本發(fā)明涉及藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種胸腺五肽可溶性微針及其制備方法。

背景技術(shù)：

胸腺五肽(tp5)具有與胸腺生長素相同的全部生物活性，對(duì)機(jī)體免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)胸腺細(xì)胞的生長和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能失調(diào)，減輕自身免疫性疾病的癥狀和抗衰老作用。其可選擇性地通過提升細(xì)胞內(nèi)camp水平誘導(dǎo)thy-1的前胸腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化為thy-1的t細(xì)胞，活化或調(diào)節(jié)不同t細(xì)胞亞群的數(shù)目和功能，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)機(jī)體免疫系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)，目前在臨床上已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用。胸腺五肽主要用于治療多種惡性腫瘤(如淋巴瘤)以及術(shù)后的感染與并發(fā)癥、糖尿病及其所致的各種慢性并發(fā)癥、慢性肝炎(如丙型肝炎，病毒性肝炎合并膽道感染、腹膜炎)、自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化)、衰老體弱所致的免疫功能下降(動(dòng)脈血管硬化和治療老年性早期白內(nèi)障)等。可見，胸腺五肽作為免疫調(diào)節(jié)劑，在許多治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，tp5在血漿中的半衰期為30s。目前臨床應(yīng)用tp5治療各類疾病的用藥周期為7天至6個(gè)月不等，且國內(nèi)外的上市劑型均為注射用凍干粉針，通常通過靜脈注射或肌肉注射進(jìn)行給藥，其長期、頻繁使用導(dǎo)致病人順應(yīng)性大大降低，用藥極為不便。因此，開發(fā)一種新型的胸腺五肽制劑，可防止其在胃腸道內(nèi)的酶解，降低頻繁、長期注射帶來的痛苦，是胸腺五肽制劑研究與開發(fā)過程中亟待解決的重要問題。

目前針對(duì)胸腺五肽的研究主要集中在其緩控釋制劑上，包括緩釋微球，脂質(zhì)體、納米粒、水凝膠，包括植物血凝素修飾plga納米粒促進(jìn)口服吸收、聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)和聚乳酸(pla)為載體材料包載胸腺五肽的緩釋微球、鼻腔給藥制劑等，但納米粒存在載藥量過低或者釋放不完全的問題，微球有潛在的突釋問題、長期鼻腔給藥可能給呼吸系統(tǒng)造成一定程度的傷害等。因此，有必要采用其他手段更加有效地解決胸腺五肽給藥不便的問題，如經(jīng)皮給藥技術(shù)等。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermaldrugdeliverysystem，tdds)，是指使藥物通過皮膚經(jīng)毛細(xì)血管吸收進(jìn)入血液循環(huán)從而達(dá)到治療效果的一類給藥系統(tǒng)。自1979年美國fda批準(zhǔn)第一個(gè)透皮貼劑—東莨菪堿貼片上市以來，經(jīng)皮給藥系統(tǒng)便展現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢：避免胃腸道酶解和肝臟首過效應(yīng)，大大減少注射給藥帶來的疼痛，使用方便，可維持人體血藥濃度的穩(wěn)定，降低不良反應(yīng)。然而皮膚角質(zhì)層是藥物經(jīng)皮吸收的主要障礙，特別是大分子藥物。為了解決這一問題，目前應(yīng)用的促進(jìn)經(jīng)皮吸收的方法有三大類：1.物理方法(離子導(dǎo)入，超聲導(dǎo)入，電致孔等)，這類方法雖能很好促進(jìn)大分子藥物經(jīng)皮吸收，但對(duì)皮膚有潛在的危害性，且給藥不方便；2.化學(xué)方法(化學(xué)促滲劑，前體藥物)，對(duì)小分子物質(zhì)滲透速率影響明顯，但對(duì)大分子藥物無顯著效果；3.藥劑學(xué)方法(脂質(zhì)體，微乳)，對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性較差的生物大分子可能造成活性的降低。近年來，微針作為促進(jìn)經(jīng)皮吸收的一種物理促滲技術(shù)被廣泛關(guān)注，并得到了迅猛發(fā)展，以其給藥方便、無痛等優(yōu)點(diǎn)為大分子藥物如蛋白質(zhì)、多肽、dna等開發(fā)出了新劑型，大大提高了病人的順應(yīng)性。

