本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及一種疏風(fēng)解毒膠囊及其制備方法與檢測方法及制藥用途。

背景技術(shù)：

疏風(fēng)解毒膠囊，是本專利申請人安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司的獨(dú)家產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號為：國藥準(zhǔn)字z2009004，規(guī)格：每粒裝0.52g。該品種是根據(jù)我國著名老中醫(yī)向楚賢的祖?zhèn)髅芊?，原名“祛毒散”，研制的中藥新藥，由虎杖、連翹、敗醬草、柴胡、馬鞭草、板藍(lán)根、蘆根、甘草等藥味組成。具有疏風(fēng)清熱，解毒利咽之功，用于治療急性上呼吸道感染屬風(fēng)熱證，癥見發(fā)熱，惡風(fēng)，咽痛，頭痛，鼻塞，流濁涕，咳嗽等，臨床應(yīng)用多年，療效確切。本品被列為衛(wèi)生部《甲型h1n1流感診療方案》(2009年第二版、第三版、2010年版)治療風(fēng)熱犯衛(wèi)首選中成藥、《流行性感冒診斷與治療指南(2011年版)》、國家中醫(yī)藥管理局《外感發(fā)熱(上呼吸道感染)診療方案》和《時行感冒(甲型h1n1流感)診療方案》推薦用藥，并納入2009年版國家醫(yī)保目錄。

本品為本專利申請人安徽濟(jì)人藥業(yè)的拳頭產(chǎn)品，是年產(chǎn)值、年銷售額均過億的中藥大品種。2011年獲得國家現(xiàn)代中藥高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項支持，先后榮獲“國家重點(diǎn)新產(chǎn)品”、“安徽省自主創(chuàng)新產(chǎn)品”、“呼吸系統(tǒng)疾病類中藥十強(qiáng)”等一系列榮譽(yù)稱號。本產(chǎn)品具有自主知識產(chǎn)權(quán)(專利號zl200510117119.8)，在治療急性上呼吸道感染有著較好的療效和市場，如何保證產(chǎn)品的穩(wěn)定均一性及其安全有效性，是本品發(fā)展的亟待解決的問題?，F(xiàn)行的疏風(fēng)解毒膠囊檢測方法僅規(guī)定了連翹、柴胡、馬鞭草的薄層色譜鑒別方法和薄層掃描法測定大黃素含量的方法，而本品為8種中藥藥味原料組成，成分復(fù)雜，現(xiàn)有的檢測方法尚處在較簡單的初級階段，顯然不利于產(chǎn)品質(zhì)量及療效的保證。

產(chǎn)品質(zhì)量的提高離不開檢測方法的提高，因此，本發(fā)明的申請人安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司對疏風(fēng)解毒膠囊檢測方法進(jìn)行大幅度提升，曾經(jīng)于2014年10月27日申請了兩件發(fā)明專利，發(fā)明名稱分別為：一種疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜的建立方法、一種疏風(fēng)解毒膠囊的檢測方法，申請?zhí)柗謩e為：2014105823185、201410583418x，專利公開號分別為：104316613b、104330489b，兩件專利分別提出了對疏風(fēng)解毒膠囊的指紋圖譜的檢測方法，以及對其馬鞭草苷、馬鞭草苷、虎杖苷、連翹酯苷a、毛蕊花糖苷、甘草酸單銨鹽、大黃素等幾個成分進(jìn)行檢測的方法，這些檢測方法對于提升疏風(fēng)解毒膠囊的質(zhì)量，起到了重要的推動作用。不過，在生產(chǎn)實(shí)踐和科研實(shí)驗(yàn)中，申請人發(fā)現(xiàn)，表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨是疏風(fēng)解毒膠囊重要活性成分，所以，申請人對此進(jìn)行了反復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，提出并建立了同時對表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的含量進(jìn)行檢測的方法。

