專(zhuān)利名稱(chēng)：包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的制備方法。
在培養(yǎng)動(dòng)物惡性腫瘤細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)了存在抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)。
將上述活性物質(zhì)分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)其主要成份是L-乳酸低聚物和L-乳酸的環(huán)狀低縮合物。
L-乳酸低縮合物的制備方法有多種多樣，但象這種乳酸低縮合物這樣低分子量的低聚物具有粘結(jié)性強(qiáng)，也有相互溶解性，同時(shí)還有掩蔽效應(yīng)，所以從上述制備物中分離活性成分比較困難。
本發(fā)明是以提供包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑及其制備方法為目的，這種抑制劑由縮合度為5～25的L-乳酸直鏈狀縮合物和縮合度為2～15的L-乳酸環(huán)狀縮合物的混合物組成。(用FAB-MS測(cè)定)本發(fā)明的制備方法是一種利用上述乳酸低縮合物的性質(zhì)，來(lái)制備包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑，特別是采用反相色譜法分離上述活性物質(zhì)，制備包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的方法。
本發(fā)明的包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的制備方法，是在常壓或減壓下在通入氮?dú)獾榷栊詺怏w時(shí)加熱L-乳酸，首先將與單體共存的水分、接著將縮合反應(yīng)生成的水分蒸餾出反應(yīng)體系，得到的L-乳酸低縮合物溶解到一定量的甲醇中成懸濁液，在一定的溫度下平衡后過(guò)濾，其甲醇可溶部分經(jīng)減壓干燥后制成乙腈溶液，用事先經(jīng)乙腈酸性溶液平衡化的反相ODS或OS柱分離，按乙腈濃度逐漸上升方式進(jìn)行梯度洗脫，在用35～50%以上的乙腈酸性水溶液洗脫后，收集用70%的乙腈酸性溶液洗脫的組分作為活性組分。
另外，將反應(yīng)液作成乙腈溶液。在ODS柱上、采用從25%的乙腈酸性水溶液到乙腈的直線濃度梯度洗脫而分離得到了基本單一縮合度的物質(zhì)，但由于需要大量的洗脫液，現(xiàn)在還只能是試管實(shí)驗(yàn)階段。
但如圖7所示，分離的縮合度n＝13峰的FAB-MS譜中，在縮合度n＝13以外也存在縮合度在n＝13以下的直鏈狀縮合體及環(huán)狀縮合體，特別是n＝2，3的環(huán)狀縮合體的混入量較多。
本發(fā)明所述L-乳酸縮合物是指以L-乳酸低聚物或經(jīng)若干修飾的低分子量的L-乳酸縮合體及L-乳酸的環(huán)狀縮合物為主要成分的縮合物。
上述常壓下的加熱是在130℃以上進(jìn)行，減壓下的加熱是在120℃以上分段減壓下進(jìn)行的。梯度洗脫是采取乙腈的濃度逐漸上升的方式，35～50%的乙腈酸性水溶液洗脫后，用70%以上的乙腈酸性水溶液洗脫。
反相ODS或OS柱的洗脫以PH2～3的鹽酸酸性乙腈水溶液為好。
蒸餾出未反應(yīng)的L-乳酸單體及低沸點(diǎn)產(chǎn)物采取常壓下低溫加熱，在蒸出與單體的共存水分及縮合反應(yīng)生成的水分后、分2～3個(gè)階段進(jìn)行減壓和升溫，在200mmHg以下加熱到150～170℃，最后在10mmHg以下180～200℃加熱1～2個(gè)小時(shí)。