微針(microneedle,mn)由長度在25μm-2000μm的微米級(jí)的針尖接連在基座上構(gòu)成，可根據(jù)治療需要調(diào)節(jié)針尖長度，并可根據(jù)治療區(qū)域的變化改變形狀。微針可有效刺穿皮膚最外層的屏障——角質(zhì)層，利用在皮膚中形成的微米級(jí)的實(shí)體通道傳遞藥物進(jìn)入體循環(huán)或者在特定部位蓄積。與離子導(dǎo)入、電致孔、化學(xué)促滲劑等相比，微針促滲效果更為顯著，且由于微針并未深入至真皮層的痛覺神經(jīng)，其所產(chǎn)生的實(shí)體通道為微米級(jí)，對(duì)比注射手段，可大大降低給藥時(shí)帶來的痛感，提高了病人的順應(yīng)性。此外，微針亦可與其他促滲技術(shù)方法聯(lián)用，進(jìn)一步提高經(jīng)皮給藥效率。

微針的結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)注射器的針頭不完全相似，針頭的形狀既有對(duì)稱圓錐形也有非對(duì)稱斜面形等等。依據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，微針可分為空心微針和實(shí)心微針；微針制備材料種類繁多，包括金屬、陶瓷、硅、高分子聚合物等；根據(jù)微針的類型不同，采取給藥方式有所不同，主要分為微創(chuàng)敷貼、包衣微針、可溶性微針、凝膠微針、微針注射這五大類，前四種為實(shí)心微針給藥方式，后一種為空心微針給藥方式。

其中，可溶性微針是由水溶性輔料或者可降解的高分子材料與藥物混合形成。藥物可直接存儲(chǔ)在針尖中。刺入皮膚后，微針的針尖材料可在皮膚內(nèi)少量的組織液的存在下溶解，迅速釋放出藥物以達(dá)到治療的效果。針尖材料包括高分子聚合物或糖類。承載的藥物可以是小分子化學(xué)物質(zhì)，也可以是大分子如蛋白質(zhì)、核酸。可溶性微針由基底與連接在基底的數(shù)十或數(shù)百個(gè)針尖構(gòu)成，基座可作為一個(gè)施加壓力的平臺(tái)，施用后便可剝離，插入皮膚的針尖為有效給藥部分。與基于金屬或硅制備的固體微針的微創(chuàng)敷貼和包衣微針相比，可溶性微針有效規(guī)避了其施用過程中針尖可能斷裂的風(fēng)險(xiǎn)，還可通過材料的選擇實(shí)現(xiàn)藥物釋放行為的調(diào)節(jié)，也解決了給藥后針頭需要回收醫(yī)療廢品的二次危害的問題，可實(shí)現(xiàn)一次性給藥，操作方便。但目前，提高可溶性微針的機(jī)械強(qiáng)度以有效刺破角質(zhì)層產(chǎn)生藥物運(yùn)輸微孔道仍然是微針制劑研發(fā)過程中的一大問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供了一種胸腺五肽可溶性微針，該可溶性微針針尖具有良好的機(jī)械強(qiáng)度。

一種胸腺五肽可溶性微針，由針尖和基底組成，所述針尖由可生物降解材料、牛血清白蛋白(bsa)和胸腺五肽(tp5)的水溶液制備而成，所述可生物降解材料、牛血清白蛋白和胸腺五肽的質(zhì)量比為25:3～15:0.5～15；所述可生物降解材料選自右旋糖酐(dex)、聚乙烯比咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、透明質(zhì)酸(ha)、羧甲基纖維素(cmc)、二水-d-海藻糖中的至少一種；所述基底由高分子聚合物的溶液制備而成。

在其中一些實(shí)施例中，所述右旋糖酐為右旋糖酐40(dex40)、所述聚乙烯比咯烷酮為聚乙烯比咯烷酮k30(pvpk30)和/或聚乙烯比咯烷酮k90(pvpk90)。

在其中一些實(shí)施例中，所述可生物降解材料為右旋糖酐40。

在其中一些實(shí)施例中，所述針尖由右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的水溶液制備而成，所述右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的質(zhì)量比為25:8～12:1～10。

在其中一些實(shí)施例中，所述右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的質(zhì)量比為25:10:1～10。

在其中一些實(shí)施例中，所述右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的質(zhì)量比為25:10:10。

