專利名稱：由牝馬尿獲取雌激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由妊娠牝馬的尿液中獲取一種天然結(jié)合雌激素混合物的方法。
雌激素在醫(yī)學(xué)上用于激素替代療法中。雌激素混合物尤其應(yīng)用于治療和預(yù)防婦女在自然的或人工的絕經(jīng)期后出現(xiàn)的更年期病癥。例如存在于妊娠牝馬尿液中的、天然結(jié)合雌激素混合物對(duì)此具有特別好的療效和良好的耐受性。
溶解于妊娠牝馬尿液(=妊娠牝馬(mare)尿液，以下簡(jiǎn)稱為“PMU”)中的固態(tài)物質(zhì)含量自然可以變動(dòng)于很大的范圍內(nèi)，一般來說在40-90g干物質(zhì)/升的范圍內(nèi)。除尿素和其它常見的尿內(nèi)含物質(zhì)以外，在PMU的固態(tài)物質(zhì)中所含有的酚類成份的量約為干物質(zhì)的2-5重量％。在這些酚類成份中有甲酚和稱為HPMF的二氫-3,4-雙[(3-羥基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它們可以以游離的或結(jié)合的形式存在。在PMU中含有一種天然的雌激素混合物，它基本上是以結(jié)合的形式存在，例如作為硫酸單酯-鈉鹽(以下簡(jiǎn)稱為“硫酸鹽”)。結(jié)合雌激素的含量(以雌激素硫酸鹽計(jì)算)可以為干物質(zhì)的0.3-1重量％。
通常用不可與水混溶或者僅可少量與水混合的極性有機(jī)溶劑，例如醋酸乙酯、正-丁醇或環(huán)己醇，經(jīng)過萃取由PMU獲得含有結(jié)合雌激素的提取物。但在這種液-液萃取過程中會(huì)出現(xiàn)諸多問題，譬如大量泡沫形成、沉淀形成、乳液形成和相分離差。一般來說需要進(jìn)行多個(gè)萃取步驟，從而喪失大量雌激素而僅僅獲得部分雌激素。
如果意欲處理少量尿液和漿液用以氣相色譜分離法分析測(cè)定雌激素，Heikkinnen等(臨床化學(xué)(Clin.Chem.)27/7,(1981),1186-1189)和Shackleton等(臨床化學(xué)學(xué)報(bào)(Clinica Chimica Acta)107,(1980),231-243)建議借助于柱，該柱含有包含十八烷基硅烷殘基并且經(jīng)過硅烷化的硅膠(Sep-PakRC18-柱，制造者Waters Ass.Inc.Milford,MA，美國(guó))，固相萃取雌激素。在此過程中雌激素用甲醇由柱中洗脫。但是沒有說明在含有雌激素的洗脫液中所含有的其它物質(zhì)。
本發(fā)明目的是，研究出一種由PMU獲得天然結(jié)合雌激素混合物的工業(yè)方法，同時(shí)又能避免迄今常用的液-液萃取方法中的已知缺點(diǎn)，該方法能提供一種貧化了酚類尿內(nèi)含物質(zhì)、并且基本上不含HPMF的產(chǎn)物。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種方法，應(yīng)用該方法可以在用疏水硅膠進(jìn)行固相萃取的過程中獲得一種貧化了酚類尿內(nèi)含物質(zhì)、并且基本上不含HPMF的、但卻幾乎完全保留了PMU天然雌激素含量的混合物，它可以用來作為起始物質(zhì)，用于制備含有PMU來源的天然結(jié)合雌激素混合物作為活性物質(zhì)的藥物。
