專利名稱:一種治療性乙肝疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，更具體地說，它涉及用于慢性乙型肝炎的一種治療性 乙肝疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎是我國常見的傳染病之一，我國屬乙型肝炎病毒(HBV)高流行區(qū)， HBV感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，但在慢性乙型肝炎治療方面一直未取得突破性進(jìn)展。
直至目前，臨床上對(duì)慢性乙型肝炎的治療仍面臨著不少的困惑，雖然治療的總體 目標(biāo)是明確的，即最大限度的長期抑制或消除HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及纖維化，延緩和 阻止疾病的進(jìn)展等。但在實(shí)施過程中還存在著許多困難和爭(zhēng)議。HBV的持續(xù)存在和復(fù)制是 導(dǎo)致病情進(jìn)行性發(fā)展的主要原因，因此抗病毒治療是關(guān)鍵手段，盡管核苷(酸)類似物有 了長足的發(fā)展，但由于HBV的耐藥變異、HBV DNA可能與宿主基因的整合以及環(huán)狀共價(jià)閉合 DNA(cccDNA)難以清除等因素，以致抗病毒治療存在著不徹底性。因此免疫干預(yù)的作用應(yīng)當(dāng) 引起我們的關(guān)注，雖然目前還缺乏特異性的免疫干預(yù)制劑，但歸根結(jié)底調(diào)動(dòng)和誘導(dǎo)機(jī)體自 身的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，是有效治療慢性乙型肝炎的重要途徑。
大量試驗(yàn)研究及臨床觀察表明，HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答在慢性乙型肝炎病變的 發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和清除HBV起著至關(guān)重要的作用。在急性HBV感染過程中，多克隆多特異 性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，使HBV的復(fù)制迅速被抑制以致完全清除(Sobau Y,et al. JHepatology, 2002)，患者痊愈。而慢性HBV感染者，針對(duì)HBV的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答低下，甚至呈現(xiàn)對(duì) HBV的免疫耐受狀態(tài)。增強(qiáng)和促進(jìn)HBV特異性的⑶8+毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和⑶4+輔助 性T淋巴細(xì)胞(HTL)的活化，以非靶細(xì)胞損傷為主的清除HBV機(jī)制是機(jī)體清除HBV的十分 重要的方式?；罨蘑?+CTL—方面分泌IFN-Y、TNF-α等細(xì)胞因子，通過抑制前基因組 RNA(pgRNA)和縮短細(xì)胞核內(nèi)cccDNA半衰期，抑制以致清除HBV，另外也可通過溶細(xì)胞的機(jī) 制清除HBV。但只有當(dāng)CD8+CTL應(yīng)答非溶細(xì)胞損傷機(jī)制不能有效抑制HBV復(fù)制時(shí)，才啟動(dòng)凋 亡和溶細(xì)胞的機(jī)制，其途徑包括穿孔素顆粒酶系統(tǒng)、Fas/Fas配體系統(tǒng)、TNF/TNF受體系統(tǒng) 和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體。
研究表明，慢性乙肝患者外周血存在著高水平的HBV顆粒和HBV蛋白，而且是抑制 患者細(xì)胞免疫應(yīng)答低下或耐受的主要原因之一(Schlaak JF，et al. J Hepatol, 1999 ；Chen M,etal. J Virol, 2005)。慢性乙型肝炎患者免疫應(yīng)答功能低下或免疫耐受主要表現(xiàn)為樹突 狀細(xì)胞(DCs)包括mDC和pDC數(shù)量下降、功能損傷，HTL的功能缺陷、CD8+CTL的數(shù)量減少和 功能下降以及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)抑制效應(yīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞外環(huán)境的改變。 