背景技術：

1、白細胞介素18(il-18)(也稱為干擾素-γ誘導因子，igif)是一種多效性促炎細胞因子，其可調(diào)節(jié)先天和適應性免疫系統(tǒng)反應。已確定il-18在調(diào)節(jié)炎性級聯(lián)中起重要作用，這使其成為抑制包括但不限于腸道、心臟和肺部的炎性疾病的自身免疫性疾病的理想靶標(kaplanski?g.immunol.rev.(2018)；281(1):138-153)。il-18也在臨床前模型中被證明具有抗腫瘤活性。臨床試驗中的il-18療法重點關注使用重組il-18變體來激動il-18受體復合物(il-18r)。這些療法包括sb-485232(tadekinig?alfa)(其是正在由gsk研究用于治療黑色素瘤的重組il-18)，以及st-067(其是由simcha?therapeutic進行臨床開發(fā)用于治療實體瘤的il-18的經(jīng)工程化變體)。

2、il-18r復合物是一種表達于包括巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷(nk)細胞和經(jīng)歷過抗原的t細胞在內(nèi)的多種細胞的異二聚體受體(il-18rα/il-18rβ)(gracie?j.a.等人，j.leukoc.biol.(2003)；73(2):213-24)。在il-18與il-18rα亞基結合后，il-18rβ被募集形成與其他il-1r家族成員共有的誘導高親和力復合物的信號傳導通路。這些下游信號傳導效應子通路是與其他關鍵免疫調(diào)控性分子(如toll樣受體細胞)共有的(gracie?j.a.等人，j.leukoc。biol.(2003)；73(2):213-24)。

3、雖然早期臨床試驗正在研究施用僅由重組或經(jīng)工程化il-18組成的治療劑的方法，但有幾個因素可能導致此種治療失敗。例如，il-18單獨與細胞外信號傳導結構域成分il-18rα結合，但不與il-18r受體復合物的銜接分子il-18rβ結合(takei?s.等人；arthritis?res.ther.(2011)；13(2):r52)。然而，與il-18r的兩個亞基都結合是信號轉導所必需的，并且因此也是激活炎性介質所必需的。相反，激動性抗體可以被工程化成獨立地與這兩個受體亞基接合。重組il-18被它的由il-18r信號傳導誘導的內(nèi)源性抑制劑il-18結合蛋白(il-18bp)迅速中和。激動性抗體支架不結合il-18bp，這使得其能夠以持續(xù)的方式激活il-18r。雖然il-18可以被工程化成不與il-18bp結合(zhao?t等人；nature；583,609-14(2020))，但突變蛋白分子攜帶有顯著的突變負荷，這使其具有潛在的免疫原性并且因此容易被宿主免疫系統(tǒng)快速中和。最后，重組或內(nèi)源性il-18是一種高親和力、短半衰期蛋白質，該蛋白質會在施用部位處被局部捕獲并被迅速消除，這限制了其在施用部位遠側的腫瘤中誘導信號傳導的能力?？贵w激動劑可以被工程化成具有長的消除半衰期和對表達il-18r的細胞的減弱的親和力，從而使其相對于重組或經(jīng)工程化的il-18在靶組織中具有延長的藥代動力學和藥效學。

技術實現(xiàn)思路

1、本公開通過提供可以有效地使il-18受體的il18rα和il18rβ亞基交聯(lián)并從而激活il-18r介導的細胞信號傳導的異聚體抗體而改進了現(xiàn)有技術。

2、在某些實施方案中，本公開提供了一種多特異性結合蛋白，其包含特異性地結合至人il-18rα的第一結合部分和特異性地結合至人il-18rβ的第二結合部分，其中該多特異性結合蛋白能夠通過誘導人il-18r的il-18rα和il-18rβ亞基之間的接近來誘導il-18受體信號傳導。

3、在一個方面，本公開提供了一種多特異性結合蛋白，其包含特異性地結合至人il-18rα的第一結合部分和特異性地結合至人il-18rβ的第二結合部分，其中該多特異性結合蛋白刺激抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生而相對于il-18對mcp-1的產(chǎn)生、gm-csf的產(chǎn)生或者急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生的刺激，基本上不刺激mcp-1的產(chǎn)生、gm-csf的產(chǎn)生或者急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生。