在其中一些實(shí)施例中，所述水溶液中可生物降解材料、牛血清白蛋白和胸腺五肽的總濃度為0.3-0.5g/ml。

在其中一些實(shí)施例中，所述高分子聚合物為聚乙烯比咯烷酮和/或聚乙烯醇。

在其中一些實(shí)施例中，所述基底由聚乙烯比咯烷酮的乙醇溶液制備而成。

在其中一些實(shí)施例中，所述基底由聚乙烯比咯烷酮k90的乙醇溶液制備而成。

在其中一些實(shí)施例中，所述聚乙烯比咯烷酮k90的乙醇溶液中聚乙烯比咯烷酮k90的濃度為0.3-0.8g/ml。

在其中一些實(shí)施例中，所述聚乙烯比咯烷酮k90的乙醇溶液中聚乙烯比咯烷酮k90的濃度為0.4g/ml。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針的針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為600～800μm，針尖的底部直徑為250-350μm，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為850-950μm。

在其中一些實(shí)施例中，所述可溶性微針的基底的形狀為邊長為0.8-1.2cm的正方形。

本發(fā)明還提供了上述胸腺五肽可溶性微針的制備方法。

具體技術(shù)方案如下：

一種上述的胸腺五肽可溶性微針的制備方法，包括以下步驟：

(1)針尖溶液的制備：將所述可生物降解材料、牛血清白蛋白和胸腺五肽加入水中，攪拌溶解，即得針尖溶液；

(2)基底溶液的制備：將所述高分子聚合物加入溶劑中，攪拌或加熱溶解，即得基底溶液；

(3)針尖的制備：取適量步驟(1)中所得的針尖溶液加入到微針陰模中，離心，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，回收多余的針尖溶液；

(4)基底的制備：在步驟(3)的基礎(chǔ)上，加入適量步驟(2)所得的基底溶液于微針陰模上，離心；

(5)干燥：將制備好基底的微針進(jìn)行干燥，即得所述胸腺五肽可溶性微針。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)所述離心的轉(zhuǎn)速為3800-4200rpm，溫度為0-8℃，時(shí)間為8-15min。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(4)所述離心的轉(zhuǎn)速為2800-3200rpm，溫度為0-8℃，時(shí)間為3-8min。

在其中一些實(shí)施例中，步驟(5)所述干燥為常溫干燥20-28h。

本發(fā)明的胸腺五肽可溶性微針及其制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)明人通過大量創(chuàng)造性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在特定的可生物降解材料中加入牛血清白蛋白做為針尖材料可以制備得到機(jī)械強(qiáng)度良好的胸腺五肽可溶性微針，該微針可有效刺破角質(zhì)層產(chǎn)生藥物運(yùn)輸微孔道。牛血清白蛋白的加入，可以增加針尖的機(jī)械強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)皮膚的穿刺，可有效解決目前可溶性微針針尖機(jī)械強(qiáng)度低，無法產(chǎn)生經(jīng)皮遞藥孔道的問題，本發(fā)明胸腺五肽可溶性微針可實(shí)現(xiàn)高效便捷的經(jīng)皮藥物傳遞。

本發(fā)明的胸腺五肽可溶性微針，牛血清白蛋白的加入還可以提高針尖中藥物的載藥量，可有效地提高微針針尖部分的含藥量。

本發(fā)明的胸腺五肽可溶性微針，針尖是由水溶液制備得到，基底優(yōu)選乙醇作為溶劑，可有效地提高微針針尖部分的含藥量，同時(shí)不會(huì)對(duì)tp5的結(jié)構(gòu)造成影響，可以保證所載tp5的活性。

本發(fā)明的胸腺五肽可溶性微針全部使用可生物降解的、生物相容性好的材料制備而成，刺入皮膚后，可在組織間液對(duì)針尖材料的溶解下快速釋放藥物，產(chǎn)生的微孔道直徑小、扎入深度合適，未觸及皮下痛覺神經(jīng)，使用過程中產(chǎn)生痛覺低或無痛覺，可有效避免口服導(dǎo)致的胃腸道酶降解，降低長期注射給藥給病人帶來的痛苦和不便，且可由病人自行使用，大大提高了病人的順應(yīng)性。

本發(fā)明制備的可溶性微針可將胸腺五肽包裹于針尖中，以固態(tài)形式存在，無需冷藏儲(chǔ)存或運(yùn)輸，可大大延長藥物制劑的貨架期。

本發(fā)明制備的胸腺五肽可溶性微針與靜脈注射同等劑量的胸腺五肽注射劑可產(chǎn)生相當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)效應(yīng)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的可溶性微針的掃描電鏡圖，其中a-h分別為實(shí)施例1制備的tp5-bsa-dmna-h的單個(gè)微針(a)、實(shí)施例2制備的tp5-bsa-dmna-m的單個(gè)微針(b)、實(shí)施例3制備的tp5-bsa-dmna-l的單個(gè)微針(c)、對(duì)比例1制備的tp5-dmna-h的單個(gè)微針(d)、對(duì)比例2制備的tp5-dmna-m的單個(gè)微針(e)、對(duì)比例3制備的tp5-dmna-l的單個(gè)微針(f)、實(shí)施例2制備的tp5-bsa-dmna-m的微針陣列(g)以及對(duì)比例2制備的tp5-dmna-m的微針陣列(h)；