此外，申請人按照國家中藥大品種開發(fā)戰(zhàn)略的指導(dǎo)思想，對疏風(fēng)解毒膠囊的新的治療用途開展了系統(tǒng)性的研究，在研究中意外發(fā)現(xiàn)，疏風(fēng)解毒膠囊對非酒精性脂肪肝具有非常突出的、令人意想不到的治療效果。

本項目得到了國家科學(xué)技術(shù)部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金的重點(diǎn)支持，項目名稱：疏風(fēng)解毒膠囊，項目類型：重點(diǎn)項目，立項代碼：10c26213404286，批準(zhǔn)文號：國科發(fā)計字[2010]543號。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種疏風(fēng)解毒膠囊及其制備方法與檢測方法及制藥用途。

本發(fā)明的目的是提供一種疏風(fēng)解毒膠囊藥物及其制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供疏風(fēng)解毒膠囊的藥物檢測方法。

本發(fā)明還提供了疏風(fēng)解毒膠囊的新的制藥用途。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：

一種疏風(fēng)解毒膠囊，是由以下重量份的藥味原料制成：虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍(lán)根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份。

一種疏風(fēng)解毒膠囊的制備方法，該疏風(fēng)解毒膠囊是由以下重量份的藥味原料制成：虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍(lán)根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份，采用如下方法制備：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，即得。

一種疏風(fēng)解毒膠囊的檢測方法，該疏風(fēng)解毒膠囊是由以下重量份的藥味原料制成：虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍(lán)根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份，該疏風(fēng)解毒膠囊是采用如下方法制備的：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，即得；

采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，其檢測方法的步驟如下：

(1)色譜條件：色譜柱：c18柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm；流動相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?至10min，乙腈從5％線性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95％線性下降至85％，從11至20min，乙腈從15％線性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85％線性下降至65％；流速：0.5～2.0ml·min^-1；檢測波長：0至10min檢測波長230～240nm，11至20min檢測波長330～340nm；柱溫：30～40℃；進(jìn)樣量：5～20μl；

(2)混合對照品溶液的制備：分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d對照品，精密稱定，置同一量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物，精密稱定，置離心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液，稱定質(zhì)量，超聲提取，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補(bǔ)足所減失的質(zhì)量，離心，取上清液，濾紙過濾后，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測定：取混合對照品溶液、供試品溶液注入高效液相色譜儀，測定。

上述檢測方法，采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的含量，其檢測方法的優(yōu)選步驟如下：

(1)色譜條件：色譜柱：c18柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm；流動相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?至10min，乙腈從5％線性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95％線性下降至85％，從11至20min，乙腈從15％線性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85％線性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；檢測波長：0至10min檢測波長235nm，11至20min檢測波長336nm；柱溫：36℃；進(jìn)樣量：20μl；

(2)混合對照品溶液的制備：分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨對照品，精密稱定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物0.1g，精密稱定，置5ml離心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml，稱定質(zhì)量，以功率300w、頻率60khz超聲提取40min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補(bǔ)足所減失的質(zhì)量，離心，取上清液，濾紙過濾后，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測定：取混合對照品溶液、供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定。

一種疏風(fēng)解毒膠囊在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用，該疏風(fēng)解毒膠囊是由以下重量份的藥味原料制成：虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍(lán)根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份，該疏風(fēng)解毒膠囊是采用如下方法制備的：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，即得；

采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的含量，其檢測方法的步驟如下：

(1)色譜條件：色譜柱：c18柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm；流動相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?至10min，乙腈從5％線性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95％線性下降至85％，從11至20min，乙腈從15％線性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85％線性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；檢測波長：0至10min檢測波長235nm，11至20min檢測波長336nm；柱溫：36℃；進(jìn)樣量：20μl；

(2)混合對照品溶液的制備：分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d對照品，精密稱定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物0.1g，精密稱定，置5ml離心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml，稱定質(zhì)量，以功率300w、頻率60khz超聲提取40min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補(bǔ)足所減失的質(zhì)量，離心，取上清液，濾紙過濾后，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測定：取混合對照品溶液、供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定。