以上的制備方法中，L-乳酸(α-羥基丙酸)在室溫下為液體，通常以2個(gè)分子以氫鍵結(jié)合的狀態(tài)存在，溶液中的濃度是含有10～20%的乳酐(2分子縮合的物質(zhì))。
L-乳酸加熱時(shí)容易脫水縮合而聚合固化，縮合度可由與之共存的水分量及反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)。因蒸餾水時(shí)吸收蒸發(fā)熱而使反應(yīng)液溫度降低，因此蒸餾水分時(shí)必須視加熱溫度而調(diào)節(jié)蒸發(fā)速度。
本發(fā)明使用的L-乳酸低聚物為分子量在1800以下，必須溶于至少也能分散于丙二醇中的物質(zhì)。該乳酸聚合物例如能由在185℃常壓下攪拌、通入氮?dú)庀录訜?小時(shí)而制得，也能由在160℃溫度一定的情況下、反應(yīng)體系的壓力按1～2小時(shí)間隔、以500、300、100、50mmHg方式進(jìn)行減壓而制得。而且也能由在常壓低溫下、例如油浴溫度145℃時(shí)緩慢地將共存水分經(jīng)3小時(shí)左右蒸餾至L-乳酸單體的10%后，經(jīng)0.5～1小時(shí)減壓到150mmHg并保持2.5～3小時(shí)，接著在10mmHg以下150～160℃保持3小時(shí)，最后在180～200℃反應(yīng)1～2小時(shí)而制得該乳酸聚合物。最后一種制備方法得到的乳酸低縮合物為幾乎沒(méi)有單體的具有3、4、5……19、20、……連續(xù)縮合度的低聚物。另外，最后也采取180～200℃加熱蒸餾出低沸點(diǎn)物質(zhì)。其結(jié)果如

圖1所示。一般如圖6所示，根據(jù)反應(yīng)條件的不同，縮合度n變化很大。
圖中，L為環(huán)狀縮合物丙交酯，So為直鏈縮合物，S為直鏈縮合物的鈉鹽，2L為縮合度n＝2時(shí)的環(huán)狀縮合物(丙交酯)，3L為縮合度n＝3時(shí)的環(huán)狀縮合物(丙交酯)。
因上述反應(yīng)物在室溫固化且再溶解困難，因此在仍具有流動(dòng)性時(shí)溶解、分散在一定量的甲醇中，或者加入1/10量的乙醇而成均一溶液后、加入甲醇而溶解、分散，或者固化后的物質(zhì)在帶有冷卻裝置的粉碎機(jī)上粉碎、在一定量的甲醇中50～60℃下攪拌而使之溶解、分散。在25℃溫度下平衡化后過(guò)濾，減壓干燥后配成乙腈溶液，在反相ODS或OS柱上分離。
一般，反應(yīng)液由直鏈縮合物和環(huán)狀縮合物的混合物組成，縮合度到25左右為止，將它們完全相互分離現(xiàn)在還不可能，不能得到特定的單一物質(zhì)，但可以認(rèn)為即使它們的抑制效果存在某些差異，也各自具有一定的作用。另外在分析上，縮合度≥4的環(huán)狀縮合物(丙交酯)和直鏈狀縮合物可大致進(jìn)行分離，而縮合度n＝2、3的丙交酯具有直鏈狀縮合物的性質(zhì)，不能將它們分離。這一情況不僅只是因?yàn)槲?qiáng)，也許還因?yàn)樵诜忾]體系內(nèi)存在一種可逆平衡。對(duì)于與之相對(duì)照的分子量約1800以下的縮合物，直鏈狀物和環(huán)狀物分別易溶于甲醇和乙腈中。
另外，反應(yīng)液中和后由25%乙腈水溶液在反相ODS柱上洗脫時(shí)，低分子量的鈉鹽被洗出，而環(huán)狀縮合物(丙交酯)若不用乙腈含量高的洗脫液就不能被洗出。