4、在某些實施方案中，抗腫瘤細胞因子選自由ifn-γ、il-2、il-12、il-15、cd40l和tnfα組成的組。

5、在某些實施方案中，急性炎性或th2反應標志物選自由il-6、il-1β、il-8、il-4、il-5和il-13組成的組。

6、在某些實施方案中，抗腫瘤細胞因子和急性炎性或th2反應標志物是在外周血單核細胞(pbmc)測定中測定的。

7、在某些實施方案中，該pbmc測定包括：1)將第一pbmc群體與多特異性結合蛋白一起溫育至少24小時(例如，24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時或96小時)；2)將第二pbmc群體與il-18一起溫育至少24小時(例如，24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時或96小時)；以及3)測量來自第一和第二pbmc群體的抗腫瘤細胞因子和急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生。

8、在某些實施方案中，多特異性結合蛋白刺激急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生比il-18少至少5倍、少至少10倍、少至少50倍或少至少100倍。

9、在某些實施方案中，多特異性結合蛋白刺激急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生比il-18少至少5倍、少至少10倍、少至少50倍或少至少100倍，如在pbmc測定中所測量的。

10、在某些實施方案中，多特異性結合蛋白刺激gm-csf的產(chǎn)生比ifn-γ的產(chǎn)生少至少5倍、少至少10倍、少至少50倍或少至少100倍。

11、在某些實施方案中，本公開提供了一種多特異性結合蛋白，其包含特異性地結合至人il-18rα的第一結合部分和特異性地結合至人il-18rβ的第二結合部分，其中該多特異性結合蛋白能夠具有il-18受體信號傳導的激動劑活性。

12、在某些實施方案中，本公開提供了一種多特異性結合蛋白，其包含用于特異性地結合至人il-18rα的裝置(means)和用于特異性地結合至人il-18rβ的裝置。在某些實施方案中，多特異性結合蛋白能夠通過誘導人il-18r的il-18rα和il-18rβ亞基之間的接近來誘導il-18受體信號傳導。在某些實施方案中，多特異性結合蛋白能夠具有il-18受體信號傳導的激動劑活性。

13、在某些方面，第一結合部分包含il-18rαvhh結構域并且第二結合部分包含il-18rβvhh結構域。

14、在某些方面，il-18rαvhh結構域和il-18rβvhh結構域位于單獨的多肽上。

15、在某些方面，il-18rαvhh結構域和il-18rβvhh結構域位于同一多肽上。

16、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有sydmg(seq?id?no:1)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有alrwsggstsyadsvkg(seq?id?no:2)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有tletdsgtywady(seq?id?no:3)的氨基酸序列的hcdr3序列。

17、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有atgmg(seq?id?no:4)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有risstgspnyvdfvkg(seq?id?no:5)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有vgttlfa(seq?id?no:6)的氨基酸序列的hcdr3序列。

18、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有tkglg(seq?id?no:7)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有gissagwifytqsvkg(seq?idno:8)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有aqsgvplrs(seq?id?no:9)的氨基酸序列的hcdr3序列。

19、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有inimd(seq?id?no:10)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有rispgdiityandvkg(seq?id?no:11)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有rqgagdy(seq?id?no:12)的氨基酸序列的hcdr3序列。

20、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有dyvlg(seq?id?no:13)的氨基酸序列的hcdr1序列，

21、含有cissrgrylnyaetvkg(seq?id?no:14)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有vrrvsevcklaeddfas(seq?id?no:15)的氨基酸序列的hcdr3序列。

22、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有khamg(seq?id?no:16)的氨基酸序列的hcdr1序列。

23、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有aidwsggstyyads?vkg(seq?id?no:17)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有dsytd?yaqlwlpeleseydy(seq?id?no:18)的氨基酸序列的hcdr3序列。

24、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有sytmg(seq?id?no:19)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有aiswsagrtyyadsvkg(seq?id?no:20)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有eeapdwapidcsgygclslydy(seq?id?no:21)的氨基酸序列的hcdr3序列。

25、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有idfmg(seq?id?no:22)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有tittggstnyadsvkd(seq?id?no:23)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有vvhttsrppvly(seq?id?no:24)的氨基酸序列的hcdr3序列。