以下實(shí)驗(yàn)研究用于驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)方案的技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)效果，但并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)驗(yàn)一：rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的含量

1儀器與材料

hitachil2130高效液相色譜儀，包括hi-tachil-2400紫外檢測器、d-2000ellte色譜工作站，由特賽恩斯儀器有限公司制造；kromasilc18色譜柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm，由安捷倫科技(中國)有限公司制造；sk250h超聲波發(fā)生儀，由上海大廣電超聲波發(fā)生器公司生產(chǎn)；hc-2516高速離心機(jī)，由上海利鑫堅離心機(jī)有限公司制造。

表兒茶素沒食子酸酯對照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5％)，由上海哈靈生物科技有限公司生產(chǎn)；決明松-8-o-葡萄糖苷對照品(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0％)，由成都德思特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；丙二酰基柴胡皂苷d(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0％)，由成都瑞芬思生物科技有限公司生產(chǎn)。乙腈(色譜純)，由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司生產(chǎn)；其他試劑(分析純)，由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司生產(chǎn)；水為重蒸餾水，由安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室自制。

疏風(fēng)解毒膠囊：處方：虎杖450g、連翹360g、板藍(lán)根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g；

制備方法：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備：分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d對照品適量，精密稱定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物0.1g，精密稱定，置5ml離心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml，稱定質(zhì)量，以功率300w、頻率60khz超聲提取40min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補(bǔ)足所減失的質(zhì)量，離心，取上清液，濾紙過濾后，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3陰性對照溶液的制備

以膠囊制備工藝的處方比例，按“2.1.2”條方法分別制備缺虎杖和缺柴胡的陰性對照溶液。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：kromasilc18柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm；流動相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?至10min，乙腈從5％線性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95％線性下降至85％，從11至20min，乙腈從15％線性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85％線性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；檢測波長：0至10min檢測波長235nm，11至20min檢測波長336nm；柱溫：36℃；進(jìn)樣量：20μl。

在上述色譜條件下分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的混合對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各20μl進(jìn)樣分析，各被測成分的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，拖尾因子符合要求，理論塔板數(shù)按丙二?；窈碥誨計算不低于5000，色譜圖見圖1、圖2、圖3、圖4。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線性關(guān)系的考察

分別精密量取混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置10ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配成不同質(zhì)量濃度的混合對照標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“2.2”條色譜條件進(jìn)樣分析，以各自的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(x，mg·l^-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨回歸方程，結(jié)果見表1。

表1線性關(guān)系

2.3.2精密度試驗(yàn)

取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨質(zhì)量濃度分別為190.0、220.5、290.5mg·l^-1的同一混合對照品溶液，按“2.2”條色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨峰面積的rsd分別為1.6％、1.2％、1.1％。表明儀器的精密度良好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號疏風(fēng)解毒膠囊(批號：160128)內(nèi)容物0.1g，按“2.1.2”條方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”條色譜條件進(jìn)樣分析，測得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨含量的rsd分別為1.5％、1.3％、1.4％。表明方法重復(fù)性良好

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10h，按“2.2”條色譜條件進(jìn)樣分析，求得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨峰面積的rsd分別為2.3％、1.9％、2.8％。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的疏風(fēng)解毒膠囊(批號：160128)內(nèi)容物9份，3份為一組，每份約50mg，精密稱定。分別精密加入對照溶液適量，按“2.1.2”條方法制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的供試品溶液，按“2.2”條色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。

表2表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的回收率試驗(yàn)(n＝9)

2.4供試品的含量測定

分別稱取各批號疏風(fēng)解毒膠囊10粒，精密稱定。按“2.1.2”條方法制備供試品溶液，按“2.2”條色譜條件進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法計算表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的含量，結(jié)果見表3。