獲得貧化了酚類尿內(nèi)含物質(zhì)的、PMU來源的天然結(jié)合雌激素混合物的本發(fā)明方法具備如下特點(diǎn)a) 將一種尿液，它為不含有粘液物質(zhì)和固態(tài)物質(zhì)的尿、該尿的一種濃縮液或者一種通過超濾該尿而獲得的濃縮尿滯留液，用能夠?qū)H值調(diào)節(jié)為至少12的足夠量的水溶性堿處理，接著通過添加足夠量的酸水溶液，將用堿處理過的尿液的pH值調(diào)節(jié)至5-8.5的范圍內(nèi)，b) 將用堿處理過的、pH值調(diào)節(jié)至5-8.5的范圍內(nèi)的尿液，與為了吸附尿液中所含有的結(jié)合雌激素混合物所必需的足夠量的疏水硅膠接觸，然后將負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的疏水硅膠由剩余的尿液中分離，c) 將負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的疏水硅膠，用pH值已調(diào)節(jié)至5-7的、尤其為pH5的含水緩沖液洗滌，d) 將洗滌過的疏水硅膠與為了解吸已經(jīng)吸附于其上的結(jié)合雌激素混合物所需要的足夠量的洗脫液接觸，該洗脫液為一種由水和可與水混溶的有機(jī)溶劑所組成的混合液，所述有機(jī)溶劑選自可與水混溶的醚、低級(jí)鏈烷醇和低級(jí)脂族酮，然后將含有天然結(jié)合雌激素混合物的洗脫液由疏水硅膠中分離和任選濃縮。
在本發(fā)明方法中可以應(yīng)用PMU本身、由此通過濃縮所獲得的濃縮液或者由此通過膜過濾所獲得的滯留液。將所收集的尿液首先按照本身已知的方法去除粘液物質(zhì)和固態(tài)物質(zhì)。較為合適的是使固態(tài)物質(zhì)和粘液物質(zhì)沉積，然后按照本身已知的分離方法，例如傾析法、分離法和/或過濾法將它們分離。因此例如可以將PMU引入通過本身已知的分離裝置例如分離器、過濾裝置或者沉降器。作為分離裝置可以應(yīng)用例如砂床、或者商用的分離器，例如噴嘴式分離器或者室分離器。需要時(shí)還可以應(yīng)用微濾裝置或超濾裝置，在應(yīng)用這些裝置的同時(shí)還可以達(dá)到過濾后的PMU基本上無菌無病毒。
需要時(shí)可以向尿液內(nèi)添加貯藏劑、殺(霉)菌劑、殺(細(xì))菌劑和/或驅(qū)蟲劑。
如果替代PMU應(yīng)用濃縮的PMU-滯留液，可以由PMU通過本身已知的膜過濾方法獲得之。由于所應(yīng)用的PMU的不同、膜過濾中所應(yīng)用的膜例如其孔徑的不同、以及過濾條件的不同，因此滯留液中固態(tài)物質(zhì)的含量及其組成成份也可以有所不同。例如在應(yīng)用毫微過濾膜時(shí)，可以在PMU-滯留液中近乎毫無損失地獲得雌激素濃縮液，同時(shí)又能去除高達(dá)50重量％的低分子量PMU-內(nèi)含物。在本發(fā)明方法中所應(yīng)用的PMU-滯留液可以濃縮至約1∶10的比例，例如約1∶7，并且因此其體積可以濃縮至約原PMU-體積的1/10，例如約1/7。
在方法步驟a)中，向尿液內(nèi)添加了足夠量的水溶性堿，以調(diào)節(jié)pH值為至少12，尤其是13-14。作為水溶性堿合適的有無機(jī)或有機(jī)的、溶解于尿液中的惰性堿，其堿性強(qiáng)度足以使pH值至少達(dá)到12。這樣合適的有堿金屬-或堿土金屬氫氧化物，尤其是氫氧化鈉，或者合適的還有有機(jī)堿，如季低級(jí)烷基氫氧化銨。優(yōu)選添加水溶液形式的、堿含量為至少20重量％，優(yōu)選為40-60重量％的堿。較為合適的尤其是45-55％濃度的氫氧化鈉溶液。在這個(gè)堿性預(yù)處理過程中，尿液的pH值被調(diào)節(jié)為至少12，例如12-14的范圍內(nèi)，優(yōu)選約13，并且保持該堿性pH值的時(shí)間一般約1/2至2小時(shí)，以足以使尿液中所含有的內(nèi)酯類分解。所選擇的處理?xiàng)l件必須使結(jié)合雌激素在此過程中不受到攻擊。