另，L-乳酸(α-羥基丙酸)縮合物的凝集性強(qiáng)，若將洗脫液酸化使能切斷氫鍵后，則用ODS柱分離L-乳酸(α-羥基丙酸)縮合物的效果變佳。本發(fā)明的實(shí)例中無(wú)催化劑體系反應(yīng)液(中和)的FAB-MS譜[圖2]本發(fā)明的實(shí)例中常壓下185℃加熱3小時(shí)后反應(yīng)液的FAB-MS譜[圖3]本發(fā)明的實(shí)例中在160℃的一定溫度下，500→300→100→50mmHg減壓后的反應(yīng)液的FAB-MS譜[圖4]本發(fā)明的實(shí)例中常壓下160℃加熱3小時(shí)后，再在185℃、3.5mmHg以下反應(yīng)1.5小時(shí)后反應(yīng)液的FAB-MS譜[圖5]本發(fā)明的實(shí)例中經(jīng)ODS柱分離的無(wú)催化劑體系反應(yīng)液的活性部分的FAB-MS譜[圖6]ODS柱經(jīng)從初始濃度25%乙腈水溶液(PH2，4)到乙腈的直線濃度梯度洗脫時(shí)的檢出濃度一洗脫時(shí)間圖[圖7]圖6分離的縮合度n＝13的峰再度經(jīng)色譜洗出的物質(zhì)的FAB-MS譜1.L-乳酸低縮合物的制備方法(1)500mLL-乳酸加入裝有下行連接管、攪拌棒及氮?dú)鈱?dǎo)管的Separa硬質(zhì)燒瓶中，用密閉式加熱器在溫度145℃，常壓下加熱3小時(shí)，接著在145℃、150mmHg下加熱2小時(shí)。蒸餾出的水經(jīng)過(guò)保溫的下行連接管進(jìn)入裝有回流冷凝器的瓶中被冷卻并儲(chǔ)起來(lái)。
接下來(lái)，在30分鐘內(nèi)減壓至數(shù)mmHg，在150℃保持3小時(shí)后，再在185℃加熱1.5小時(shí)而得到目的低聚物。(圖1)然后，在仍具有流動(dòng)性的狀態(tài)下，倒入2倍量的甲醇中，在25℃的室溫下冷卻而平衡化。
(2)采用與(1)同樣的裝置，在155℃、常壓下加熱3小時(shí)后，160℃、40mmHg下加熱3小時(shí)，最后在185～190℃、數(shù)mmHg下加熱1.5小時(shí)，得到同樣的低聚物。
(3)采用與(1)同樣的裝置，185℃常壓下加熱3小時(shí)后，得到低縮合度的物質(zhì)。(圖2)(4)同樣，在160℃的溫度一定下，真空度按500→300→100→50mmHg方式改變，并在各真空度下保持1小時(shí)。(圖3)(5)同樣，在160℃、常壓下加熱3小時(shí)后，減壓，在160℃、3.5mmHg下保持，最后在185℃加熱1.5小時(shí)。(圖4)2.乳酸低縮合物的精制(1)甲醇分散液在室溫25℃下用濾紙過(guò)濾，得到甲醇可溶部分后，減壓干燥，再制成乙腈溶液，在經(jīng)PH2.0鹽酸酸性的25%乙腈溶液平衡化的反相ODS(ChemcLC-sorbSP-C-ODS)柱上、用乙腈濃度25%、50%、100%的鹽酸酸性溶液(PH2.0)依次進(jìn)行洗脫分離，得到各洗出組分。這些組分經(jīng)中和后，經(jīng)乙醇置換數(shù)次、減壓干燥，再溶于丙二醇中而分別得到抑制劑1、2和3。
(2)反應(yīng)液中加入乙腈溶解，在預(yù)先用25%乙腈水溶液(PH2.1～3.0)平衡化的反相ODS或OS柱(1″×300mm)上、以16。4ml/min的流量、用平衡化水溶液洗脫25～30分鐘，接著，增加乙腈的濃度至純乙腈，以乙腈的直線濃度梯度進(jìn)行75分鐘的洗脫分離。(圖6)根據(jù)以上的精制，得到由縮合度5～25的L-乳酸直鏈狀縮合物和縮合度2～15的L-乳酸環(huán)狀縮合物的混合物構(gòu)成的抑制劑。
3.急性毒性試驗(yàn)(1)給雄性小鼠靜脈注射乳酸低縮合物的精制(1)得到的抑制劑2，觀察了一星期內(nèi)的體重變化。其結(jié)果如表1所示。
(2)兔子的動(dòng)脈中注射乳酸低縮合物的精制(1)得到的抑制劑3后第1、4、7天稱(chēng)量的體重結(jié)果如表2所示。作為比較，表中也列出了注射阿霉素后的結(jié)果。
表2
