本公開(kāi)屬于生物。具體涉及一種新型自復(fù)制rna(sarna)遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)由病毒囊膜蛋白(e)組裝形成的微囊泡介導(dǎo)sarna遞送，并通過(guò)sarna自復(fù)制特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)目的蛋白的靶向表達(dá)。

背景技術(shù)：

1、經(jīng)過(guò)多年來(lái)的技術(shù)積累，基因治療產(chǎn)業(yè)已經(jīng)逐步走向成熟，引領(lǐng)著生物醫(yī)藥的第三次產(chǎn)業(yè)革命。其中，mrna藥物作為相對(duì)安全的制劑，吸引了國(guó)內(nèi)外研究者們的目光。其通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)作出反應(yīng)或表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)蛋白來(lái)達(dá)到治療目的，因此，下游的蛋白表達(dá)水平與治療效果密切相關(guān)。傳統(tǒng)mrna的缺點(diǎn)之一是它們不夠穩(wěn)定、易降解，導(dǎo)致下游的蛋白表達(dá)是非持續(xù)的。如果長(zhǎng)期用于疾病治療，可能需要患者注射大量的mrna制劑，這可能會(huì)增加mrna治療的毒副作用。自我擴(kuò)增rna(self-amplifying?rna，sarna)是指以自己的rna序列作為模板，在其攜帶的rna聚合酶(rdrp)的輔助下進(jìn)行自我復(fù)制的核酸序列。sarna的主要優(yōu)點(diǎn)是其可以在很低的劑量下達(dá)到與大量傳統(tǒng)mrna相同的蛋白表達(dá)水平，且可以持續(xù)產(chǎn)生目的蛋白。這一特點(diǎn)可以減少rna制劑治療中的注射劑量和頻率的同時(shí)，延長(zhǎng)治療效果，同時(shí)減少rna和給藥載體可能產(chǎn)生的潛在毒副作用。

2、此外，mrna制劑的高效遞送問(wèn)題一直是困擾基因藥物和基因治療行業(yè)發(fā)展的重要瓶頸之一。目前，人類(lèi)基因治療所用遞送載體，主要是包括脂質(zhì)體、陽(yáng)離子多聚物、納米顆粒等的非病毒類(lèi)和包括慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒的病毒類(lèi)。非病毒類(lèi)遞送載體具備安全、穩(wěn)定等特性，但其轉(zhuǎn)染效率通常較低、生產(chǎn)成本較高，且副作用較為明顯。病毒類(lèi)遞送載體，包括活病毒和假病毒兩大類(lèi)，因其轉(zhuǎn)導(dǎo)及表達(dá)效率高而被廣泛應(yīng)用。但其中活病毒載體,如流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、virus-like?vesicles(vlv)等病毒載體，在體內(nèi)可產(chǎn)生子代病毒，存在的潛在感染風(fēng)險(xiǎn)，通常只適用于疫苗領(lǐng)域的基因遞送，不適用于蛋白藥物、細(xì)胞及基因治療等領(lǐng)域，制約了該類(lèi)載體在基因遞送方面的發(fā)展。相比較而言，假病毒載體具有僅具有單次感染性、無(wú)病毒擴(kuò)增引發(fā)的毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，極高的安全性使假病毒載體作為rna遞送工具具有極大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力，其中最具代表性的是病毒樣復(fù)制子顆粒(virus-replicon?particle，vrp)。vrp遞送系統(tǒng)通過(guò)甲病毒復(fù)制子rna和甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白rna反式互補(bǔ)產(chǎn)生的僅具單次感染性的假病毒復(fù)制子顆粒，可有效向體內(nèi)遞送sarna。但vrp形式的遞送系統(tǒng)也存在基因重組產(chǎn)生野生病毒的致命缺陷，比如基于veev的vrp的包裝系統(tǒng)由三部分組成，包括veev復(fù)制子的rna、capsid蛋白的rna、以及e蛋白的rna，這些rna在細(xì)胞內(nèi)存在小概率的重組可能性，可以產(chǎn)生veev病毒。為了盡可能降低vrp遞送系統(tǒng)的重組風(fēng)險(xiǎn)，通常采用三質(zhì)粒系統(tǒng)分別轉(zhuǎn)錄veev復(fù)制子的rna、capsid蛋白的rna、以及e蛋白的rna，即使這樣也無(wú)法完全避免重組產(chǎn)生veev病毒的可能。除此之外，vrp遞送系統(tǒng)還有一些其他的缺陷，由于capsid蛋白的存在，一方面限制了sarna的暴露，另一方面增強(qiáng)了宿主抗病毒免疫應(yīng)答，即影響了rna的遞送效率，同時(shí)也影響了藥物使用中的副反應(yīng)。因此，vrp遞送系統(tǒng)通常也只是用于疫苗等少數(shù)領(lǐng)域的基因遞送。基于上述原因，整個(gè)生物醫(yī)學(xué)界都在努力開(kāi)發(fā)新的更有潛力的基因遞送系統(tǒng)，但將這些分子精確有效地遞送到細(xì)胞中且兼具安全性卻充滿挑戰(zhàn)。