因此優(yōu)選在室溫下，在限制堿的添加量至達(dá)到所希望的pH值在12-14范圍內(nèi)為準(zhǔn)的條件下，進(jìn)行該處理過程。根據(jù)所應(yīng)用的PMU的成份不同，為達(dá)到pH值在12-14范圍內(nèi)所需堿的量也有所不同。在應(yīng)用50％氫氧化鈉溶液時(shí)，基于10升PMU，一般來說約100-700ml 50％氫氧化鈉溶液的量就已足夠。接著通過添加酸水溶液，調(diào)節(jié)pH值至5-8.5范圍內(nèi)，優(yōu)選7-8.5，尤其是8-8.5。作為酸合適的有可溶解于尿液中的惰性有機(jī)或無機(jī)酸，例如鹽酸、硫酸、磷酸或低級(jí)羧酸如醋酸。較為合適的例如有濃鹽酸水溶液。根據(jù)所應(yīng)用的PMU成份不同和為了堿性調(diào)節(jié)所應(yīng)用的堿量的不同，達(dá)到上述pH值范圍所需要的酸量也有所不同。在應(yīng)用濃鹽酸的情況下，一般來說相對(duì)于1升PMU添加約25-100g濃鹽酸溶液即可達(dá)到所需要的pH值。
在方法步驟b)中可應(yīng)用的疏水硅膠為本身已知的反相硅膠(=反相硅膠，簡(jiǎn)稱為“RP-硅膠”)，它為一種化學(xué)改性硅膠，攜帶有疏水性功能基團(tuán)或配體。合適的有例如硅烷化的RP-硅膠，它們所含有的疏水性功能基團(tuán)為正-十八烷基二甲基甲硅烷基氧基-、正-辛基二甲基甲硅烷基氧基-、或二甲基羥基甲硅烷基氧基-殘基。合適的例如有平均顆粒大小在15-500μm范圍內(nèi)的硅烷化的硅膠，尤其合適的是平均顆粒大小在0.05-0.3mm范圍內(nèi)的、含有二甲基羥基甲硅烷基氧基-殘基的硅膠，例如Merck公司的“硅膠60/二甲基硅烷衍生物”。
按照本發(fā)明可以通過將任選濃縮的PMU或者其滯留液與疏水硅膠接觸，以進(jìn)行結(jié)合雌激素吸附至疏水硅膠上的吸附過程，其中將在方法步驟a)中預(yù)處理過的尿液加至含有硅膠的反應(yīng)器中，使在其中與硅膠接觸，并且保持足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使吸附雌激素。在完成結(jié)合雌激素吸附于疏水硅膠上的吸附過程后，可以按照本身已知的方式，將負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的硅膠由剩余的尿液中分離出來。合適的是將尿液通過含有硅膠的柱，其流通速度應(yīng)使有足夠長(zhǎng)的接觸時(shí)間以吸附雌激素。例如合適的流通速度相當(dāng)于5-20體積份PMU/1體積份硅膠/小時(shí)。優(yōu)選在室溫下進(jìn)行吸附作用。合適的是通過在稍稍的過壓下或者在低壓下操作，以調(diào)節(jié)控制尿液通過反應(yīng)器的流速。根據(jù)所應(yīng)用硅膠的種類不同，和方法步驟a)中預(yù)處理過的尿液內(nèi)固態(tài)物質(zhì)含量的不同，所應(yīng)用的疏水硅膠的量也可以不同。在應(yīng)用預(yù)處理過的PMU時(shí)，例如可以用至多80體積份預(yù)處理過的PMU來負(fù)載1體積份疏水硅膠，而能使在流出的尿液中檢測(cè)不到雌激素。在應(yīng)用預(yù)處理過的PMU-濃縮液或PMU-滯留液時(shí)，疏水硅膠的負(fù)載容量減少程度與它們濃縮程度一致。例如可以用相當(dāng)于30-80，優(yōu)選40-50體積份PMU的尿液來負(fù)載1體積份疏水硅膠。