(3)在10只四周齡雌性裸小鼠的背側(cè)部皮下一日一次、連續(xù)3次注射乳酸低縮合物的精制(1)得到的抑制劑2。
經(jīng)10日后結(jié)果發(fā)現(xiàn)死亡率為0。
(4)在10只C57Black(8周齡)小鼠的尾部的血管中，一日一次、連續(xù)10次注射乳酸低縮合物的精制(1)得到的抑制劑2。10日后結(jié)果發(fā)現(xiàn)外觀沒(méi)有變化、死亡率為0。
給藥量50mg/ml溶液0.2ml(400mg/kg)
(5)6個(gè)月齡、體重7kg的雌性小豬兔犬中，一日一次連續(xù)地靜脈注射(Ⅳ)乳酸低縮合物的精制(1)得到的抑制劑2，10日間的觀察結(jié)果表明外表沒(méi)有特別的異常反應(yīng)(沒(méi)有臨床變化)。
給藥量0.7g(100mg/kg)4。惡性腫瘤抑制試驗(yàn)例(1)雄性4周齡的裸小鼠ICRNU/NU的背側(cè)皮下，移植人的惡性腫瘤細(xì)胞(細(xì)胞株)HelaCells(人子宮部癌細(xì)胞株)，移植后第3日，實(shí)驗(yàn)組一日一次、連續(xù)11次注射乳酸低縮合物的精制(1)的抑制劑1，對(duì)照組同樣方式注射生理食鹽水。之后，停止給藥，移植后第7周取出腫瘤稱(chēng)量。抑制率由下式表示。
抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組的腫瘤重量g/對(duì)照組腫瘤重量g)×100%表3及表4列出了其結(jié)果HelaCells(人子宮頸部癌細(xì)胞株)移植數(shù)1×107級(jí)給藥方法皮下給藥(SC)給藥量30mg0.3ml(第3日開(kāi)始)結(jié)果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各5例的腫瘤重量如以下所示。
表3
抑制率57.1%(2)小鼠肺癌細(xì)胞雄性C57Black小鼠(8周齡)中移植(SC)1.0×106級(jí)的LLC(小鼠肺癌細(xì)胞)，采取與1的同樣方法，從移植后的第二天起給藥11次，其結(jié)果如表4所示。
表4
抑制率49.8%(3)吉田肉瘤大鼠中移植吉田肉瘤形成腫瘤后，按20mg/kg、100mg/kg的給藥量連續(xù)7日靜脈注射乳酸低縮合物的精制(1)得到的抑制劑2，7日間腫瘤大小(mm)測(cè)定結(jié)果如表5所示。對(duì)照組為同樣方式注射生理食鹽水。同時(shí)表中也列出了使用陽(yáng)性藥物-阿霉素后的結(jié)果。
表5
(4)來(lái)源于兔子肝癌的兔子細(xì)胞株V×2來(lái)源于兔子肝癌的細(xì)胞株V×2植入兔子肝臟，2周后，選擇腫瘤大小在10×10mm～20×20mm的兔子，分別動(dòng)脈注射乳酸低縮合物的精制(1)得到的2、3抑制劑及作為比較對(duì)照的-阿霉素，7日后，取出腫瘤，觀察的結(jié)果如表6所示。
癌的大小＝癌長(zhǎng)徑×癌短徑，上述小鼠中免強(qiáng)出現(xiàn)了一定程度的有意義的差別，但伴隨大鼠、兔子和大動(dòng)物的試用，則表現(xiàn)出顯著的藥理效果。
5.臨床例方法乳酸低縮合物的精制(1)中的100mg抑制劑3溶于1mL丙二醇中作成溶液(以下稱(chēng)抑制劑液)，按體重1Kg抑制劑30mg(抑制劑液0.3mL)的換算量與維生素、葡萄糖等點(diǎn)滴液混合，實(shí)行點(diǎn)滴靜脈注射。注射采取1個(gè)部位1次，連續(xù)5次注射后，中止3日，從第9日開(kāi)始又連續(xù)注射5次，以后隨時(shí)間的經(jīng)過(guò)觀察患者的狀態(tài)。