圖2為皮膚穿刺實(shí)驗(yàn)的致孔情況圖，其中a～c分別為對(duì)比例1～3制備的tp5-dmna-h、tp5-dmna-m、tp5-dmna-l在西藏豬皮上進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn)的致孔情況，d～f分別為實(shí)施例1～3制備的tp5-bsa-dmna-h、tp5-bsa-dmna-m、tp5-bsa-dmna-l在西藏豬皮上進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn)的致孔情況；

圖3為實(shí)施例1～3和對(duì)比例1～3制備的胸腺五肽可溶性微針的ndp情況；

圖4為對(duì)比例1制備的tp5-dmna-h的針尖溶于水后的tp5溶液與tp5水溶液、tp5和dex40的水溶液的圓二色譜圖；

圖5為實(shí)施例1～3中制備的胸腺五肽可溶性微針與胸腺五肽溶液用于免疫抑制大鼠后的臟器系數(shù)對(duì)照圖；

圖6為實(shí)施例1～3中制備的胸腺五肽可溶性微針與胸腺五肽溶液用于免疫抑制大鼠后sod活性和mda值變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步詳細(xì)敘述本說明，并不限制本發(fā)明的權(quán)利要求。

以下實(shí)施例中，如無特殊說明，原料均來源于市售。

實(shí)施例1胸腺五肽可溶性微針的制備

本實(shí)施例進(jìn)行高劑量的胸腺五肽可溶性微針(tp5-bsa-dmna-h)的制備，其針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為800μm，針尖的底部為直徑300μm的圓形，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為900μm，基底為邊長1cm的正方形。該可溶性微針的制備包括如下步驟：

1、針尖溶液的制備

精密稱取可生物降解材料(dex40)0.2501g、bsa0.1000g、胸腺五肽原料藥物0.1000g，加水1ml，攪拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得針尖溶液。

2、基底溶液的制備

精密稱取高分子聚合物(pvpk90)1.0002g，加入乙醇2.5ml，攪拌均勻后待其溶脹過夜，即得基底溶液。

3、可溶性微針含藥針尖的制備

取步驟1中所得的針尖溶液適量加入到微針陰模中，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，隨后將多余的針尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微針空白基底的制備

在步驟3的基礎(chǔ)上，加入適量步驟2所得的基底溶液于微針陰模上，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

5、將制備好基底的微針置于干燥器中常溫干燥24h，用鑷子輕輕取下，即得tp5-bsa-dmna-h。

實(shí)施例2胸腺五肽可溶性微針的制備

本實(shí)施例進(jìn)行中劑量的胸腺五肽可溶性微針(tp5-bsa-dmna-m)的制備，其針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為800μm，針尖的底部為直徑300μm的圓形，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為900μm，基底為邊長1cm的正方形。該可溶性微針的制備包括如下步驟：

1、針尖溶液的制備

精密稱取可生物降解材料(dex40)0.2501g、bsa0.1000g、胸腺五肽原料藥物0.0500g，加水1ml，攪拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得針尖溶液。

2、基底溶液的制備

精密稱取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，攪拌均勻后待其溶脹過夜，即得基底溶液。

3、可溶性微針含藥針尖的制備

取步驟1中所得的針尖溶液適量加入到微針陰模中，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，隨后將多余的針尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微針空白基底的制備

在步驟3的基礎(chǔ)上，加入適量步驟2所得的基底溶液于微針陰模上，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

5、將制備好基底的微針置于干燥器中常溫干燥24h，用鑷子輕輕取下，即得tp5-bsa-dmna-m。

實(shí)施例3胸腺五肽可溶性微針的制備

本實(shí)施例進(jìn)行低劑量的胸腺五肽可溶性微針(tp5-bsa-dmna-l)的制備，其針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為800μm，針尖的底部為直徑300μm的圓形，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為900μm，基底為邊長1cm的正方形。該可溶性微針的制備包括如下步驟：

1、針尖溶液的制備

精密稱取可生物降解材料(dex40)0.2501g、bsa0.1000g、胸腺五肽原料藥物0.0100g，加水1ml，攪拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得針尖溶液。