此外，共抑制分子PDL-1/PD-1信號(hào)途徑也參與了 HBV慢性感染過程中CTL的損傷(Leibsim PJ. Curv Opin Immunol, 2004) 0還有人指出慢性乙肝患者天然免疫應(yīng)答也有所減弱，天然 免疫在HBV的清除過程中起著重要作用，特別在感染的初期，pDC可先產(chǎn)生IFN-α β，ΝΚ和 NKT細(xì)胞通過I10Il樣受體途徑被活化即可產(chǎn)生IFN- γ，80%復(fù)制高峰期的HBV可被ΝΚ、ΝΚΤ 細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒作用抑制和清除。[0006]綜上所述，慢性乙型肝炎治療除使用抗HBV藥物外，免疫干預(yù)治療 是必不可少的重要途徑，而后者的主要選擇就是以基于細(xì)胞因子的免疫治療 (cytokine-basedimmunotherapy)或治療t生疫苗(therapeutic vaccines) (Depla Ε, et al. J Virol,2007)。
本申請(qǐng)的發(fā)明人通過長期的實(shí)驗(yàn)研究，設(shè)計(jì)以多個(gè)HBV特異性CTL和HTL多肽 表位為抗原肽，以重組人的白介素_12(rhIL-12)作為佐劑的慢性乙型肝炎治療性疫苗， rhIL-12既可作為佐劑增加多肽表位的抗原性和免疫應(yīng)答效應(yīng)，而且rhIL-12是免疫網(wǎng)絡(luò) 中占有十分重要地位的核心細(xì)胞因子，具有多重功能，不但是連接天然免疫和獲得性免疫 的橋梁，而且是細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者(Decchio MD, et al. Clin Cancer Res，2007)。 研究證明NKT細(xì)胞表達(dá)豐富的IL-12R復(fù)合物，是rhIL-12免疫調(diào)節(jié)作用的首要目標(biāo)，而NK 細(xì)胞無論活化與否均存在IL-12R，因此二者被rhIL-12激活后均可產(chǎn)生以IFN-γ為主的細(xì) 胞因子，通過非溶細(xì)胞和溶細(xì)胞機(jī)制抑制HBV的復(fù)制。更重要的是rhIL-12調(diào)節(jié)Thl/Th2 應(yīng)答(Rossol S，et al. J Clin hvest，1997)，使其向 Thl 傾斜。rhIL-12 還是誘生 CTL 免 疫應(yīng)答最佳的細(xì)胞因子。rhIL-12作為第三信號(hào)在初始CD8+細(xì)胞活化增殖中起重要作用。 因此，HBV多肽表位誘導(dǎo)HTL和CTL的活化作用，能被rhIL-12所明顯放大。因此在多肽表 位的刺激下HTL和CTL活化后，其細(xì)胞表面表達(dá)高親和力的IL-12R，與rhIL-12結(jié)合后進(jìn)一 步促使其轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)性T細(xì)胞，通過分泌以IFN-Y為主的細(xì)胞因子和細(xì)胞毒作用，抑制和 清除HBV。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題的關(guān)鍵所在是篩選源自HBV核心抗原(HBcAg)、HBV包膜 蛋白抗原(HBsAg)和多聚酶的CTL、HTL優(yōu)勢(shì)表位多肽中加入佐劑rhIL-12，形成一種新型 治療性乙肝疫苗。
本發(fā)明的要解決的另一技術(shù)問題是提供一種上述治療性乙肝疫苗的制備方法。
本發(fā)明的前一技術(shù)方案是這樣的一種治療性乙肝疫苗，其特征在于該疫苗是由 人體有效劑量的表位多肽、重組人白介素-12和藥用輔料共同組成的凍干制劑，其中表位 多肽和重組人白介素-12重量之比為200 20000 1，其中的表位多肽由CTL表位多肽和 HTL表位多肽組成。
上述一種治療性乙肝疫苗中，所述的表位多肽中CTL表位多肽和HTL表位多肽的 重量比約為2 1 ；所述的CTL表位多肽、HTL表位多肽、重組人白介素-12的重量范圍為 6mg IOOyg ;3mg 1 μ g 10 μ g ；所述的藥用輔料為甘露醇或蔗糖或白蛋 白或右旋糖酐或聚維酮40或NaCl或水解明膠或乳糖或山梨醇中的至少一種。