在方法步驟c)中，將負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的疏水硅膠用一種pH值已調(diào)節(jié)至5-7范圍的，優(yōu)選約為5的含水緩沖液洗滌。作為洗滌液優(yōu)選應(yīng)用pH值調(diào)節(jié)約至5的含水的乙酸/乙酸鹽-緩沖液。尤其合適的是0.1-1摩爾濃度，優(yōu)選0.1-0.2摩爾濃度的乙酸/乙酸鹽-緩沖液。洗滌液的量的選擇應(yīng)能足以基本上洗除酚類尿內(nèi)含物，但是又沒有明顯量的結(jié)合雌激素被同時(shí)洗除。較為合適的是例如每床體積疏水硅膠應(yīng)用8-15，尤其是9-10床體積洗滌液。在此較為合適的是，以5-20體積份洗滌液/1體積份硅膠/小時(shí)的流速，使洗滌液通過含有疏水硅膠的反應(yīng)器。
接著在方法步驟d)中，將洗滌過的、負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的疏水硅膠，用洗脫結(jié)合雌激素混合物所需足夠量的洗脫液處理，這樣可獲得含有PMU天然結(jié)合雌激素混合物的洗脫液。本發(fā)明所應(yīng)用的洗脫液為一種由水和可與水混溶的醚、低級(jí)鏈烷醇和/或低級(jí)脂族酮所組成的混合液。作為洗脫液的醚成份，合適的有可與水混溶的環(huán)醚如四氫呋喃或二噁烷，合適的還有可與水混溶的開鏈醚例如乙二醇二甲醚(=單甘醇二甲醚)、二甘醇二甲醚(=二甘醇二甲醚)或者乙氧基乙氧基乙醇(=二甘醇一乙醚)。作為低級(jí)鏈烷醇，合適的有可與水混溶的、帶有1-4個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)碳原子的烷基醇，尤其是乙醇或異丙醇。作為低級(jí)脂族酮，合適的有可與水混溶的、帶有3-5個(gè)碳原子的酮尤其是丙酮。尤其合適的是，洗脫液中的有機(jī)溶劑為乙醇。洗脫液中可與水混溶的有機(jī)溶劑與水的體積比可以在40∶60至20∶80的范圍內(nèi)，優(yōu)選約30∶70。所應(yīng)用的洗脫液量可以約為3-5床體積洗脫液每床體積疏水硅膠。較為合適的是，洗脫液通過含有負(fù)載疏水硅膠的反應(yīng)器的流速應(yīng)使有足夠的接觸時(shí)間使結(jié)合雌激素混合物完全洗脫。在應(yīng)用體積比為30∶70的四氫呋喃和/或乙醇與水的混合液時(shí)，合適的流速例如是5-20體積份洗脫液/1體積份硅膠/小時(shí)。較為合適的是，通過在稍加提高的壓力下，例如在高至0.2巴的過壓下操作以調(diào)節(jié)流速，并且以多個(gè)餾分形式接收洗脫液。各個(gè)洗脫餾分中結(jié)合雌激素和酚類尿內(nèi)含物如甲酚和HPMF的含量可以按照本身已知的方式，通過高效液相色譜分離法(=高效液相色譜分離法，簡(jiǎn)稱為“HPLC”)測(cè)定。
在洗脫過程中，首先獲得的是淺色甚至無色的、基本上不含雌激素的前餾分，其量一般約相當(dāng)于一個(gè)床體積。大部分量的結(jié)合雌激素，例如在80-99％之間的起始-PMU中存在的結(jié)合雌激素量，存在于后面的暗黃棕色主餾分中，其量一般約為1-2床體積。在后面的后續(xù)餾分中一般只含有微量結(jié)合雌激素。如果得到的后續(xù)餾分還含有基于干物質(zhì)超過10重量％的結(jié)合雌激素和低于0.6重量％的甲酚和HPMF，可以將它們與富含雌激素的主餾分合并后用于進(jìn)一步處理中。