26、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有nydmg(seq?id?no:25)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有visgpggiafygdsvkg(seq?id?no:26)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有aprgsyyr?rtnsydy(seq?id?no:27)的氨基酸序列的hcdr3序列。

27、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有ryg(seq?id?no:28)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有diywnggntyytdsvkg(seq?id?no:29)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有atsyyavtdplkvay(seq?id?no:30)的氨基酸序列的hcdr3序列。

28、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有nwymr(seq?id?no:31)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有sinsggddtdyadsvkg(seq?id?no:32)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有gadrv(seq?id?no:33)的氨基酸序列的hcdr3序列。

29、在某些方面，多特異性結合蛋白的第二結合部分包含il-18rβvhh結構域。

30、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有syt?mg(seq?id?no:19)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有alsww?nggistayadsvkg(seq?id?no:34)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有ardrmpradeydy(seq?id?no:35)的氨基酸序列的hcdr3序列。

31、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有rns?ma(seq?id?no:36)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有aississ?ggrtdyadfvkg(seq?id?no:37)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有pirvaslaydd(seq?id?no:38)的氨基酸序列的hcdr3序列。

32、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有nyh?mg(seq?id?no:39)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有aisssg?gktsypdsvng(seq?id?no:40)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有dprywvaaggsepenvev(seq?id?no:41)的氨基酸序列的hcdr3序列。

33、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有vns?ma(seq?id?no:42)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有vissgg?savyadsvkg(seq?id?no:43)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有gsaayrdy(seq?id?no:44)的氨基酸序列的hcdr3序列。

34、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有rnt?mg(seq?id?no:45)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有hflwt?ggetdyadavkg(seq?id?no:46)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有nyagyridgyqy(seq?id?no:47)的氨基酸序列的hcdr3序列。

35、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有ihv?mg(seq?id?no:48)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有fiinng?gtryadsvkg(seq?id?no:49)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有egtyrgrystdn(seq?id?no:50)的氨基酸序列的hcdr3序列。

36、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有end?vr(seq?id?no:51)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有aitssgi?tgyadsvri(seq?id?no:52)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有tdqy(seq?id?no:53)的氨基酸序列的hcdr3序列。

37、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有l(wèi)nt?mg(seq?id?no:54)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有vesssg?itnyadsvkg(seq?id?no:55)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有klfgrdf(seq?id?no:56)的氨基酸序列的hcdr3序列。

38、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有shn?vmg(seq?id?no:57)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有sigsg?gstnyvdsvkg(seq?id?no:58)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有vvgvyrgs(seq?id?no:59)的氨基酸序列的hcdr3序列。

39、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含含有rdt?mg(seq?id?no:116)的氨基酸序列的hcdr1序列、含有visssg?ntnyadsvlg(seq?id?no:117)的氨基酸序列的hcdr2序列、含有hrtygvdy(seq?id?no:118)的氨基酸序列的hcdr3序列。

40、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rαvhh與seq?id?no:60、seq?id?no:61、seq?id?no:62、seq?id?no:63、seq?id?no:64、seq?id?no:65、seq?id?no:66、seq?id?no:67、seq?id?no:68、seq?id?no:69或seq?id?no:70的氨基酸序列至少約90％同一、至少約95％同一，或至少98％同一。

41、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rαvhh與seq?id?no:71、seq?id?no:72、seq?id?no:73、seq?id?no:74、seq?id?no:75、seq?id?no:76、seq?id?no:77、seq?id?no:78、seq?id?no:79、或seq?id?no:98的氨基酸序列至少約90％同一、至少約95％同一，或至少98％同一。

42、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rαvhh包含seq?id?no:60、seq?id?no:61、seq?id?no:62、seq?id?no:63、seq?id?no:64、seq?id?no:65、seq?id?no:66、seq?id?no:67、seq?id?no:68、seq?id?no:69或seq?id?no:70的氨基酸序列。

43、在某些方面，多特異性結合蛋白的il-18rβvhh包含seq?id?no:71、seq?id?no:72、seq?id?no:73、seq?id?no:74、seq?id?no:75、seq?id?no:76、seq?id?no:77、seq?id?no:78、seq?id?no:79或seq?id?no:98的氨基酸序列。