上述一種治療性乙肝疫苗中，所述的CTL表位多肽為乙型肝炎病毒來源的CTL表 位多肽中的一條或多條，包括HBV包膜蛋白抗原中第183 191氨基酸序列FLLTRILTI或 236 245氨基酸序列RWMCLRRFII或249 258氨基酸序列ILLLCLIFLL或313 321 氨基酸序列IPIPSSWAF或332 342氨基酸序列RFSWLSLLVPF或335 343氨基酸序列 WLSLLVPFV或359 369氨基酸序列WMMWYWGPSLY或它們的變異序列、HBV核心抗原中第 18 27氨基酸序列FLPSDFFPSV或19 27氨基酸序列LPSDFFPSV或88 96氨基酸序 列YVNVNMGLK或101 110氨基酸序列LWFHISCLTF或117 125氨基酸序列EYLVSFGVW或137 147氨基酸序列LTFGRETVLEY或141 151氨基酸序列STLPETTVVRR或419 428氨基酸序列DLLDTASALY或它們的變異序列和HBV多聚酶抗原中第47 55氨基酸序 列NVSIPWTHK或149 159氨基酸序列HTLWKAGILYK或166 173氨基酸序列ASFCGSPY 或3 363氨基酸序列TPARVTGGVF或388 397氨基酸序列LVVDFSQFSR或392 401 氨基酸序列SWPKFAVPNL或415 似4氨基酸序列LSLDVSAAFY或似9 437氨基酸序列 HPAAMPHLL或455 463氨基酸序列GLSRYVARL或530 539氨基酸序列FPHCLAFSYM或 531 539氨基酸序列SAICSVVRR或538 546氨基酸序列YMDDVVLGV或562 570氨基酸 序列FLLSLGIHL或640 650氨基酸序列YPALMPLYACI或665 674氨基酸序列QAFTFSPITK 或745 753氨基酸序列KYTSFPWLL或它們的變異序列。優(yōu)選FLPSDFFPSV或YVNVNMGLK或 STLPETTVVRR 或 TPARVTGGVF 或 HTLWKAGILYK 或 IPIPSSWAF 或 RWMCLRRFII 或 YMDDVVLGV。
上述一種治療性乙肝疫苗中，所述的HTL表位多肽為乙型肝炎病毒來源的HTL表 位多肽和padre序列AKFVAAWTLKAAA中的一條或多條，乙型肝炎病毒來源的HTL表位多 肽包括HBV包膜蛋白抗原中第180 194氨基酸序列AGFFLLTRILTIPQS或339 353氨 基酸序列LVPFVQWFVGLSPTV或它們的變異序列、HBV核心抗原中第50 69氨基酸序列 PHHTALRQAILCffGELMTLA 或 120 139 氨基酸序列 VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI 或它們的變異 序列和HBV多聚酶抗原中第96 110氨基酸序列VGPLTVNEKRRLKLI或145 159氨基 酸序列RHYLHTLWKAGILYK或385 399氨基酸序列ESRLVVDFSQFSRGN或412 似6氨基 酸序列 LQSLTNLLSSNLSWL 或 420 4；34 氨基酸序列 SSNLSWLSLDVSAAF 或 501 515 氨基 酸序列LHLYSHPIILGFRKI或523 537氨基酸序列PFLLAQFTSAICSVV或618 632氨基 酸序列KQCFRKLPVNRPIDW664 678氨基酸序列KQAFTFSPTYKAFLC或694 708氨基酸 序列 LCQVFADATPTGWGL 或 767 781 氨基酸序列 AANWILRGTSFVYVP 或 774 788 氨基 酸序列GTSFVYVPSALNPAD或它們的變異序列；優(yōu)選HTL表位多肽為AGFFLLTRILTIPQS或 LHLYSHPIILGFRKI 或 AKFVAAWTLKAAA 或 RHYLHTLWKAGILYK。
本發(fā)明的后一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種治療性乙肝疫苗的制備方法，包括以下步 驟(1)用Fmoc固相肽合成法合成所需表位多肽；(2)在100級(jí)以下車間，量取各抗原表位 肽、rhIL-12,加入藥用輔料，用注射用水溶解，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，分裝于 適當(dāng)容量玻璃容器瓶中，冷凍干燥，扎蓋，包裝即得成品。
本發(fā)明的還提供上述治療性乙肝疫苗在慢性乙肝感染治療中的應(yīng)用，以及它在乙 肝病毒相關(guān)腫瘤的預(yù)防和治療中的應(yīng)用。
以下從二個(gè)組分的具體研制過程和使用進(jìn)行詳細(xì)說明。
在應(yīng)用抗原分子進(jìn)行免疫干預(yù)方面，基本上已放棄病原體或天然抗原整體分子， 雖然其抗原性強(qiáng)，但由于其中含有不適當(dāng)、抑制性甚至病理性表位可以導(dǎo)致免疫損傷甚至 免疫顛覆，因此選擇的途徑多遵循由病原體、蛋白質(zhì)分子逐步過度到表位多肽。其優(yōu)點(diǎn)是誘 導(dǎo)的免疫應(yīng)答有針對(duì)性，特異性強(qiáng)，但免疫原性依次下降，以致單純應(yīng)用表位多肽常常達(dá)不 到滿意的符合治療要求的免疫應(yīng)答。本申請(qǐng)的發(fā)明采用(1)表位多肽的合理組合與搭配; (2)以細(xì)胞因子rhIL-12為佐劑；(3)廣譜高效的表位，HTL PADRE作為CTL表位的重要協(xié) 同成分，它不僅可以和很多DR分子相結(jié)合，還可以與某些MHC II類分子相結(jié)合，該表位在 誘導(dǎo)特異性CTL免疫應(yīng)答方面比天然的HTL表位高1000倍以上，因此能夠克服單純應(yīng)用多 肽表位具有的抗原性較低的缺陷。