按照前面所敘述的方法由硅膠中分離出來的主要洗脫液，含有PMU天然結(jié)合雌激素混合物，此外還有很少量的原本在PMU中存在的酚類尿內(nèi)含物質(zhì)。這種洗脫液可以作為起始物質(zhì)用于制備含有天然結(jié)合雌激素混合物的藥物。需要時(shí)可以按照本身已知的方式，將此洗脫液進(jìn)一步濃縮，以便獲得基本上不含有機(jī)溶劑的、適合于蓋倫氏制藥進(jìn)一步處理的濃縮液。需要時(shí)還可以通過噴霧干燥法制備不含洗脫液的固態(tài)物質(zhì)混合物。如果應(yīng)用天然結(jié)合雌激素混合物制備固態(tài)藥物，則較為合適的是，在濃縮或者噴霧干燥前，即已向含有結(jié)合雌激素的洗脫液中混合添加固態(tài)載體物質(zhì)，以此方式可以獲得含有結(jié)合雌激素和載體物質(zhì)的固態(tài)混合物。含有該雌激素混合物的洗脫液、以及由此制備的濃縮液或者噴霧干燥的固態(tài)產(chǎn)物，可以按照已知的方式制備成固態(tài)的或液態(tài)的蓋倫氏制劑，例如片劑、糖衣丸劑、膠囊或乳液劑。可以按照本身已知的方法，應(yīng)用常見的固態(tài)或液態(tài)載體物質(zhì)例如淀粉、纖維素、乳糖、或滑石粉、或者液態(tài)石蠟，和/或應(yīng)用常見的制藥學(xué)佐劑，例如片劑崩解劑、增溶劑或貯藏劑，制備這些蓋倫氏制劑?？梢詫⒑薪Y(jié)合雌激素的產(chǎn)物與制藥學(xué)載體物質(zhì)或佐劑一起，按照本身已知的方式混合，然后將混合物轉(zhuǎn)化成合適的劑型。
以下實(shí)施例可以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并非僅限于此。
實(shí)施例1-5由PMU獲得基本上貧化了酚類尿內(nèi)含物質(zhì)的、含有PMU中所含有的天然結(jié)合雌激素混合物的提取物的一般操作程序。A) PMU的預(yù)處理將10l通過5cm高的砂床或者通過一個(gè)微濾裝置過濾后的PMU(干物質(zhì)含量(=TS)以及通過HPLC所測(cè)定的雌酮硫酸鹽、甲酚和HPMF的含量，參見以下實(shí)施例表)，在劇烈攪拌下通過添加50％氫氧化鈉水溶液(20℃下密度為1.52g/ml)調(diào)節(jié)至pH13(所添加的NaOH溶液量參見實(shí)施例表)，然后在室溫下攪拌1小時(shí)。接著通過添加濃鹽酸水溶液(約35％)將堿性尿液調(diào)節(jié)至pH8-8.5。B) PMU的雌激素成份吸附于RP-硅膠用100g(約等于約193ml的體積=1床體積)RP-硅膠(Merck公司的“硅膠60/二甲基硅烷衍生物”，訂貨號(hào)7719，顆粒大小63-200μm)填充50cm高、直徑為5cm的柱。將柱首先用0.5l水，之后用0.25l甲醇，然后再次用0.5l水洗滌。
將在A)中預(yù)處理過的尿液在0.2巴的過壓下以60ml/分鐘的流速通過柱。PMU中的雌激素完全吸附于如此負(fù)載的RP-硅膠柱上。借助于HPLC檢測(cè)所流出的尿液中結(jié)合雌激素含量，實(shí)驗(yàn)證明，它幾乎不含有雌激素。摒棄流出液。C) 負(fù)載的RP-硅膠柱的洗滌用2l(約等于10床體積)0.15摩爾濃度的醋酸/乙酸鈉-緩沖液洗滌負(fù)載的RP-硅膠柱。制備緩沖液的方法是，向0.15摩爾濃度醋酸水溶液中添加固態(tài)乙酸鈉(約107g)直至達(dá)到pH5。借助于HPLC測(cè)定流出的洗滌液中雌酮硫酸鹽、甲酚和HPMF的含量，其含有低于5％起始-PMU中的雌激素含量。D) 由洗滌后的RP-硅膠柱中解吸結(jié)合雌激素，以及富含雌激素的洗脫液餾分的分離在0.2巴的過壓下以約60ml/分鐘的流速使1l洗脫液(水/溶劑-混合液，組成成份參見以下實(shí)施例表)通過柱。將流出的洗脫液收集成多個(gè)餾分(體積分別約為200ml約等于1床體積)。借助于HPLC檢測(cè)各個(gè)餾分中的雌酮硫酸鹽、甲酚和HPMF的含量。收集第一餾分，期間洗脫液為無色至淡黃色。該餾分的體積為150-200ml。
該餾分僅僅含有微量的雌激素硫酸鹽。
一旦該洗脫液的顏色轉(zhuǎn)為明顯的暗黃色至棕色時(shí)，則收集約200ml的第二餾分。
在該餾分中所含有的結(jié)合雌激素含量約為萃取柱上負(fù)載的結(jié)合雌激素的總量的80-98％。剩余的餾分僅僅含有很少量的雌激素硫酸鹽。任選地在蒸餾去除溶劑后，可以將該剩余餾分再次送至方法步驟B)。
權(quán)利要求
1．獲取貧化了酚類尿內(nèi)含物質(zhì)的、來自妊娠牝馬的尿的天然結(jié)合雌激素混合物的方法，其特點(diǎn)是，a)將一種尿液，它為不含有粘液物質(zhì)和固態(tài)物質(zhì)的尿、該尿的一種濃縮液或者一種通過膜過濾該尿而獲得的濃縮尿滯留液，用能夠?qū)H值調(diào)節(jié)為至少12的足夠量的水溶性堿處理，接著通過添加足夠量的酸水溶液，將用堿處理過的尿液的pH值調(diào)節(jié)至5-8.5的范圍內(nèi)，b)將用堿處理過的、pH值調(diào)節(jié)至5-8.5的范圍內(nèi)的尿液，與為了吸附尿液中所含有的結(jié)合雌激素混合物所必需的足夠量的疏水硅膠接觸，然后將負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的疏水硅膠由剩余的尿液中分離，c)將負(fù)載有結(jié)合雌激素混合物的疏水硅膠，用pH值已調(diào)節(jié)至5-7的含水緩沖液洗滌，和d)將洗滌過的疏水硅膠與為了解吸已經(jīng)吸附于其上的結(jié)合雌激素混合物所需要的足夠量的洗脫液接觸，該洗脫液為一種由水和可與水混溶的有機(jī)溶劑所組成的混合液，所述有機(jī)溶劑選自可與水混溶的醚、低級(jí)鏈烷醇和低級(jí)脂族酮，然后將含有天然結(jié)合雌激素混合物的洗脫液由疏水硅膠中分離和任選濃縮。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其特點(diǎn)是，在方法步驟a)中將尿液與堿，優(yōu)選與堿的水溶液混合，并且在足以使尿內(nèi)含物中所含的內(nèi)酯類分解的時(shí)間內(nèi)保持其pH值至少為12。
3．按照上述權(quán)利要求之一的方法，其特點(diǎn)是，作為疏水硅膠，應(yīng)用攜帶二甲基羥基甲硅烷基氧基殘基的、硅烷化的硅膠。
4．按照上述權(quán)利要求之一的方法，其特點(diǎn)是，在方法步驟b)中，1體積份疏水硅膠用相當(dāng)于30至80，優(yōu)選40至50體積份尿的尿液負(fù)載。
5．按照上述權(quán)利要求之一的方法，其特點(diǎn)是，在方法步驟b)中，以相當(dāng)于5-20體積份尿/1體積份疏水硅膠/小時(shí)的流速，使尿液通過含有疏水硅膠的反應(yīng)器。
6．按照上述權(quán)利要求之一的方法，其特點(diǎn)是，在方法步驟c)中所應(yīng)用的洗滌液為一種pH值調(diào)節(jié)至約為5的乙酸/乙酸鹽-含水緩沖液。
7．按照上述權(quán)利要求之一的方法，其特點(diǎn)是，在方法步驟d)中所應(yīng)用的洗脫液為，一種由水和一種可與水混溶的有機(jī)溶劑組成的混合液，有機(jī)溶劑與水的體積比在20∶80至40∶60的范圍內(nèi)，尤其是30∶70。
全文摘要
本文說明了通過于RP－硅膠上固相萃取來自妊娠牝馬尿中的結(jié)合雌激素混合物,獲取一種含有來自牝馬尿的天然結(jié)合雌激素混合物的提取液的方法。
文檔編號(hào)A61K35/22GK1234740SQ96180424
公開日1999年11月10日 申請(qǐng)日期1996年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月30日
發(fā)明者I·班, F·伯克斯, H·海尼曼, H－H·拉克 申請(qǐng)人:德國(guó)索爾瓦有限公司