2、基底溶液的制備

精密稱取高分子聚合物(pvpk90)1.0001g，加入乙醇2.5ml，攪拌均勻后待其溶脹過夜，即得基底溶液。

3、可溶性微針含藥針尖的制備

取步驟1中所得的針尖溶液適量加入到微針陰模中，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，隨后將多余的針尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微針空白基底的制備

在步驟3的基礎(chǔ)上，加入適量步驟2所得的基底溶液于微針陰模上，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

5、將制備好基底的微針置于干燥器中常溫干燥24h，用鑷子輕輕取下，即得tp5-bsa-dmna-m。

對(duì)比例1不含bsa的胸腺五肽可溶性微針的制備

本實(shí)施例進(jìn)行不含bsa的高劑量的胸腺五肽可溶性微針(tp5-dmna-h)的制備，其針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為800μm，針尖的底部為直徑300μm的圓形，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為900μm，基底為邊長1cm的正方形。該可溶性微針的制備包括如下步驟：

1、針尖溶液的制備

精密稱取可生物降解材料(dex40)0.2501g、胸腺五肽原料藥物0.1000g，加水1ml，攪拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得針尖溶液。

2、基底溶液的制備

精密稱取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，攪拌均勻后待其溶脹過夜，即得基底溶液。

3、可溶性微針含藥針尖的制備

取步驟1中所得的針尖溶液適量加入到微針陰模中，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，隨后將多余的針尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微針空白基底的制備

在步驟3的基礎(chǔ)上，加入適量步驟2所得的基底溶液于微針陰模上，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

5、將制備好基底的微針置于干燥器中常溫干燥24h，用鑷子輕輕取下，即得tp5-dmna-h。

對(duì)比例2不含bsa的胸腺五肽可溶性微針的制備

本實(shí)施例進(jìn)行不含bsa的中劑量的胸腺五肽可溶性微針(tp5-dmna-m)的制備，其針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為800μm，針尖的底部為直徑300μm的圓形，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為900μm，基底為邊長1cm的正方形。該可溶性微針的制備包括如下步驟：

1、針尖溶液的制備

精密稱取可生物降解材料(dex40)0.2501g、胸腺五肽原料藥物0.0500g，加水1ml，攪拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得針尖溶液。

2、基底溶液的制備

精密稱取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，攪拌均勻后待其溶脹過夜，即得基底溶液。

3、可溶性微針含藥針尖的制備

取步驟1中所得的針尖溶液適量加入到微針陰模中，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，隨后將多余的針尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微針空白基底的制備

在步驟3的基礎(chǔ)上，加入適量步驟2所得的基底溶液于微針陰模上，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

5、將制備好基底的微針置于干燥器中常溫干燥24h，用鑷子輕輕取下，即得tp5-dmna-h。

對(duì)比例3不含bsa的胸腺五肽可溶性微針的制備

本實(shí)施例進(jìn)行不含bsa的低劑量的胸腺五肽可溶性微針(tp5-dmna-l)的制備，其針尖形狀為圓錐形，針尖的高度為800μm，針尖的底部為直徑300μm的圓形，相鄰兩針尖的圓錐頂部之間的距離為900μm，基底為邊長1cm的正方形。該可溶性微針的制備包括如下步驟：

1、針尖溶液的制備

精密稱取可生物降解材料(dex40)0.2501g、胸腺五肽原料藥物0.0100g，加水1ml，攪拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得針尖溶液。

2、基底溶液的制備

精密稱取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，攪拌均勻后待其溶脹過夜，即得基底溶液。

3、可溶性微針含藥針尖的制備

取步驟1中所得的針尖溶液適量加入到微針陰模中，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，使針尖溶液充滿微針陰模的微孔道，隨后將多余的針尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微針空白基底的制備

在步驟3的基礎(chǔ)上，加入適量步驟2所得的基底溶液于微針陰模上，置于離心機(jī)中在4℃的條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min。