3、病毒e蛋白可以依賴于其c末端的信號(hào)肽和負(fù)電荷區(qū)域進(jìn)行組裝，形成病毒顆粒的包膜結(jié)構(gòu)。在病毒的生命周期中，病毒e蛋白與其他病毒組件，如核蛋白、基質(zhì)蛋白等，相互作用包裝出具有感染性的病毒顆粒。這種病毒復(fù)制、包裝產(chǎn)生子代病毒的過(guò)程，完全依賴于病毒核蛋白、基質(zhì)蛋白等病毒結(jié)構(gòu)蛋白的存在，當(dāng)病毒基因組缺失核蛋白、基質(zhì)蛋白等結(jié)構(gòu)基因時(shí)，通常無(wú)法產(chǎn)生子代病毒顆粒。

4、rna與蛋白質(zhì)的相互作用是細(xì)胞生理過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)的決定性因素之一。近年來(lái)，隨著技術(shù)的改進(jìn)和新方法的建立，rna和蛋白質(zhì)的相互作用研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，目前科研人員已經(jīng)鑒定了較多rna上的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，也發(fā)現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)中的rna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并對(duì)它們的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究。病毒e蛋白是病毒囊膜上的主要膜蛋白，不僅僅介導(dǎo)了病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合，而且在病毒包膜形成過(guò)程中有重要作用。

5、因此，如何發(fā)掘病毒e蛋白與mrna的相關(guān)作用潛能，利用病毒e蛋白的特點(diǎn)并結(jié)合sarna的安全高效性開(kāi)發(fā)新的mrna藥物遞送系統(tǒng)，及開(kāi)發(fā)新的更成熟的mrna藥物制劑，需要本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步探究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本公開(kāi)的目的在于提供一種新型sarna遞送(vrv)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。通過(guò)兩質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將sarna序列和病毒囊膜蛋白rna序列導(dǎo)入細(xì)胞，便可有效包裝出含有sarna的細(xì)胞微囊泡遞送系統(tǒng)，用于包裝和遞送sarna，并通過(guò)sarna實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)，這種新形式的遞送系統(tǒng)極大地拓展了基因藥物遞送的方式。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本公開(kāi)的技術(shù)方案如下：

3、在一方面，本公開(kāi)提供了一種構(gòu)建sarna微囊泡遞送系統(tǒng)的方法，包括以下步驟：

4、(1)設(shè)計(jì)sarna表達(dá)載體1和膜蛋白表達(dá)載體2；

5、(2)向宿主細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染表達(dá)載體1和表達(dá)載體2；

6、(3)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，分離得到包含sarna的微囊泡；

7、其中，所述sarna中包含目的基因序列；

8、所述sarna表達(dá)載體中的復(fù)制子為甲病毒復(fù)制子；

9、所述微囊泡不含有衣殼蛋白。

10、在另一方面，本公開(kāi)提供了一種前述方法制備的微囊泡遞送載體，其中，所述遞送載體包括表面鑲嵌病毒膜蛋白的微囊泡和囊泡內(nèi)包裝的sarna，所述微囊泡不含有衣殼蛋白；優(yōu)選地，所述sarna中還含有目的基因序列。