[0018]研究所用的多肽表位采用固相合成技術(shù)，高效液相色譜(HPLC)純化，十分注意不 同多肽表位氨基酸組成分析，質(zhì)譜、氨基酸序列測(cè)定對(duì)其結(jié)構(gòu)確定的重要意義，特別關(guān)注其 生物特性尤其是其免疫原性的觀察和研究，因?yàn)榕c其他化學(xué)藥物相比，合成多肽穩(wěn)定性較 差，易降解、氧化，體內(nèi)半衰期短。在注意這些基本方面的前提下，我們遵循以下原則篩選 HBV特異性的CTL和HTL表位。
(1)盡可能選擇較多的多肽表位形成MAP，以保證能誘導(dǎo)較全面的多特異性的CTL 和 HTL 效應(yīng)(Depla E, et al. J virol，2007)。
(2)選擇來自HBV蛋白不同部分HBcAg、HBsAg和多聚酶(Polymerase)的多種CTL 和HTL表位，以提高應(yīng)答能力和調(diào)節(jié)作用。
(3)選擇CTL和HTL表位時(shí)，應(yīng)考慮到限制這些表位的HLA類型，特別是HLA超型 的選擇，盡量增加這些多肽表位的不同HLA類型的覆蓋范圍，以提高其潛在的識(shí)別率；
(4)充分注意提高免疫原性的通用的HTL表位，即泛化的DR輔助性T細(xì)胞表位 (PanDR-helper T cell 印itopes，PADRE)，以提高對(duì)多肽疫苗的應(yīng)答水平(Alexander J 等，1994)，避免對(duì)HBV感染個(gè)體的免疫損傷。應(yīng)當(dāng)指出，⑶4+T細(xì)胞的活化可分泌IL-2、 IL-12等細(xì)胞因子，是CTL發(fā)育、誘導(dǎo)成熟擴(kuò)增及有效維持的必要條件(Rige JP, et al. Nature,1998)。
(5)多選擇來自多聚酶的多肽表位有助于克服HBV抗原引起的免疫損傷，因?yàn)檫@ 種抗原的含量遠(yuǎn)較體內(nèi)其他HBV抗原含量為少(Mizukoshi E，et al. J Immunol，2004)。
(6)選擇相對(duì)保守度高的多肽表位序列，選用這種在病毒基因穩(wěn)定存在的序列制 成的疫苗，不但可以最大限度的抵抗現(xiàn)有的HBV，而且還可以避免病毒變異導(dǎo)致免疫逃逸；
(7)選擇與HLA有高度或中度親和力的表位(與HLA I類分子高度親和的表位IC50 高于或等于50nM，與HLAII類分子高度親和的表位IC5tl高于或等于ΙΟΟηΜ，中度親和的IC5tl 在 100 IOOOnM) (Alessandro 等，1999)。
采用下列方法篩選和優(yōu)化HBV多肽表位組合
(1)應(yīng)用ELISA法檢測(cè)和比較候選的HBV多肽組合、rhIL-12，和多肽組合與 rhIL-12對(duì)人PBMC產(chǎn)生IFN- γ的影響；
(2)應(yīng)用Elispot方法篩選和觀察HBV多肽組合、rhIL-12，和多肽組合與rhIL-12 對(duì)人PBMCs IFN- y +細(xì)胞頻率的影響；
(3)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，觀察HBV多肽組合與rhIL-12對(duì)人PBMC產(chǎn)生IFN- γ的細(xì)胞 來源，主要觀察IFN- y +的⑶8+CTL、⑶4+Thl和NK細(xì)胞的分布情況。
候選的HBV多肽總計(jì)47個(gè)，其中來自HBcAglO個(gè)，來自HBsAg 9個(gè)，來自多聚酶28 個(gè)。[0031 ] 通過上述3種方法的篩選，我們選擇FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、 TPARVTGGVF、HTLffKAGILYK, IPIPSSffAF, RffMCLRRFII, YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、 LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAffTLKAAA 和 RHYLHTLWKAGILYK 這 12 個(gè)多肽表位，把它們作為 MAP(mutiple antigen peptide system)的成員，形成優(yōu)化的組合與搭配。 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過5年多的研究，成功地構(gòu)建了高表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株， 從靜止培養(yǎng)過渡到連續(xù)培養(yǎng)，形成了中試規(guī)模，用改進(jìn)的純化方法，所得rhIL-12純度達(dá)到 98%。