5、將制備好基底的微針置于干燥器中常溫干燥24h，用鑷子輕輕取下，即得tp5-dmna-l。

試驗(yàn)例1實(shí)施例1～3和對(duì)比例1～3的胸腺五肽可溶性微針的表征

采用掃描電鏡對(duì)制備的可溶性微針(tp5-dmna)的表面形貌進(jìn)行表征。方法如下：將該可溶性微針的單個(gè)針尖或整個(gè)微針陣列粘于導(dǎo)電膠一側(cè)，導(dǎo)電膠另一側(cè)黏在金屬臺(tái)板上，樣品噴金涂膜后在掃描電鏡下觀察，操作電壓為15kv，放大倍數(shù)為10～100倍。由圖1(a-f)所見，兩種不同處方輔料制備的tp5-dmna微針貼片的掃描電鏡圖尺寸、表面形態(tài)并沒有明顯的區(qū)別。tp5-bsa-dmna和tp5-dmna兩種微針貼片在不同的劑量下，制備所得表面均光滑平整，單個(gè)微針為規(guī)整的圓錐形，針壁并沒有出現(xiàn)空洞等現(xiàn)象，長度統(tǒng)一，形狀外觀均與陰模設(shè)計(jì)一致，從圖1(g-h)所見整體微針排列規(guī)整，以正方形矩陣的方式均勻分布于基層，證明了無論處方輔料是否含有bsa，并不會(huì)改變輔料溶液完全填充陰模微針的能力與干燥后成型能力及形態(tài)。

采用西藏豬背部皮膚進(jìn)行可溶性微針的皮膚穿刺實(shí)驗(yàn)。將冷凍保存的豬皮置于生理鹽水中浸泡解凍30min，拭干，角質(zhì)層向上平鋪于平板上。利用雙面膠將tp5-dmna-h固定到質(zhì)構(gòu)儀的探頭上。穿刺實(shí)驗(yàn)測試時(shí)，控制探頭以2mm/s的速度向平板移動(dòng)，直到微針接觸到角質(zhì)層。當(dāng)探頭探測到壓力為0.05n時(shí)，設(shè)定該壓力為觸發(fā)壓力，改變探頭移動(dòng)的速度為0.5mm/s繼續(xù)向下移動(dòng)；當(dāng)探頭探測到壓力為10n時(shí)，停止移動(dòng)并維持30s。最后反方向移開探頭，立即用0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液涂染西藏豬皮表面，10min之后用生理鹽水沖刷表面，用棉球擦拭干凈，觀察皮膚表面的染色微孔并用電子相機(jī)拍攝圖片。如圖2所示，僅有tp5-bsa-dmna-h、tp5-bsa-dmna-m、tp5-bsa-dmna-l可以在西藏豬離體皮膚扎出明顯的孔洞(參見圖2中的d～f)，而tp5-dmna-h、tp5-dmna-m、tp5-dmna-l無法在皮膚上留下明顯的孔洞(參見圖2中的a～c)。bsa作為一種輔料而并非模型蛋白，其加入有效地提高了微針整體的機(jī)械強(qiáng)度，使微針可有效刺破角質(zhì)層產(chǎn)生藥物運(yùn)輸微孔道。

將干燥后的tp5-bsa-dmna-h、tp5-bsa-dmna-m、tp5-bsa-dmna-l、tp5-dmna-h、tp5-dmna-m、tp5-dmna-l微針貼片取出模具，用手術(shù)刀片小心割離針尖和基底，分別置于離心管，并分別用800μl去離子水溶解，每個(gè)實(shí)施例/對(duì)比例的樣品平行三份，利用高效液相色譜法(hplc)進(jìn)行針尖或基底中tp5濃度的測定。根據(jù)色譜圖的峰面積計(jì)算tp5溶液濃度，以每片100根微針的數(shù)量計(jì)算每片貼片的針尖、基底載藥量。以針尖藥物分布率(needledrugloadingproportion,ndp)考察微針?biāo)幬锏姆植记闆r，通過以下公式計(jì)算ndp：

其中，mn代表針尖中tp5的量，mb代表基底中tp5的含量。由圖3可見，在高劑量的tp5的處方中，含bsa的tp5-dmna對(duì)比不含bsa的tp5-dmna有更高的ndp，bsa的加入可以一定程度上提高針尖中藥物的載藥量。