例1胃癌往攜有雞蛋大小的腫瘤、且在出血的患者(60歲男性)身上按上述方法注射抑制劑液15ml與葡萄糖點(diǎn)滴液500ml的混合液，第5日即出現(xiàn)藥效，出血停止、出現(xiàn)食欲、身體狀態(tài)恢復(fù)。而且經(jīng)X光檢查追蹤藥效，發(fā)現(xiàn)腫瘤縮小。這一點(diǎn)也由胃鏡得到了確認(rèn)。
例2甲狀腺癌往攜有肥大浸潤(rùn)性腫瘤、血液浸潤(rùn)、啉巴節(jié)轉(zhuǎn)移了的患者(50歲男性)身上，按同樣的方法點(diǎn)滴靜脈注射15ml抑制劑液和500ml葡萄糖的混合液。注射后的第6天出現(xiàn)血液等的浸潤(rùn)停止現(xiàn)象，隨時(shí)間推移肥大化的腫瘤及啉巴節(jié)縮小了。同時(shí)，體力也恢復(fù)，顯示出十分有意義的藥效。
例3肺癌仍然是按同樣的方法往攜有肥大支氣管癌患者(55歲男性)身上注射15ml抑制劑液和500ml葡萄糖點(diǎn)滴液的混合液。注射后第5日顯現(xiàn)藥效，咳痰中的血液消失、癌細(xì)胞顯著減少，表現(xiàn)出全身狀態(tài)的改善。2個(gè)月后，X光檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤縮小，同時(shí)體力也顯著地恢復(fù)。
例4子宮癌按同樣的方法，給伴有出血的子宮頸癌患者注射12ml抑制劑液和500ml葡萄糖的混合液。注射后4～5日可見(jiàn)到出血停止、癥狀改善，經(jīng)1個(gè)月后也沒(méi)出血。2個(gè)月后CT掃描確認(rèn)了腫瘤的縮小。
ODS柱分離出的活性部分(ODS-80)含有環(huán)狀縮合體，與直鏈狀縮合體一同連續(xù)到縮合度n較大處(實(shí)用上縮合度n≤23)，注射后數(shù)日即開(kāi)始出現(xiàn)抑制效果，注射10日后，即使停止注射也見(jiàn)不到腫瘤的增殖，顯示出長(zhǎng)期有效性。即ODS-80的場(chǎng)合，可認(rèn)為在最初5日間一日一次給藥后，足可以在4～5日的間隔后再給藥，但因代謝循環(huán)不同，所以這一點(diǎn)在小鼠身上得不到確認(rèn)。
α-羥基酸、特別是乳酸的縮合物容易在生物體內(nèi)分解而排出體外，這一點(diǎn)已由大量的研究者確認(rèn)，同時(shí)，在筋肉組織中也存在常常由于疲勞而產(chǎn)生的乳酸。另外，分解速度也不是快到會(huì)引起乳酸酸中毒，藥理上沒(méi)有毒性，可以進(jìn)行有效量的連續(xù)給藥，也沒(méi)有必要考慮副作用。而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腫瘤的特異性。
本發(fā)明的包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤抑制劑如同實(shí)例所敘述的，在生物體內(nèi)進(jìn)行的毒性實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)特別異?，F(xiàn)象，在植入小鼠的惡性腫瘤細(xì)胞的增殖抑制試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)給藥開(kāi)始數(shù)日后即停止增殖，其后即使停止給藥腫瘤也仍然縮小，而且從臨床例中也確認(rèn)了患者體力恢復(fù)、腫瘤的縮小化。另外，由于從皮下給藥顯示出穩(wěn)定的有效性，該抑制劑是生態(tài)中具有穩(wěn)定的持續(xù)性能的物質(zhì)，可以適合于作為有效而且安心的抗癌藥。
另外，本發(fā)明的惡性腫瘤抑制劑制備方法不是利用生態(tài)系統(tǒng)，而是利用化學(xué)方法，與過(guò)去的方法相比可以極度簡(jiǎn)化而縮短時(shí)間及節(jié)省材料費(fèi)。