經(jīng)質(zhì)譜MALD-TOF分子量檢測(cè)與理論相符合，其質(zhì)譜肽圖N-端氨基酸序列與理論完全符合，SDS-PAGE電泳、免疫印跡結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)帶一致。應(yīng)用Elispot試驗(yàn)，外周血PBMC刺 激試驗(yàn)和多色流式細(xì)胞儀進(jìn)行了多項(xiàng)藥效學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告一致(參考中國專利公 開號(hào) CN101033254A)。
HBV多肽組合對(duì)人PBMC產(chǎn)生IFN- γ的影響結(jié)果表明，單獨(dú)應(yīng)用HBV多肽組合對(duì) PBMC產(chǎn)生IFN- γ只有輕度增加，單獨(dú)應(yīng)用rhIL-12也只誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN- γ輕度增加， HBV多肽組合與rhIL-12聯(lián)合應(yīng)用則明顯促進(jìn)PBMC產(chǎn)生IFN- y。Balb/c小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果 也證明，應(yīng)用多肽組合和rhIL-12聯(lián)合免疫，每天一次，連續(xù)5天，在免疫后2周，HBV多肽 組合和rhIL-12聯(lián)合應(yīng)用組脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ水平明顯較單用HBV多肽或rhIL-12 明顯提高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，IFN-Y的增量來源以HTL和CTL為主，其次為NK細(xì)胞。 上述試驗(yàn)結(jié)果表明，以HBV多肽表位組合為抗原，以rhIL-12為佐劑的新型乙肝疫苗可以強(qiáng) 烈誘導(dǎo)以HTL和CTL為主的免疫應(yīng)答，顯示了良好的應(yīng)用前景。
已經(jīng)證明rhIL-12可以活化NKT、NK細(xì)胞和γ δ T細(xì)胞，NKT和NK均存在rhIL_12 受體(Lanzen N M, et al. Cell Immunol，2006)，相結(jié)合產(chǎn)生以IFN-γ為主的細(xì)胞因子，具 有非溶細(xì)胞及溶細(xì)胞的免疫作用。而且NKT和NK活化的結(jié)果可使單核細(xì)胞直接分化為DC， 導(dǎo)致人對(duì)DC的調(diào)節(jié)，包括上調(diào)⑶40的表達(dá)，調(diào)整⑶40和⑶40L的相互作用，促進(jìn)DC激活， 提高DC對(duì)HBV多肽組合的功能，加速HBV特異性和CTL的活化，激發(fā)IFN- γ的分泌。特別 應(yīng)當(dāng)指出，rhIL-12可以調(diào)節(jié)Thl/Th2應(yīng)答，使其向Thl傾斜，協(xié)助HBV多肽，誘導(dǎo)Thl細(xì)胞 發(fā)育和增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞的功能，使其分泌IL-2，IL-3，IFN- γ，TNF- β和GM-CSF, rhIL-12 和⑶觀+協(xié)同誘導(dǎo)靜息型T細(xì)胞增生，rhIL-12與HBV多肽抗原共刺激，使特異性的CTL增殖 并表現(xiàn)疊加或倍增效應(yīng)，增加CTL釋放IFN- γ、穿孔素、顆粒酶A及顆粒酶B，提高其非溶細(xì) 胞和溶細(xì)胞清除HBV機(jī)制。還要指出rhIL-12作為第三信號(hào)對(duì)初始的CD8+T細(xì)胞的活化與 增殖起誘導(dǎo)作用，特別是在HBV抗原水平較低時(shí)起誘導(dǎo)的作用是十分重要的。rhIL-12可活 化IL-2Ra鏈(⑶25)的表達(dá)能力，而且其誘導(dǎo)功能比TCR和/或rhIL-2的誘導(dǎo)功能更強(qiáng)， 因此rhIL-12作為第三信號(hào)在一定程度上決定了初始T細(xì)胞能否進(jìn)一步分化(Curtsinger J M，et al. J Exp Med, 2003) 還應(yīng)指出rhIL-12誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生多種生物效應(yīng)(Ima A， et al. HaematOlOgiCal，2002)，在抗原特異性應(yīng)答期內(nèi)對(duì)多數(shù)同型抗體的生成產(chǎn)生增強(qiáng)效 應(yīng)，rhIL-12刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞活化生成IFN- γ，促使IgGl向IgG2轉(zhuǎn)化，并對(duì)IgGl的 生成產(chǎn)生抑制作用，而IgG2/IgGl > 1時(shí)，則有助于Thl的應(yīng)答。