試驗(yàn)例2對(duì)比例1的胸腺五肽可溶性微針中藥物的穩(wěn)定性表征

利用圓二色譜對(duì)微針制劑中包裹的tp5的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由于本發(fā)明中實(shí)施例1所制備的微針貼片中用于增強(qiáng)針尖機(jī)械強(qiáng)度的針尖輔料bas為蛋白質(zhì)，可能干擾多肽類藥物tp5的色譜吸收，因此選用對(duì)比例1所制備的tp5-dmna-h考察制備過程對(duì)tp5的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。用手術(shù)刀片小心將對(duì)比例1中制備的tp5-dmna-h的針尖與基底分離，將針尖溶于去離子水中，制備得到微針中回收的tp5水溶液；取與微針載藥量等量的tp5樣品與等量微針針尖材料混合溶于去離子水中，得到tp5與dex40的物理混合溶液；取與微針載藥量等量的tp5樣品溶于去離子水中，得tp5水溶液。將以上三種溶液稀釋到適當(dāng)濃度，測定各個(gè)樣品的圓二色譜。由圖4可見，未經(jīng)處理、與dex40輔料混合、微針溶解釋放的三種tp5溶液的圓二色譜吸收峰與吸收強(qiáng)度高度一致，沒有明顯的差異。由于本發(fā)明中，基底采用乙醇作為溶劑，可有效地提高微針針尖部分的含藥量，但乙醇的擴(kuò)散可能會(huì)對(duì)針尖中的多肽或蛋白結(jié)構(gòu)造成變性或不良影響，通過cd色譜圖可證實(shí)乙醇作為基底溶劑并不會(huì)對(duì)tp5的結(jié)構(gòu)造成影響，可以保證所載tp5的活性。

試驗(yàn)例3實(shí)施例1～3的胸腺五肽可溶性微針的大鼠體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)方法：sd大鼠42只，spf級(jí)，雌性，體重180～220g，實(shí)驗(yàn)前未服用其它任何藥物。參比制劑為胸腺五肽溶液，由購于成都凱捷生物科技有限公司的胸腺五肽溶于生理鹽水制備而成。受試制劑為實(shí)施例1～3中制備的胸腺五肽可溶性微針。42只sd大鼠隨機(jī)分為6組，分別命名為1～6組，每組7只，用于體內(nèi)藥效學(xué)研究。

實(shí)驗(yàn)開始前先建立免疫抑制模型。除第1組外，其余5組大鼠以35mg/(kg*d)的劑量腹腔注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺溶液，其注射用粉末購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，用生理鹽水配制成1mg/ml的環(huán)磷酰胺溶液，連續(xù)注射三天，使大鼠免疫功能受到抑制。第1組作為空白對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水35ml/kg，連續(xù)注射三天。

模型建立成功后，進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。第1組大鼠作為空白對(duì)照組、第2組大鼠作為陰性對(duì)照組，均接受尾靜脈注射生理鹽水1ml/kg，連續(xù)注射七天。第3組大鼠作為陽性對(duì)照組，尾靜脈注射胸腺五肽溶液，胸腺五肽的劑量為100μg/kg；第4組大鼠在耳朵內(nèi)側(cè)皮膚使用實(shí)施例1中制備的tp5-bsa-dmna-h(tp5：850μg/kg)，第5組大鼠在耳朵內(nèi)側(cè)皮膚使用實(shí)施例2中制備的tp5-bsa-dmna-m(tp5：300μg/kg)，第6組大鼠在耳朵內(nèi)側(cè)皮膚使用實(shí)施例3中制備的tp5-bsa-dmna-l(tp5：100μg/kg)，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥后24h，對(duì)每只大鼠進(jìn)行稱重，腹腔靜脈取血500μl，收集于涂有肝素鈉的1ml離心管中，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)與試劑盒檢測。隨后頸椎脫臼法處死6組大鼠，收集每只大鼠的胸腺與脾臟，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)(organindex)的計(jì)算公式如下：

其中wo為胸腺或脾臟的質(zhì)量，w為大鼠的體重。如圖5所示，陰性對(duì)照組(第2組)脾臟、胸腺系數(shù)均低于空白對(duì)照組(第1組)，可以確證免疫抑制模型建立成功。給藥組(第3～6組)的脾臟與胸腺系數(shù)數(shù)值均高于模型組(陰性對(duì)照組)，對(duì)免疫抑制大鼠的臟器系數(shù)均有所提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，驗(yàn)證了胸腺五肽可溶性微針?biāo)幮c注射組相當(dāng)。

1、流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備與檢測：

取用肝素抗凝的全血100μl，加入cd3:fitc/cd4:rpe或者cd3:fitc/cd8:rpe熒光抗體10μl，渦旋振蕩充分混勻，不能過于劇烈，在避光條件下室溫孵育15分鐘，然后向管中加入紅細(xì)胞裂解液，渦旋充分混勻，再將離心管在37℃水浴中避光放置30min完全溶血后，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min,棄去上清液，再用pbs兩次洗滌，除去未結(jié)合的抗體，800rpm離心6min，棄去上清液，再用0.5mlpbs重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀。如表1所示，對(duì)比第1組，大鼠注射環(huán)磷酰胺后的第2組大鼠的t細(xì)胞表面抗原cd4+/cd8+的比值顯著性下降(p<0.05)，從免疫指標(biāo)證明了注射足夠量的環(huán)磷酰胺可以建立免疫抑制模型。不同劑量的胸腺五肽可溶性微針(第4～6組)與胸腺五肽溶液(第3組)給藥后，各組大鼠cd4+/cd8+的比值均有所改善，與第2組對(duì)比有顯著性差異(p<0.05)，表明胸腺五肽可溶性微針有一定的免疫調(diào)節(jié)效果，可使cd4+/cd8+恢復(fù)正常。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，第3～6組之間沒有顯著差異，說明胸腺五肽可溶性微針貼片與靜脈給藥效果相當(dāng)。