表3疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨的含量(n＝3)(mg·g^-1)

3結(jié)論

采用本研究方法對疏風(fēng)解毒膠囊的10個批次進(jìn)行了指標(biāo)性成分的含量測定。結(jié)果表明，表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d每克含量分別在1.20～1.45mg、0.90～1.55mg和2.40～3.60mg內(nèi)。

本研究所建立的含量測定方法，同時測定3個指標(biāo)性成分，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便，分析時間快速，為完善疏風(fēng)解毒膠囊的檢測分析方法提供了依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)二：疏風(fēng)解毒膠囊對小鼠非酒精性脂肪肝的治療作用

本研究用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立非酒精性脂肪肝模型，研究疏風(fēng)解毒膠囊對非酒精性脂肪肝的治療作用。

1儀器與試藥

1.1試藥

疏風(fēng)解毒膠囊：處方：虎杖450g、連翹360g、板藍(lán)根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g；

制備方法：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

殼脂膠囊(商品名：甘復(fù)生)，由內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字z20050665，規(guī)格：0.25g*30s，批號：20160125-8。

1.2試劑與儀器

丙二醛(mda)檢測試劑盒，由北京百萊博科技有限公司制造，批號：20151223-9；超氧化物歧化酶(sod)檢測試劑盒，由北京百萊博科技有限公司制造，批號：20160120；全自動生化分析儀，由北京華奧智恒科技有限公司制造，批號：20151227；三筒光學(xué)顯微鏡，由桂林市邁特光學(xué)儀器有限公司制造。

1.3動物

昆明種小鼠，spf級，♂，體質(zhì)量(20±2)g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(皖)2012-2013。給予標(biāo)準(zhǔn)食物，自由飲水，保持光照和避光循環(huán)飼養(yǎng)(12/12h)；實(shí)驗(yàn)開始前保持室內(nèi)飼養(yǎng)1周。

2方法

2.1非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立

將小鼠隨機(jī)分為2組，正常對照組小鼠(14只)喂飼普通飼料，其余小鼠(34只)喂飼高脂飼料(40％普通飼料粉、20％豬油、15％蛋黃粉、10％奶粉、10％蔗糖、2.5％膽固醇、2.5％膽酸鈉)，自由攝食、飲水。連續(xù)喂養(yǎng)5周后，從正常對照組和脂肪肝模型組分別處死4只小鼠，比較2組小鼠的血清和肝臟生化指標(biāo)，以及肝臟組織病理切片，判斷非酒精性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。

2.2分組與給藥

將造模成功小鼠30只隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型對照組、陽性藥物組(殼脂膠囊100mg·kg^-1，1次·d^-1)、疏風(fēng)解毒膠囊組(100mg·kg^-1，1次·d^-1)。連續(xù)給藥6周，正常對照組(10只)和模型對照組給予等量蒸餾水。給藥期間，除正常對照組標(biāo)準(zhǔn)鼠料飼養(yǎng)外，其余各組繼續(xù)給予高脂飲食，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。所有小鼠在末次給藥后，禁食不禁水12h，小鼠眼球取血，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清谷總膽固醇(tc)、甘油三脂(tg)含量和丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)活性。取血后處死小鼠，取出肝臟，一部分用4％福爾馬林固定，he染色，切片，送安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，供組織病理學(xué)檢查；另一部分，制成10％肝組織勻漿，測定其中tg、tc、mda、sod含量或活性。

2.3數(shù)據(jù)處理

采用spss12.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述和分析，結(jié)果以(x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較。

3結(jié)果

3.1非酒精性脂肪肝模型的建立

與正常對照組比較，高脂飼料喂養(yǎng)的模型小鼠血清和肝臟中tg、tc含量均顯著升高(p<0.05或p<0.01)，血清中alt、ast活性和肝臟中mda含量顯著升高(p<0.01)，sod活力降低(p<0.05)，結(jié)果見表1，肝組織病理切片觀察可見肝細(xì)胞脂肪變性。表明非酒精性脂肪肝小鼠模型建立成功。