44、在一些實施方案中，當用激動劑活性測定(例如hek-blue測定)測量時，多特異性結合蛋白具有達到或超越超過背景的特定閾值的激動劑活性。

45、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約2倍。

46、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約3倍。

47、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約4倍。

48、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約5倍。

49、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約6倍。

50、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約7倍。

51、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約8倍。

52、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約9倍。

53、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約10倍。

54、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約11倍。

55、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約12倍。

56、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約13倍。

57、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約14倍。

58、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白的激動劑活性超過背景約15倍。

59、在一些實施方案中，第一結合部分結合人il-18rα(seq?id?no:287)的一個或多個氨基酸ser24、arg25、pro26、thr126、ser127、lys128和ile129。

60、在一些實施方案中，第一結合部分結合人il-18rα(seq?id?no:287)的至少氨基酸ser24、arg25、pro26、thr126、ser127、lys128和ile129。

61、在一些實施方案中，第一結合部分結合人il-18rα(seq?id?no:287)的氨基酸ser24、arg25、pro26、thr126、ser127、lys128、ile129、phe135、phe136、gln137、ile138、thr139、cys140、glu141、asn142、ser143、lys200、thr201和phe202。

62、在一些實施方案中，第一結合部分結合人il-18rα(seq?id?no:287)的氨基酸ser24、arg25、pro26、his27、ile28、thr29、glu122、arg123、gln124、val125、thr126、ser127、lys128、ile129和val130。

63、在一些實施方案中，第二結合部分結合人il-18rβ(seq?id?no:288)的一個或多個氨基酸gln216、gly217、thr218、gln239、val240、arg241、thr242、ile243、lys309、ser310、thr311和leu312。

64、在一些實施方案中，第二結合部分結合人il-18rβ(seq?id?no:288)的至少氨基酸gln216、gly217、thr218、gln239、val240、arg241、thr242、ile243、lys309、ser310、thr311和leu312。

65、在一些實施方案中，第二結合部分結合人il-18rβ(seq?id?no:288)的至少氨基酸asp213、tyr214、his215、gln216、gly217、thr218、gln239、val240、arg241、thr242、ile243、lys306、ser307、ile308、lys309、ser310、thr311和leu312。

66、在一些實施方案中，第二結合部分結合人il-18rβ(seq?id?no:288)的至少氨基酸glu39、glu40、glu41、his112、phe113、leu114、thr115、pro116、gln216、gly217、thr218、gln239、val240、arg241、thr242、ile243、phe279、glu280、arg281、val282、phe283、asn284、lys309、ser310、thr311、leu312、lys313、asp314和glu315。

67、在一些實施方案中，il-18rα和/或il-18rβ結合部分是經(jīng)優(yōu)化的。在一些實施方案中，經(jīng)優(yōu)化的il-18rα和/或il-18rβ結合部分是人源化的。在一些實施方案中，il-18rα結合部分包含seq?id?no:116、seq?id?no:118、seq?id?no:120或seq?id?no:123的氨基酸序列。在一些實施方案中，il-18rβ結合部分包含seq?id?no:117、seq?id?no:119、seq?id?no:121、seq?id?no:122、seq?id?no:124、seq?id?no:125、seq?id?no:126、seq?id?no:127或seq?id?no:128的氨基酸序列。

68、在一些實施方案中，多特異性結合蛋白還包含一個或多個經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)。在一些實施方案中，該一個或多個經(jīng)修飾鉸鏈包含上鉸鏈區(qū)，該上鉸鏈區(qū)的長度最高為7個氨基酸或該上鉸鏈區(qū)不存在；以及中鉸鏈區(qū)和下鉸鏈區(qū)，其中下鉸鏈區(qū)連接至重鏈恒定區(qū)的n端。在一些實施方案中，第一經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)和第二經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)的上鉸鏈區(qū)是相同的序列。在一些實施方案中，第一經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)和第二經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)的上鉸鏈區(qū)是不同的序列。