因此rhIL-12在協(xié)助HBV 多肽表位誘導(dǎo)放大免疫應(yīng)答是十分重要的。綜上所述，rhIL-12不僅能活化NKT、NK、T細(xì) 胞以非溶細(xì)胞為主要方式抑制和清除HBV，而且還可以促進(jìn)APC的功能，加速DC成熟，提高 DC對(duì)HBV多肽組合的遞呈效率，促進(jìn)HBV特異性CTL和HTL的活化(Xiong SQ, et al. Int immunophar macol，2007)o
最新的研究表明，rhIL-12可以增強(qiáng)記憶性中央型T細(xì)胞的活化或應(yīng)答；在中央型 記憶性⑶+細(xì)胞轉(zhuǎn)化為⑶4+效應(yīng)性T細(xì)胞是必須的。效應(yīng)性記憶性⑶8T細(xì)胞在缺乏同源 抗原下，rhIL-12可以促使其分泌IFN- y。HBV特異性記憶性T細(xì)胞在HBV疫苗的應(yīng)答中 占有地位是十分重要的。rhIL-12這一作用再次說明HBV的特異性HTL和CTL表位產(chǎn)生應(yīng) 答效應(yīng)，與rhIL-12的佐劑作用是十分重要的和不可缺少的。
多肽表位組合作為再次進(jìn)入機(jī)體HBV相同抗原與記憶性T細(xì)胞(包括⑶4+和⑶8+T 細(xì)胞)再次接觸時(shí)，能迅速殺滅或清除被感染的細(xì)胞，同時(shí)分泌細(xì)胞因子來抑制HBV的復(fù)制并調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能。這一點(diǎn)是免疫網(wǎng)絡(luò)對(duì)HBV多肽表位為抗原肽以rhIL-12為佐 劑的疫苗的重要作用機(jī)制之一。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1多肽表位的制備
多肽的制備用Fmoc固相肽合成法，首先將一個(gè)用Fmoc基團(tuán)對(duì)α -氨基進(jìn)行保護(hù) 的氨基酸通過一個(gè)支臂連結(jié)到一個(gè)不溶性載體上，隨后將α-氨基脫保護(hù)，用溶液洗滌氨 基酸-支臂-樹脂。將第二個(gè)預(yù)先活化的α -氨基保護(hù)的氨基酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接上去，縮 合反應(yīng)完成后，用溶液洗滌，重復(fù)進(jìn)行脫保護(hù)、耦聯(lián)，直到得到目的肽。最后將肽-支臂-樹 脂裂解。多肽純化，用HPLC法，粗肽產(chǎn)品經(jīng)C18高壓柱分離純化，用液相色譜儀跟蹤收集所 需流出液，樣品峰合并后去鹽、凍干，制得多肽精品。以下以HBcAg(18-27)的制備過程為 例，敘述合成過程。
(I)HBcAg (18-27)合成[0041 ] a) Fmoc-Val-Wang樹脂的溶脹及脫Fmoc保護(hù)
稱取Fmoc-Val-Wang樹脂62. 5克(150目，0. 8mmol/g)，裝入專用的反應(yīng)器中，開 啟CS936生產(chǎn)型多肽合成儀總電源，打開工作站，調(diào)用事先編著的接肽程序。用700mlDMF 浸泡，使樹脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?。加?00ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮 氣吹慮去PIP，用DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>b) Fmoc-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Ser (tBu) -0H57. 5g, H0Bt20. 5g, DIC 50. 6g, 300mlDMF,將混合物 25°C振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>c) Fmoc-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Pro-OH 50. 