高脂飼料的配方是在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上添加膽固醇、豬油、膽酸鈉等，膽酸鈉可以乳化脂肪，促進(jìn)吸收。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飼料喂養(yǎng)小鼠成功建立了非酒精性脂肪肝動物模型。

3.2小鼠血清和肝組織生化指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，陽性藥物組小鼠的各項生化指標(biāo)都有改善(p<0.05或p<0.01)。與模型對照組相比，疏風(fēng)解毒膠囊組表現(xiàn)出降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中tg、tc含量和alt、ast活性的作用，降低非酒精性脂肪肝小鼠肝臟中tg、tc、mda含量，升高sod活力的作用(p<0.05或p<0.01)。而且從各項生化指標(biāo)的比較中，疏風(fēng)解毒膠囊組的治療效果與陽性藥物組相當(dāng)(p>0.05)，對于降低血清中的tc含量，疏風(fēng)解毒膠囊組還優(yōu)于陽性藥物組(p<0.05)。結(jié)果見表4。

表4對非酒精性脂肪肝小鼠生化指標(biāo)的影響(n＝10，)

注：與模型對照組比較，*p<0.05，#p<0.01

3.3疏風(fēng)解毒膠囊對非酒精性脂肪肝小鼠肝組織病理學(xué)的影響

給藥6周后，陽性藥物組和疏風(fēng)解毒膠囊組小鼠肝臟顏色接近正常肝臟的暗紅色，而模型對照組小鼠的肝臟為乳白色。組織病理切片見圖5、圖6、圖7、圖8，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，疏風(fēng)解毒膠囊組的小鼠肝細(xì)胞脂肪病變程度減輕，肝細(xì)胞中幾乎沒有脂滴的沉積，肝細(xì)胞壞死程度降低。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，疏風(fēng)解毒膠囊組治療6周，非酒精性脂肪肝小鼠血清和肝臟中tg、tc含量均明顯降低，非酒精性脂肪肝小鼠的血清alt、ast水平和肝臟mda的量明顯降低，sod活性顯著升高，肝細(xì)胞脂肪變性得到修復(fù)，疏風(fēng)解毒膠囊高劑量組小鼠肝臟組織形態(tài)接近正常狀態(tài)。研究表明，疏風(fēng)解毒膠囊對于非酒精性脂肪肝有治療作用。

實(shí)驗(yàn)三：疏風(fēng)解毒膠囊對小鼠慢性酒精性肝損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究

疏風(fēng)解毒膠囊對于非酒精性脂肪肝有治療作用，按照常規(guī)的邏輯推理，疏風(fēng)解毒膠囊對酒精性肝損傷也應(yīng)該具有一定的治療作用，發(fā)明人對此也進(jìn)行了試探的實(shí)驗(yàn)研究。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物和試劑

造模劑：紅星二鍋頭酒(清香型白酒，酒精度56％vol)，200ml/瓶，北京紅星股份有限公司，啟封后4℃冷藏保存。

受試藥：

疏風(fēng)解毒膠囊：處方：虎杖450g、連翹360g、板藍(lán)根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g；

制備方法：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

陽性藥物：聯(lián)苯雙酯片，由河北東風(fēng)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字h13023295，規(guī)則：25mg，批號：20160221。用蒸餾水配制成濃度為0.40mg/ml的藥液，4℃冷藏保存。

試劑：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)試劑盒，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)試劑盒，膽固醇(tc)試劑盒，上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物icr小鼠，雄性，18～22g。由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(皖)2012-2013。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器selectra-e全自動生化儀，由北京華奧智恒科技有限公司制造；低速大容量多管離心機(jī)，由上海嘉鵬科技有限公司制造；電子天平，由常州市天之平儀器設(shè)備有限公司制造；j-50型流化床氣流粉碎機(jī)，由上海賽山粉體機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)；winner2308智能型全量程干濕一體激光粒徑儀，由濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司制造；bp211d型電子分析天平，由常州市天之平儀器設(shè)備有限公司制造。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1動物分組