69、在一些實施方案中，上鉸鏈區(qū)包含源自人igg抗體的上鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。在一些實施方案中，igg抗體選自igg1、igg2、igg3和igg4。在一些實施方案中，igg抗體是igg1。在一些實施方案中，上鉸鏈區(qū)包含seq?id?no:274的氨基酸序列。在一些實施方案中，上鉸鏈區(qū)包含seq?id?no:277的氨基酸序列。在一些實施方案中，igg抗體是igg4。在一些實施方案中，上鉸鏈區(qū)包含seq?id?no:276的氨基酸序列。在一些實施方案中，上鉸鏈不存在。

70、在某些方面，多特異性結合蛋白還包含全部或部分免疫球蛋白fc結構域或其變體。

71、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域或其變體包含第一fc重鏈和第二fc重鏈。

72、在某些方面，多特異性結合蛋白還包含具有降低的效應子功能的變體fc結構域。

73、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有根據(jù)eu編號位于氨基酸位置234處的取代的至少一條fc重鏈。

74、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有根據(jù)eu編號位于氨基酸位置234處的取代的至少一條fc重鏈，其中該位于氨基酸位置234處的取代是丙氨酸(a)。

75、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有根據(jù)eu編號位于氨基酸位置235處的取代的至少一條fc重鏈。

76、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有根據(jù)eu編號位于氨基酸位置235處的取代的至少一條fc重鏈，其中該位于氨基酸位置235處的取代是丙氨酸(a)。

77、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有根據(jù)eu編號位于氨基酸位置237處的取代的至少一條fc重鏈。

78、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有根據(jù)eu編號位于氨基酸位置237處的取代的至少一條fc重鏈，其中該位于氨基酸位置237處的取代是丙氨酸(a)。

79、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有一個或多個根據(jù)eu編號位于氨基酸位置234、235或237處的取代的至少一條fc重鏈。

80、在某些方面，多特異性結合蛋白包含含有一個或多個根據(jù)eu編號位于氨基酸位置234、235或237處的取代的至少一條fc重鏈，其中位于氨基酸位置234處的取代是丙氨酸(a)，其中位于氨基酸位置235處的取代是丙氨酸(a)，并且其中位于氨基酸位置237處的取代是丙氨酸(a)。

81、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變。

82、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變是杵在臼中(knob-in-hole,kih)突變。

83、在某些方面，多特異性結合蛋白的第一fc重鏈結構域包含產(chǎn)生杵的位于位置366、368或407處的氨基酸取代，并且第二fc重鏈包含產(chǎn)生臼的位于位置366處的氨基酸取代。

84、在某些方面，多特異性結合蛋白的第一fc重鏈包含氨基酸取代t366s、l368a或y407v，并且第二fc重鏈包含氨基酸取代t366w。

85、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變是電荷穩(wěn)定突變。

86、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變是電荷穩(wěn)定突變，并且其中第一fc重鏈包含氨基酸取代n297k，并且第二fc重鏈包含氨基酸取代n297d。

87、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變是電荷穩(wěn)定突變，并且其中第一fc重鏈包含氨基酸取代t299k，并且第二fc重鏈包含氨基酸取代t299d。

88、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變包含經(jīng)工程化二硫鍵。

89、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變包含經(jīng)工程化二硫鍵，并且其中該經(jīng)工程化二硫鍵由包含氨基酸取代y349c的第一fc重鏈和包含氨基酸取代s354c的第二fc重鏈形成。

90、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變包含經(jīng)工程化二硫鍵。

91、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變包含經(jīng)工程化二硫鍵，并且其中該經(jīng)工程化二硫鍵由與第一fc重鏈和第二fc重鏈中的每一者的c端融合的c端延伸肽形成。

92、在某些方面，多特異性結合蛋白的fc結構域包含用于促進第一結合部分與第二結合部分的異二聚化的異二聚化突變，其中該異二聚化突變包含經(jīng)工程化二硫鍵，并且其中該經(jīng)工程化二硫鍵由與第一fc重鏈和第二fc重鏈中的每一者的c端融合的c端延伸肽形成，并且其中第一fc重鏈c端延伸包含氨基酸序列gec，并且第二fc重鏈c端延伸包含氨基酸序列scdkt。