6g,H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，將混合物 25°C振搖 1 小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>d) Fmoc-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Phe-OH 58. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，將混合物 25°C振搖 1 小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>e) Fmoc-Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Phe-OH 58. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，將混合物 25°C振搖 1 小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?7/35
f) Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH 61.7g, H0Bt20. 5g, DIC 50. 6g,300mlDMF,將混合物 25°C振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>g) Fmoc-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Ser (tBu) -OH 57. 5g, H0Bt20. 5g, DIC 50. 6g, 300mlDMF,將混合物 25°C 振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈?。[0061 ] h) Fmoc-Pro-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Pro-OH 50. 6g，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，將混合物 25°C振搖 1 小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>i) Fmoc-Leu-Pro-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的制備
加入Fmoc-Leu-OH 53. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，將混合物 25°C振搖 1 小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>j) Fmoc-Phe-Leu-Pro-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-樹脂的 制備
加入Fmoc-Phe-OH 58. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，將混合物 25°C振搖 1 小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌3次，氮?dú)獯蹈伞?br>加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌6次，氮?dú)獯蹈伞?br>再用無水乙醇洗滌3次。抽干后，放入真空氮?dú)獯蹈善髦械獨(dú)獯蹈桑帽Ｗo(hù)的 HBcAg (18-27)樹脂 103g。
k) Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val 的制備
取103g保護(hù)的HbcAg (18-27)樹脂轉(zhuǎn)移到切肽瓶中，冷卻，邊攪拌邊加入切肽試劑 (TFA/HBr/TIS/EDT = 700ml/28ml/43ml/21ml)，25°C攪拌 4 小時(shí)。過濾，減壓濃縮，濾液加 無水乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗，P205干燥，獲得切肽后的HbcAg (18-27)粗品，約45g。
(2)純化
將45g HbcAg (18-27)粗品溶于20L純化水中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相 0. 1MNH4AC 乙腈(75-25)，流速為300ml/min。用HPLC跟蹤收集所需要的流出液。樣品峰 合并后去鹽，凍干，得成品12. 5g(MW :11 )，總收率約22%。
其他抗原表位多肽的制備同上述工藝。
實(shí)施例2多肽表位的質(zhì)量控制