雄性icr小鼠，分為疏風(fēng)解毒膠囊、正常對照組、模型對照組、陽性對照(聯(lián)苯雙酯滴丸)組，每組10只，共10組。

2.2給藥與造模

每日灌胃給藥1次，灌胃容積均為0.1ml/10g體重。正常對照組和模型對照組給予水；疏風(fēng)解毒膠囊灌胃給予0.5g/ml的疏風(fēng)解毒膠囊。每次給藥后2h，除正常對照組外，其余組按10ml/kg體重灌胃給予56°白酒，連續(xù)60天造成慢性酒精性肝損傷模型。

2.3指標(biāo)測定末次灌胃給予酒精后禁食不禁水，12h后摘眼球取血，4000r/min離心15min，取血清備測alt，ast，tc。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。

3.結(jié)果

對酒精性肝損傷小鼠血清alt，ast，tc的影響

表5結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清alt、ast、tc明顯升高(p<0.05，p<0.01)。與模型對照組比較，疏風(fēng)解毒膠囊不能降低血清alt(p＞0.05)、血清ast(p＞0.05)和血清tc(p＞0.05)。說明疏風(fēng)解毒膠囊對慢性酒精性肝損傷小鼠血清alt、ast、tc沒有明顯的改善作用，對酒精性肝損傷小鼠的改善作用不明顯。

表5對酒精性肝損傷小鼠血清alt、ast的影響n＝10

與正常組相比:^△p<0.05，^△△p<0.01；與模型組相比:*p<0.05

附圖說明：

圖1為混合對照品溶液的高效液相色譜圖

圖2為缺柴胡陰性對照溶液的高效液相色譜圖

圖3為缺虎杖陰性對照溶液的高效液相色譜圖

圖4為疏風(fēng)解毒膠囊樣品的高效液相色譜圖

圖5為正常對照組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

圖6為模型對照組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

圖7為陽性對照組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

圖8為疏風(fēng)解毒膠囊組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解說。

實(shí)施例1：

疏風(fēng)解毒膠囊：

處方：虎杖450g、連翹360g、板藍(lán)根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g；

制備方法：

s1：取虎杖、板藍(lán)根粉碎成粗顆粒，加5倍量70％乙醇加熱回流提取2h，濾過；藥渣再加3倍量70％乙醇加熱回流提取1h，濾過，濾液合并，回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s2：取連翹、柴胡加7倍量的水，加熱回流提取揮發(fā)油4h，分取分層的揮發(fā)油，備用；藥渣和藥液粗濾，濾液離心分離，上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3：取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗濾，濾液離心分離，兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并，減壓濃縮至60℃下相對密度1.35～1.40的稠膏，備用；

s4：取糊精、微粉硅膠，混勻，加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，鋪層，真空干燥，粉碎，加入糊精，噴入s2步驟得到的揮發(fā)油，過篩，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，其檢測方法的步驟如下：

(1)色譜條件：色譜柱：c18柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm；流動相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?至10min，乙腈從5％線性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95％線性下降至85％，從11至20min，乙腈從15％線性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85％線性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；檢測波長：0至10min檢測波長235nm，11至20min檢測波長336nm；柱溫：36℃；進(jìn)樣量：20μl；

(2)混合對照品溶液的制備：分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨對照品，精密稱定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物0.1g，精密稱定，置5ml離心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml，稱定質(zhì)量，以功率300w、頻率60khz超聲提取40min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補(bǔ)足所減失的質(zhì)量，離心，取上清液，濾紙過濾后，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測定：取混合對照品溶液、供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定；

(5)測定結(jié)果：本品每克含表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?；窈碥誨分別為1.35mg、1.26mg、2.88mg。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。