93、在某些方面，多特異性結合蛋白的至少一個fc結構域包含用于促進半衰期增加的一個或多個突變。

94、在某些方面，多特異性結合蛋白的至少一條fc重鏈包含一個或多個根據(jù)eu編號位于氨基酸位置252、254或256處的取代。

95、在某些方面，多特異性結合蛋白的至少一條fc重鏈包含一個或多個根據(jù)eu編號位于氨基酸位置252、254或256處的取代，其中位于氨基酸位置252處的取代是酪氨酸(y)，其中位于氨基酸位置254處的取代是蘇氨酸(t)，并且其中位于氨基酸位置236處的取代是谷氨酸(e)。

96、在某些方面，特異性地結合至人il-18rα的第一結合部分包含seq?id?no?240-251中的任一個中所示的氨基酸序列，并且特異性地結合至人il-18rβ的第二結合部分包含seqid?no?252-260中的任一個中所示的氨基酸序列。

97、在一些實施方案中，第一和/或第二結合部分還包含位于結合部分的n端位置14處的氨基酸取代。

98、在一些實施方案中，位于結合部分的n端位置14處的氨基酸是脯氨酸(p)。

99、在一些實施方案中，該位于結合部分的n端位置14處的取代包含丙氨酸(a)。

100、在一些實施方案中，該位于結合部分的n端位置14處的取代是丙氨酸(a)。

101、在一些實施方案中，該位于結合部分的n端位置14處的取代進一步穩(wěn)定了結合部分。

102、在一些實施方案中，該位于結合部分的n端位置14處的取代增加了結合部分的激動劑特性。

103、在某些方面，多特異性結合蛋白被包含在藥物組合物和藥學上可接受的載劑中。

104、在某些方面，多特異性結合蛋白被編碼在經(jīng)分離的核酸分子中。

105、在某些方面，多特異性結合蛋白由表達載體編碼。

106、在某些方面，多特異性結合蛋白由宿主細胞中所包含的表達載體編碼。

107、在某些方面，多特異性結合蛋白是在用于治療受試者的疾病或病癥的方法中向有需要的受試者施用多特異性結合蛋白。

108、在某些方面，多特異性結合蛋白被用作藥物。

109、在某些方面，本公開提供了一種用于治療受試者的疾病或病癥的方法，該方法通過向受試者施用包含用于特異性地結合至人il-18rα的裝置和用于特異性地結合至人il-18rβ的裝置的多特異性結合蛋白來實現(xiàn)。

110、在某些方面，本公開提供了用于在受試者中誘導il-18受體信號傳導的激動劑活性的方法，該方法包括向受試者施用包含特異性地結合至人il-18rα的第一結合部分和特異性地結合至人il-18rβ的第二結合部分的多特異性結合蛋白，其中該多特異性結合蛋白能夠通過誘導人il-18r的il-18rα和il-18rβ亞基之間的接近來誘導il-18受體信號傳導。

111、在某些方面，本公開提供了一種用于在受試者中誘導il-18受體信號傳導的激動劑活性的方法，該方法包括向受試者施用包含用于特異性地結合至人il-18rα的裝置和用于特異性地結合至人il-18rβ的裝置的多特異性結合蛋白。

112、在一個方面，本公開提供了一種刺激受試者中il-18介導的ifn-γ表達的方法，該方法包括向受試者施用包含特異性地結合至人il-18rα的第一結合部分和特異性地結合至人il-18rβ的第二結合部分的多特異性結合蛋白，其中該多特異性結合蛋白刺激受試者中的抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生而相對于il-18對mcp-1的產(chǎn)生、gm-csf的產(chǎn)生或者急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生的刺激，基本上不刺激受試者中的mcp-1的產(chǎn)生、gm-csf的產(chǎn)生或者急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生。

113、在某些實施方案中，抗腫瘤細胞因子選自由ifn-γ、il-2、il-12、il-15、cd40l和tnfα組成的組。

114、在某些實施方案中，急性炎性或th2反應標志物選自由il-6、il-1β、il-8、il-4、il-5和il-13組成的組。

115、在某些實施方案中，多特異性結合蛋白刺激急性炎性或th2反應標志物的產(chǎn)生比il-18少至少5倍、少至少10倍、少至少50倍或少至少100倍。

116、在某些實施方案中，多特異性結合蛋白刺激受試者中的gm-csf的產(chǎn)生比受試者中的ifn-γ的產(chǎn)生少至少5倍、少至少10倍、少至少50倍或少至少100倍。