11、在另一方面，本公開(kāi)提供了一種穩(wěn)定表達(dá)前述微囊泡遞送載體的細(xì)胞。

12、在另一方面，本公開(kāi)提供了利用前述于方法、微囊泡遞送載體和/或細(xì)胞在制備靶向藥物中的用途。

13、在另一方面，本公開(kāi)提供了利用前述于方法、微囊泡遞送載體和/或細(xì)胞在制備疫苗制劑中的用途。

14、本公開(kāi)所取得的有益效果至少如下：

15、本公開(kāi)通過(guò)對(duì)sarna與病毒膜蛋白相互作用的研究，發(fā)現(xiàn)病毒e蛋白可以和sarna相互作用，并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中病毒e蛋白可以高效介導(dǎo)含有sarna的細(xì)胞微囊泡的產(chǎn)生。這種相互作用可能依賴于病毒e蛋白的特殊的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，以及sarna的三級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)不存在病毒膜蛋白時(shí)，雖然細(xì)胞也可以自發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡，但并不能將sarna有效包裝到囊泡中；同時(shí)，不同的病毒e蛋白與sarna相互作用的效果存在一定差異，產(chǎn)生的包裝sarna的微囊泡的效率也不同，優(yōu)化病毒e蛋白rna序列及sarna序列可有效促進(jìn)病毒e蛋白與sarna相互作用，從而大幅提高包裝sarna的微囊泡的生產(chǎn)效率。

16、本公開(kāi)通過(guò)兩質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將sarna序列和病毒囊膜蛋白rna序列導(dǎo)入細(xì)胞，便可有效包裝出含有sarna的細(xì)胞微囊泡。這種新型病毒囊膜蛋白組裝的微囊泡介導(dǎo)的sarna遞送(vrv)系統(tǒng)可有效介導(dǎo)sarna體內(nèi)遞送，并且具有卓越的遞送優(yōu)勢(shì)。vrv遞送系統(tǒng)不同于vlv，它不是一種有活性的病毒，遞送到體內(nèi)的只是sarna藥物成分，沒(méi)有任何病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因，而且不會(huì)產(chǎn)生子代病毒，克服了病毒載體的致命缺陷，具有良好的使用安全性。其次，vrv遞送系統(tǒng)不同于vrp：vrp是一種甲病毒的病毒樣顆粒，其sarna包裝的關(guān)鍵機(jī)制在于sarna與核蛋白的相互作用，因此病毒核蛋白對(duì)vrp的形成至關(guān)重要，vrp中含有大量的病毒核蛋白成分；vrv是一種細(xì)胞微囊泡，其sarna包裝的關(guān)鍵機(jī)制在于sarna與病毒膜蛋白的相互作用，vrv中不含病毒核蛋白成分，具有更低的免疫原性，更適用于蛋白替代藥物、抗體藥物、細(xì)胞及基因治療藥物等醫(yī)藥領(lǐng)域的rna遞送另外，vrv包裝系統(tǒng)中不需要使用病毒核蛋白rna，使用兩質(zhì)粒系統(tǒng)即可完成vrv的包裝，同時(shí)避免病毒核蛋白的翻譯，更有利于細(xì)胞專一性翻譯病毒膜蛋白，因此vrv系統(tǒng)具有更好的包裝效率。再次，由于病毒膜蛋白可以和相應(yīng)的細(xì)胞受體結(jié)合，而細(xì)胞受體在不同組織上具有表達(dá)差異性，使用不同病毒膜蛋白構(gòu)建的vrv遞送系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)不同組織的靶向性，從而賦予了vrv系統(tǒng)的組織靶向性遞送功能。因此，本公開(kāi)構(gòu)建的vrv遞送系統(tǒng)可進(jìn)行不同要素的改造，開(kāi)發(fā)出針對(duì)不同疾病、不同靶點(diǎn)的高效、免疫原性低的模塊化平臺(tái)。通過(guò)向細(xì)胞或體內(nèi)高效遞送sarna，從而實(shí)現(xiàn)攜帶的目的蛋白高效持續(xù)表達(dá)。