權(quán)利要求
1.包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑，其中包括縮合度5～25的L-乳酸直鏈狀縮合物或縮合度為2～15的L-乳酸環(huán)狀縮合物單獨(dú)或其混合物。
2.權(quán)利要求1的包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的制備方法，其中常壓或減壓下在通入氮?dú)獾榷栊詺怏w時(shí)加熱乳酸，得到的乳酸縮合物用甲醇溶解，將其過(guò)濾干燥后溶于乙腈中，在預(yù)先經(jīng)酸性乙腈溶液平衡化的反相ODS或OS相上分離，用比上述乙腈溶液濃度高的乙腈溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫出來(lái)的組分。
3.權(quán)利要求1的包括人在內(nèi)動(dòng)物的惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的制備方法，其中常壓或減壓下在通入氮?dú)獾榷栊詺怏w時(shí)加熱乳酸，得到的乳酸縮合物直接用乙腈溶解，用預(yù)先經(jīng)酸性乙腈溶液平衡化的反相ODS或OS柱分離，用比上述乙腈溶液濃度高的乙腈溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫出來(lái)的組分。
4.權(quán)利要求2記載的制備方法，其中乳酸為L(zhǎng)-乳酸。
5.權(quán)利要求2記載的制備方法，其中乳酸縮合物為L(zhǎng)-乳酸低縮合物。
6.權(quán)利要求3記載的制備方法，其中平衡化乙腈酸性溶液為PH2～3、乙腈濃度10～25%。
7.權(quán)利要求4記載的制備方法，其中乙腈酸性水溶液的乙腈濃度依次上升而進(jìn)行梯度洗脫。
8.權(quán)利要求5記載的制備方法，其中上述濃度70%以上的乙腈酸性溶液洗脫前，反相柱經(jīng)PH2～3的35～50%乙腈酸性溶液洗脫。
9.權(quán)利要求2記載的制備方法，其中常壓下、加熱溫度130℃以上。
10.權(quán)利要求2記載的制備方法，其中減壓下、加熱溫度120℃以上。
11.權(quán)利要求2記載的制備方法，其中常壓下低溫加熱，在與單體共存水分及縮合反應(yīng)精制的水分被蒸餾出去后，經(jīng)2～3階段的減壓和升溫后達(dá)20mmHg以下及150～170℃，最后在10mmHg以下、180～200℃加熱1～2小時(shí)，蒸餾出殘存單體及低沸點(diǎn)物質(zhì)。
全文摘要
包括人在內(nèi)動(dòng)物惡性腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑的制備方法中，常壓或減壓通惰性氣體時(shí)加熱乳酸，蒸出水分，得到的低聚物懸浮在甲醇中，一定溫度下平衡化后過(guò)濾，減壓干燥后溶于乙腈，用預(yù)先用pH2～3的10～25％乙腈溶液平衡化的反相ODS柱分離，pH2～3的35～50％乙腈溶液洗脫后用70％以上的乙腈溶液洗脫，收集組分而得縮合度5～25的L-乳酸直鏈狀縮合物和縮合度2～15的L-乳酸環(huán)狀縮合物的混合物。
文檔編號(hào)A61K31/215GK1081364SQ92105718
公開(kāi)日1994年2月2日 申請(qǐng)日期1992年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月14日
發(fā)明者加藤陽(yáng)樹(shù), 長(zhǎng)主陽(yáng)一朗, 陸可德 申請(qǐng)人:全球技術(shù)股份公司