表1外周血t淋巴細(xì)胞亞群比例的變化(n＝7)

a:p<0.05vsgroup1；b:p<0.05vsgroup2.

2、丙二醛(maleicdialdehyde,mda)試劑盒檢測：

(一)組成與配制：

(1)試劑一：液體20ml/1瓶，室溫保存。

(2)試劑二：液體12ml/1瓶，用時(shí)每瓶加340ml雙蒸水混勻，4℃保存。

(3)粉劑1支，用時(shí)將粉劑加入到90℃～100℃的熱雙蒸水60ml中(在溶解過程中適當(dāng)加熱)，充分溶解后用雙蒸水補(bǔ)足至60ml再加冰醋酸60ml,混勻，配好的試劑避光保存。

(4)標(biāo)準(zhǔn)品：10nmol/ml四乙氨基丙烷5ml/1瓶，4℃保存。

(二)操作流程

表2mda測定操作步驟

按照表2所示，往試管中依次加入10nmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品\無水乙醇或者測試樣品、試劑一，搖動(dòng)幾下試管下確保混勻各加入的試劑，再加入指定劑量的試劑二和試劑三，用渦旋儀充分混勻后，用保鮮膜扎緊試管口，用針頭刺破一小孔，在95℃中水浴(或用鍋蓋掀開煮沸)40min，取出后用流水冷卻，隨后3500～4000rpm/min離心10分鐘，取上清液在532nm測定其吸光度，用蒸餾水調(diào)零，測定各試管的吸光度。

(三)血清中mda含量的計(jì)算公式

血清中mda含量＝(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(測定管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10nmol/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。結(jié)果如圖6所示。

3、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)試劑盒檢測

(一)組成與配制

(1)試劑一：貯備液，10ml/瓶(天冷或放置于冰箱中會(huì)有部分結(jié)晶產(chǎn)生，需熱水浴溶解后使用)，試劑一應(yīng)用液配制，用時(shí)每瓶10ml貯備液加蒸餾水稀釋到100ml，4℃保存；

(2)試劑二：液體10ml/瓶，4℃保存；

(3)試劑三：液體10ml/瓶，4℃保存；

(4)試劑四：貯備液，50μl×2支，4℃保存；4號(hào)稀釋液，10ml/瓶，4℃保存；

(5)試劑五：粉劑1支，用時(shí)加70℃熱雙蒸水75ml溶解后備用，若加熱過程中水分蒸發(fā)，必須加蒸餾水補(bǔ)充至75ml，配好后避光4℃保存。

(6)試劑六：粉劑1支，用的時(shí)候加蒸餾水75ml溶解后備用，配好后避光4℃保存。

顯色劑為按試劑五：試劑六：冰乙酸＝3:3:2的體積比配制，4℃保存。

(二)操作流程

表3sod酶活性測定操作步驟

按表3所示一次加入指定量的各試劑于離心管中，混勻后再加入顯色劑充分混勻，室溫放置10分鐘，在波長550nm測定各試管的吸光度，蒸餾水調(diào)零，比色。

(三)血清中sod活力計(jì)算公式

sod活力(u/mgprot)＝(對(duì)照管吸光度-測定管吸光度)/對(duì)照管吸光度/50％×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前倍數(shù)。結(jié)果如圖6所示。

如圖6所示，接受連續(xù)三天的環(huán)磷酰胺溶液腹腔注射的第2組大鼠血液sod活性下降，mda值顯著性升高，幾乎增大為正常組(第1組)水平的兩倍。第3～6組大鼠接受連續(xù)七天不同劑型的tp5給藥后，第3組大鼠的mda值和sod活性均恢復(fù)到正常水平(p<0.05)，不同劑量的微針貼片組與正常組(第1組)對(duì)比，sod活性和mda水平無顯著性差異。sod酶活力與mda水平輔助性地證實(shí)了胸腺五肽可溶性微針給藥途徑的可靠性。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。