的頂端80％混合。供體的最終濃度為0.05mg總脂類/ml，受體的最終濃度為5mg蛋白/ml。在23℃下，保溫所產(chǎn)生的分散體，在規(guī)定的時間間隔后，通過將保溫物質(zhì)用2體積Tris/NaCl緩沖液稀釋來終止膽固醇的攝取。4℃下，通過在Beckmanairfuge中以115000g離心2分鐘分離供體和BBMV。在BeckmanLS7500閃爍計數(shù)器中測定包含供體的上清和包含BBMV(受體)的沉淀中的放射活性。結(jié)果以抑制百分數(shù)來表示，并總結(jié)在下面表8中。表8使用1號和2號肽見到了有用的抑制效果。權(quán)利要求1．包含一個或多個兩親性區(qū)域的分子在制備用于抑制從腸道攝取膽固醇或其它脂類的藥物中的用途。2．包含一個或多個兩親性區(qū)域的分子在制備用于經(jīng)腸道給藥治療或預防高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥，和/或肥胖的藥物中的用途。3．權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該分子為具有一個或多個兩親性α-螺旋的肽或蛋白質(zhì)。4．權(quán)利要求3所述的用途，其中該分子為脫輔基蛋白質(zhì)。5．權(quán)利要求4所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)A。6．權(quán)利要求5所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)的脫輔基蛋白質(zhì)A-1。7．權(quán)利要求5所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)A-2。8．權(quán)利要求5所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)A-4。9．權(quán)利要求4所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)B。10．權(quán)利要求9所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)B-48。11．權(quán)利要求9所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)B-100。12．權(quán)利要求4所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)C。13．權(quán)利要求12所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)C-1。14．權(quán)利要求12所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)C-2。15．權(quán)利要求12所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)C-3。16．權(quán)利要求4所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)D。17．權(quán)利要求4所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脫輔基蛋白質(zhì)E。18．權(quán)利要求3所述的用途，其中分子為天然脫輔基蛋白質(zhì)的變異體。19．權(quán)利要求3所述的用途，其中該肽或蛋白質(zhì)包含一個或多個，但少于8個兩親性螺旋。20．權(quán)利要求3,18或19所述的用途，其中該分子包含具有下列序列的一個或多個肽A1-B1-B2-C1-D-B3-B4-A2-C2-B5-B6-A3-C3-B7-C4-A4-B8-B9(Ⅰ)其中A1,A2,A3和A4各有獨立地代表天冬氨酸或谷氨酸，或其同系物或類似物；B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8和B9各自獨立地代表色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或類似物；C1,C2,C3和C4各自獨立地代表賴氨酸或精氨酸；和D代表絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸或組氨酸，或其同系物或類似物；及其中殘基A4,B8和B9為可存在或不存在。21．權(quán)利要求20所述的用途，其中該分子為Ac-18A-NH2或Ac-15A-NH2或其相應(yīng)的未封閉或用其它方式封閉的形式。22．權(quán)利要求4-17任一項所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)已從天然來源分離。23．權(quán)利要求22所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)已被分離至蛋白質(zhì)均一性(即意味著不存在其它蛋白質(zhì))。24．權(quán)利要求22所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)已被分離至完全均一(即意味著不存在顯著量的其它分子)。25．權(quán)利要求3-21任一項所述的用途，其中肽或蛋白質(zhì)通過重組DNA技術(shù)或肽合成法制得。26．權(quán)利要求4所述的用途，其中脫輔基蛋白質(zhì)為脂蛋白形式。27．權(quán)利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括乳糜微粒。28．權(quán)利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括乳糜微粒殘余物。29．權(quán)利要求26所述的用途，其中脂蛋白質(zhì)包括VLDL。30．權(quán)利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括IDL。31．權(quán)利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括LDL。32．權(quán)利要求26所述的用途，其中脂蛋白包括HDL。33．權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該分子包含至少其中一些通過非肽鍵連接的氨基酸殘基。34．權(quán)利要求3所述的用途，其中至少一個氨基酸為D-氨基酸。35．權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該分子為或包含一個合成的肽模擬物。36．權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該分子包含糖和/或脂部分。37．一種制劑，包含一個或多個如權(quán)利要求1-36任一項所定義的分子和藥物學或獸醫(yī)學可接受的載體，該制劑適于經(jīng)腸道給藥。38．權(quán)利要求37所述的制劑，它為單位劑量形式。39．權(quán)利要求37或38所述的制劑，它適合于口服給藥。40．權(quán)利要求37,38或39所述的制劑，它為固體形式。41．權(quán)利要求39或40所述的制劑，它被配制成腸道抗性的。42．權(quán)利要求37所述的制劑，它被配制成適于經(jīng)直腸給藥。43．權(quán)利要求37至42任一項所述的制劑，包括膽固醇生物合成抑制劑。44．權(quán)利要求43所述的制劑，其中膽固醇生物合成抑制劑為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶的抑制劑。45．權(quán)利要求44所述的制劑，其中HMG-CoA還原酶抑制劑為抑制素。46．權(quán)利要求45所述的制劑，其中抑制素為西伐他停。47．一種在預防或治療高膽固醇血癥，或其它高脂血癥和/或預防或治療肥胖中用于混合、分別或依次給藥的包含如權(quán)利要求1-36任一項所述分子和膽固醇生物合成抑制劑的產(chǎn)品。48．權(quán)利要求47所述的產(chǎn)品，其中膽固醇生物合成抑制劑為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑。49．權(quán)利要求48所述的產(chǎn)品，其中HMG-CoA還原酶抑制為抑制素。50．權(quán)利要求49所述的產(chǎn)品，其中抑制素為西伐他停。51．一種治療或預防高脂血癥或高膽固醇血癥的方法，該方法包括對病人或個體經(jīng)腸道給藥有效量的包含一個或多個兩親性區(qū)域的分子。52．一種治療或預防肥胖的方法，該方法包括對病人或個體經(jīng)腸道給藥有效量的包含一個或多個兩親性區(qū)域的分子。53．一種治療或預防動脈粥樣硬化的方法，該方法包括對病人或個體經(jīng)腸道給藥有效量的脫輔基蛋白質(zhì)。全文摘要膽固醇生物合成可被適宜的抑制劑抑制。然而,無論是家族性的或飲食誘導的高膽固醇血癥,更一般地說是高脂血癥不能僅由膽固醇生物合成抑制劑來徹底解決,因為體內(nèi)的膽固醇通過從飲食以及內(nèi)源性合成來獲得。脂類也從消化道攝取。這個問題通過提供一個或多個具有兩親性區(qū)域的分子以抑制從消化道攝取膽固醇和其它脂類來解決。也可用這種方法治療或預防肥胖以及動脈粥樣硬化。具有兩親性區(qū)域的適宜分子的實例包括天然或變異體脫輔基蛋白質(zhì)以及具有由至少約15個氨基酸組成的兩親性α－螺旋的其它蛋白和肽。文檔編號A61K45/00GK1216995SQ97194265公開日1999年5月19日申請日期1997年3月27日優(yōu)先權(quán)日1996年3月29日發(fā)明者D·博菲利,H·豪瑟申請人:D·博菲利,H·豪瑟