多肽表位的質(zhì)量控制檢測(cè)項(xiàng)目包括外觀、純度和分子量。[0078]多肽的外觀制備的抗原表位肽外觀應(yīng)為白色粉末狀；多肽的色譜分析采用 RP-HPLC對(duì)多肽進(jìn)行分析，色譜條件Waters公司C18色譜柱Q50X4. 6mm，5 μ m，IOnm)。流 動(dòng)相A(含0. 三氟乙酸的乙腈)。流動(dòng)相B(含0. 三氟乙酸的水)。線性梯度洗脫 0. 01 到 20. OOmin, B 從到 50%，流速1. Oml/min。檢測(cè)波長220nm。進(jìn)樣量10μ 1。 柱溫室溫。質(zhì)量要求純度> 98% ；多肽的質(zhì)譜鑒定用30%乙腈水溶液將樣品溶解為 0. 05mg/ml的溶液。取0. 51點(diǎn)于樣品板上，以0. 5 μ 1 HCCA作為基質(zhì)溶液進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 質(zhì)量要求多肽分子量的檢測(cè)結(jié)果與理論分子量一致。檢測(cè)結(jié)果見表1。
表1多肽表位HBcAg (18-27)的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于制備治療性乙肝疫苗的組合物，其特征在于該組合物是由人體有效劑 量的表位多肽、重組人白介素-12和藥用輔料共同組成的凍干制劑，其中表位多肽和重 組人白介素-12重量之比為200 20000 1，其中的表位多肽由來自乙肝病毒蛋白抗 原的 CTL 表位多肽 FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、 IPIPSSWAF, RWMCLRRFII, YMDDVVLGV 和 HTL 表位多肽 AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、 RHYLHTLffKAGILYK 以及通用 HTL 表位多肽 padre 序列 AKFVAAWTLKAAA 組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的組合物，其特征在于所述的表位多肽中CTL表位多肽HTL 表位多肽以及通用HTL表位多肽padre序列的重量比為2 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的組合物，其特征在于所述的CTL表位多肽、HTL表位多肽以及 通用HTL表位多肽padre序列、重組人白介素-12的重量范圍為200yg 6mg IOOyg 3mg 1 μ g 10 μ g。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的組合物，其特征在于所述的藥用輔料為甘露醇、蔗糖、白蛋 白、右旋糖酐、聚維酮40、NaCl、水解明膠、乳糖或山梨醇中的至少一種。
5.權(quán)利要求
1所述一種用于制備治療性乙肝疫苗組合物的制備方法，其特征在于包括 以下步驟(1)用Fmoc固相肽合成法合成所需表位多肽；( 在100級(jí)以下車間，量取各抗 原表位肽和rhIL-12，加入藥用輔料，用注射用水溶解，溶液經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌， 分裝于適當(dāng)容量玻璃容器瓶中，冷凍干燥，扎蓋，包裝即得成品。
6.權(quán)利要求
1所述的組合物在制備慢性乙肝感染以及預(yù)防和治療乙肝病毒相關(guān)腫瘤 的治療性乙肝疫苗中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種治療性乙肝疫苗及其制備方法和用途，其技術(shù)方案的關(guān)鍵是篩選了源自HBV包膜蛋白、核心抗原和多聚酶(polymerase)多個(gè)CTL和HTL多肽表位，形成多重抗原肽系統(tǒng)(MAP)，并以重組人的白細(xì)胞介素12(rhIL-12)為佐劑，以提高其免疫原性和應(yīng)答水平，可為臨床上慢性乙型肝炎的治療提供一種治療性的生物制劑。
文檔編號(hào)A61P31/20GKCN101361969 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810026075
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2008年1月29日
發(fā)明者于源, 葉倩君, 吳思紋, 夏書奇, 張宜俊, 曾振飛, 李平, 段詳, 熊偉宏, 王增松, 王翠玲, 王艷, 趙峰, 邱向南, 黃觀鳳 申請(qǐng)人:廣州市愷泰生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan