專利名稱：用于攜載基因的蛋白質(zhì)涂層醫(yī)用載體及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以蛋白質(zhì)為載體的醫(yī)用配制品，具體地說(shuō)是一種在底物的蛋白質(zhì)涂層上攜載基因的醫(yī)用配制品。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多疾病的發(fā)病機(jī)理在基因水乎上得以闡明，這使得從基因水平診斷和根治疾病成為可能。在醫(yī)治腫瘤、糖尿病，心臟病，腦病及愛(ài)滋病等方面利用基因轉(zhuǎn)移和調(diào)控的治療方法正在深入研究。例如將抗血栓形成基因(Pro-uk基因)導(dǎo)入心血管內(nèi)，使之在血管內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到抑制血栓形成，防止血管堵塞的目的。然而，怎樣將基因向生物體內(nèi)靶向輸送或局部定位，這一關(guān)鍵性的技術(shù)問(wèn)題目前尚未得到解決。美國(guó)MichealSimons等人曾用一種聚醚(Pluronic F127)載體，將基因加入這種載體的凝膠中，然后將其送入動(dòng)物的頸動(dòng)脈中(Nature，359(3)，67-70，1992.9)。這種方法的缺點(diǎn)在于，該凝膠遇到血流沖擊后會(huì)很快溶解于血液中，根本無(wú)法定位于血管的某一部位，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)靶向輸送基因的目的。另外，以往在醫(yī)療器械或醫(yī)療裝置等底物表面涂上涂層都是用來(lái)改善手術(shù)的外部環(huán)境。其中大多數(shù)用來(lái)增加底物表面親水性，使底物遇到含水介質(zhì)，如體液、血液時(shí)表面變得更光滑，從而減小對(duì)組織的損傷。已有文獻(xiàn)報(bào)道的底物表面涂層，都是以人造聚合高分子材料為原料，如USPat.4373009介紹了一種聚乙烯基吡咯烷酮涂層材料，USPat.5091025介紹了一種聚丙烯酸涂層材料。它們都是用來(lái)減小底物表面摩擦系數(shù)。這些涂層用于攜載基因都不理想。首先是因?yàn)檫@些涂層對(duì)基因的吸附力很小，其次是這些涂層的生物相容性以及對(duì)機(jī)體的毒副作用尚不清楚。
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)基因有強(qiáng)烈吸附作用的涂層醫(yī)用載體及其制作方法。這種涂層能夠牢固地粘附在底物上，可以隨底物定位于機(jī)體的任何部位，實(shí)現(xiàn)靶向輸送或局部定位基因的目的。同時(shí)這種涂層在體內(nèi)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)被機(jī)體吸收、代謝，對(duì)機(jī)體沒(méi)有毒副作用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明用于攜載基因的蛋白質(zhì)涂層醫(yī)用載體是一種分子量大于一萬(wàn)的經(jīng)過(guò)交聯(lián)處理的，加有或不加一種或多種添加劑的蛋白質(zhì)涂層。用作這種蛋白質(zhì)涂層的涂液的原始配方為，蛋白質(zhì)、添加劑和溶劑，其中蛋白質(zhì)的濃度為0.1％～40％溶液，添加劑的濃度為0～3.0％。蛋白質(zhì)來(lái)源于動(dòng)物或人的軟、硬組織，可以是明膠、或膠原，或白蛋白，最常用的是明膠。溶劑是水、和/或有機(jī)溶劑(如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等)。根據(jù)不同的用途、目的或?yàn)楦倪M(jìn)涂層的某種性能可以在蛋白質(zhì)涂層中加入一種或多種以下的添加劑。增塑劑，如甘油、脂肪酸、醚類、礦物油、硅油等，用以增加涂層的柔性；表面活性劑，如陰離子表面活性劑(十二烷基硫酸鈉、十二烷磺酸鈉等)、陽(yáng)離子表面活性劑(烷基季銨鹽等)、非離子表面活性劑(吐溫類等)，用以改善蛋白質(zhì)溶液的鋪展性能；在應(yīng)用于與血液接觸的制品時(shí)可加入抗凝血?jiǎng)?如肝素鈉)、抗血小板沉積劑、抗平滑肌細(xì)胞增生劑；協(xié)助治療某種疾病的特定藥物(包括生物活性物質(zhì)藥物)；防腐劑(如苯甲酸鈉)，用以防止蛋白質(zhì)變質(zhì)。
本發(fā)明用于攜載基因的蛋白質(zhì)涂層醫(yī)用載體的制作方法有如下步驟1.蛋白質(zhì)溶液的配制用水和/或有機(jī)溶劑將蛋白質(zhì)溶解，再根據(jù)需要加入一種或多種添加劑，攪拌混勻，配制成蛋白質(zhì)濃度為0.1％～40％(最好在0.5～30％)，添加劑濃度為0～3.0％的蛋白質(zhì)溶液。
2.蛋白質(zhì)的交聯(lián)處理可以采用化學(xué)交聯(lián)法或高能輻射交聯(lián)法?；瘜W(xué)交聯(lián)法的步驟是先將需用量的化學(xué)交聯(lián)劑加入配制好的蛋白質(zhì)溶液中，混勻后再進(jìn)行涂層，或者是在蛋白質(zhì)溶液涂于底物表面后，再將需用量的化學(xué)交聯(lián)劑加于涂層上。化學(xué)交聯(lián)劑可以選用醛類(如甲醛、乙醛、戊二醛)、酮類(如丁二酮、己二酮)、異氰酸酯類(如甲苯二異氰酸酯、二苯基甲烷二異氰酸酯、己二異氰酸酯、三苯基甲烷三異氰酸酯、多亞甲基多異氰酸酯)、環(huán)氧類化合物(如環(huán)氧氯丙烷)中的一種或多種。化學(xué)交聯(lián)劑的用量為每100克蛋白質(zhì)中加入0.01～10克(最好是0.1～5克)(交聯(lián)劑按100％濃度計(jì))；高能輻射交聯(lián)法是用各種放射源產(chǎn)生的高劑量γ-射線照射蛋白質(zhì)涂層使其產(chǎn)生交聯(lián)。
3.蛋白質(zhì)溶液的涂覆涂覆的方法可以是浸泡(5秒～2小時(shí))、或刷、或涂抹、或噴涂等，只要使蛋白質(zhì)溶液能均勻地涂于底物表面即可。這里說(shuō)的底物可以是各種醫(yī)用制品、醫(yī)療器械、或醫(yī)療裝置，如金屬血管內(nèi)支架、球囊導(dǎo)管、引導(dǎo)導(dǎo)管、高分子血管內(nèi)支架、人造血管、鞘管、骨釘、人工關(guān)節(jié)、骨夾板等。底物所用的材質(zhì)可以是金屬(包括不銹鋼、鈦、鉭、鋯或記憶合金等)、塑料(包括聚乙烯、聚氯乙烯、聚氨酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚己內(nèi)酯、聚丙交酯、聚乙交酯、聚二氧雜環(huán)己酮、或相應(yīng)的共聚物)、橡膠、陶將瓷、木材、或骨等，也可以是表面已經(jīng)經(jīng)過(guò)處理的底物，如表面已經(jīng)涂有涂層的底物，這些已有的涂層可以是聚氨酯涂層、異氰酸酯低聚物涂層、異氰酸酯與二元醇或多元醇加成物涂層、異氰酸酯單體涂層、環(huán)氧樹(shù)脂涂層、或能使底物表面帶活性基團(tuán)(包括異氰酸酯基、胺基、酰胺基、羥基、環(huán)氧基、醛基等)的涂層。
4.蛋白質(zhì)涂層的干燥將涂覆上交聯(lián)劑的蛋白質(zhì)涂層的底物放入烘箱中，或在自然環(huán)境中進(jìn)行干燥，以除去溶劑。干燥的溫度為4～100℃，干燥的時(shí)間為0.3～100小時(shí)。干燥的溫度高；需要時(shí)間就短。
5.涂層厚度的控制涂層厚度是通過(guò)蛋白質(zhì)溶液的濃度和涂覆次數(shù)(即重復(fù)操作2-4步方法)來(lái)控制。蛋白質(zhì)溶液濃度越小、涂層越?。煌扛泊螖?shù)越多，涂層越厚。一般涂層厚度控制在0.1～100微米范圍內(nèi)，最好是在1～20微米。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的醫(yī)用底物的涂層是一種可以攜載治療性目的的基因的蛋白質(zhì)涂層，這是一種全新的涂層。蛋白質(zhì)涂層之所以能夠強(qiáng)烈地吸附基因，首先是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是基因的表達(dá)物，蛋白質(zhì)分子上有大量可與基因形成氫鍵或其它價(jià)鍵的位點(diǎn)。其次蛋白質(zhì)涂層是一種水凝膠，它對(duì)基因等水溶性物質(zhì)的強(qiáng)烈吸附是不言而喻的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)涂層的原料來(lái)自機(jī)體組織，有很好的生物相溶性，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后自然被機(jī)體吸收、代謝、沒(méi)有毒副作用。因?yàn)閷y載基因的蛋白質(zhì)涂于底物表面上，所以基因很容易隨底物被定位于機(jī)體的治療部位，達(dá)到靶向輸送入或局部定位基因的目的。
實(shí)施例1.
配制100ml 10％濃度的明膠水溶液，加入濃度為37％的甲醛溶液0.5ml和1.0克甘油、混合均勻。用移液管取此溶液置于不銹鋼血管內(nèi)支架上，用一玻璃棒將溶液鋪開(kāi)，于20℃下，在自然環(huán)境中干燥20小時(shí)、在底物上形成一層牢固的有很好柔性的涂層。將涂有該涂層的不繡鋼血管內(nèi)支架浸泡于基因原液中1分鐘，取出后用球囊導(dǎo)管將其植入狗的股動(dòng)脈中。七天后對(duì)該股動(dòng)脈進(jìn)行組化染色(X-gal)分析。結(jié)果是實(shí)驗(yàn)段股動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜大量細(xì)胞核成深藍(lán)色，這表明基因在該段股動(dòng)脈高效轉(zhuǎn)染。同時(shí)，將沒(méi)有蛋白質(zhì)涂層的不銹鋼血管內(nèi)支架進(jìn)行同樣的對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果是沒(méi)有發(fā)生實(shí)驗(yàn)段股動(dòng)脈的細(xì)胞核藍(lán)染。這充分證明蛋白質(zhì)涂層可以攜載基因，并成功地將基因靶向輸送。
實(shí)施例2-23.
操作方法步驟及攜載基因并靶向輸送的實(shí)驗(yàn)及結(jié)果同實(shí)施例1，只是采用了不同的底物、不同的蛋白質(zhì)溶液、不同的交聯(lián)劑、添加劑、不同的干燥條件和涂覆次數(shù)，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
實(shí)施例24.
配制100ml 10％濃度的明膠水溶液，加入1.0克甘油，在電磁攪拌器上攪拌5分鐘，將不銹鋼片浸泡在上述蛋白質(zhì)溶液中30秒，取出后在20℃下干燥10小時(shí)，然后，將帶涂層的不銹鋼片浸入10％的甲醛溶液中1分鐘，取出后，于20℃下干燥40小時(shí)。攜載基因和靶向輸送的實(shí)驗(yàn)及結(jié)果同實(shí)施例1。實(shí)施例25.
配制100ml 10％濃度的明膠水溶液，加入1.0克甘油和15毫克十二烷基硫酸鈉，在電磁攪拌器上攪拌5分鐘、將聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯膜片浸入該溶液中1分鐘，然后用劑量為3.0Mrad的γ-射線照射，使明膠交聯(lián)，取出在20℃下干燥10小時(shí)。攜載基因和靶向輸送的實(shí)驗(yàn)及結(jié)果同實(shí)施例1。
表1.
續(xù)表1
* DMS—二甲基亞砜TDI—甲苯二異氰酸酯S—十二烷基硫酸鈉N—十六烷基三甲基溴化銨
權(quán)利要求
1.一種用于攜載基因的蛋白質(zhì)涂層醫(yī)用載體，其特征在于它是一種加有或不加一種或多種添加劑的分子量大于一萬(wàn)的經(jīng)過(guò)交聯(lián)(加入化學(xué)交聯(lián)劑或輻射交聯(lián))處理的可以涂在底物表面上的蛋白質(zhì)涂層，用作這種蛋白質(zhì)涂層的涂液的原始配方為蛋白質(zhì)、和/或添加劑和溶劑，其中蛋白質(zhì)的濃度為0.1％～40％，添加劑的濃度為0～3.0％，蛋白質(zhì)是來(lái)源于動(dòng)物或人的軟、硬組織的明膠、或膠原、或白蛋白，溶劑是水、和/或有機(jī)溶劑(二甲基甲酰胺、和/或二甲基亞砜)；所述的添加劑是，增塑劑(如甘油、脂肪酸醚類、礦物油、硅油等)、表面活性劑(陰離子表面活性劑—十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、陽(yáng)離子表面活性劑—烷基季銨鹽、非離子表面活性劑—吐溫類)、抗凝血?jiǎng)?如肝素鈉)、抗血小板沉積劑、抗平滑肌細(xì)胞增生劑、防腐劑(苯甲酸鈉)。
2.一種制作權(quán)利要求1所述的用于攜載基因的蛋白質(zhì)涂層醫(yī)用載體的方法，其特征在于它包括如下步驟A.蛋白質(zhì)溶液的配制先用水和/或有機(jī)溶劑將蛋白質(zhì)溶解，再根據(jù)需要加入一種或多種添加劑，攪拌混勻，配制成蛋白質(zhì)濃度為0.1％～40％(最好在0.5～30％間)、添加劑濃度為0～3.0％的蛋白質(zhì)溶液；B.蛋白質(zhì)的交聯(lián)處理采用化學(xué)交聯(lián)法或高能輻射交聯(lián)法，化學(xué)交聯(lián)法的步驟是先將需用量的化學(xué)交聯(lián)劑加入A步中配制的蛋白質(zhì)溶液中混勻，然后再進(jìn)行涂層，或者是先將A步中配制的蛋白質(zhì)溶液涂于底物表面后，再將需用量的化學(xué)交聯(lián)劑加于涂層上，所用的化學(xué)交聯(lián)劑是醛類(如甲醛、乙醛、戊二醛)、酮類(如丁二酮、己二酮)、異氰酸酯類(如甲苯二異氰酸酯、二苯基甲烷二異氰酸酯、異二異氰酸酯、三苯基甲烷三異氰酸酯、多亞甲基多異氰酸酯)、環(huán)氧類化合物(如環(huán)氧氯丙烷)中的一種或多種，化學(xué)交聯(lián)劑的用量為每100克蛋白質(zhì)中加入0.01～10克交聯(lián)劑(按100％濃度計(jì))；高能輻射交聯(lián)法是用各種放射源產(chǎn)生的高劑量γ-射線來(lái)照射蛋白質(zhì)涂層使其產(chǎn)生交聯(lián)；C.蛋白質(zhì)溶液的涂覆涂覆的方法為浸泡(5秒～2小時(shí))、或刷、或涂抹、或噴涂等，只要能使蛋白質(zhì)溶液均勻地涂于底物表面即可，底物可以是各種醫(yī)用制品、醫(yī)療器械、或醫(yī)療裝置，如金屬血管內(nèi)支架、球囊導(dǎo)管、引導(dǎo)導(dǎo)管、高分子血管內(nèi)支架、人造血管、鞘管、骨釘、人工關(guān)節(jié)、骨夾板等，底物材質(zhì)可以是金屬(包括不銹鋼、鈦、鉭、鋯、或記憶合金)、塑料(包括聚乙烯、聚氯乙烯、聚氨酯、聚時(shí)苯二甲酸乙二醇酯、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚己內(nèi)酯、聚丙交酯、聚乙交酯、聚二氧雜環(huán)己酮、或相應(yīng)的共聚物)、橡膠、陶瓷、木材、或骨，也可以是表面已經(jīng)經(jīng)過(guò)處理的底物，如表面已經(jīng)涂有涂層的底物，這些已有的涂層可以是聚氨酯涂層、異氰酸酯低聚物涂層、異氰酸酯與二元醇或多元醇加成物涂層、異氰酸酯單體涂層、環(huán)氧樹(shù)脂涂層、或能使底物表面帶活性基團(tuán)(包括異氰酸酯基、胺基、酰胺基、羥基、環(huán)氧基、醛基)的涂層；D.蛋白質(zhì)涂層的干燥將涂覆上交聯(lián)的蛋白質(zhì)涂層的底物放入烘箱中、或在自然環(huán)境中進(jìn)行干燥，溫度為4～100℃，時(shí)間為0.3～100小時(shí)；E.涂層厚度的控制通過(guò)蛋白質(zhì)溶液的濃度和涂覆次數(shù)(即重復(fù)操作B—D步)來(lái)控制涂層的厚度，涂層厚度控制在0.1～100微米內(nèi)。
3.一種權(quán)利要求1所述的用于攜載基因的蛋白質(zhì)涂層醫(yī)用載體的應(yīng)用，其特征在于將涂有蛋白質(zhì)涂層的底物浸泡于基因原液中，充分吸附基因后取出，移植入機(jī)體的指定部位，實(shí)現(xiàn)靶向輸送或局部定位基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于用于攜載基因的蛋白質(zhì)載體類醫(yī)用配制品，它是將加或不加添加劑的經(jīng)過(guò)交聯(lián)處理的蛋白質(zhì)粘附于醫(yī)用底物上而制成。將底物上的蛋白質(zhì)涂層有效地吸附基因后定位移植入機(jī)體的任何部位，可以理想地實(shí)現(xiàn)靶向輸送局部定位基因。這種涂層可以被機(jī)體吸收代謝，對(duì)機(jī)體沒(méi)有毒副作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1126093SQ9511837
公開(kāi)日1996年7月10日 申請(qǐng)日期1995年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月27日
發(fā)明者史瑞文, 高潤(rùn)霖 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院