本發(fā)明屬于動物免疫領域中鼠疫菌粘膜疫苗的免疫佐劑，特別是涉及鼠毒素作為粘膜免疫佐劑的應用及含有該佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗。
背景技術(shù)：
：：鼠疫是由鼠疫菌(yersiniapestis)引起的烈性傳染病。近年來，世界鼠疫疫情呈上升趨勢，2000年世界衛(wèi)生組織將鼠疫列為重新抬頭的傳染病(who.humanplaguein1998and1999.weeklyepidemiologicalrecord2000；75:338-43.)。另外，鼠疫菌是一種標準的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，美國已將鼠疫菌列為恐怖分子最有可能使用的6種生物劑之一。1994年印度發(fā)生的腺鼠疫流行和2005年發(fā)生的剛果肺鼠疫流行引起了各國政府的高度重視(campbellgl,hughesjm.plagueinindia:anewwarningfromanoldnemesis.anninternmed1995jan15；122(2):151-3.who.plagueinthedemocraticrepublicofthecongo.whosite2005.)。我國是鼠疫疫情最嚴重的國家之一，至今沒有任何種類的鼠疫疫苗進入臨床試驗階段，顯然鼠疫疫苗的研究迫在眉睫。由于鼠疫滅活疫苗僅對腺鼠疫具有一定的保護作用，而且保護時間短，因此這類疫苗不適合于大規(guī)模的預防接種。美軍在越戰(zhàn)中曾使用的usp滅活疫苗于1999年也停止生產(chǎn)(russellp,eleysm,hibbsse,mancheerj,staggaj,titballrw.acomparisonofplaguevaccine,uspandev76vaccineinducedprotectionagainstyersiniapestisinamurinemodel.vaccine1995nov；13(16):1551-6.)。鼠疫菌ev76疫苗株是最好的減毒活疫苗，能提供早期的保護作用，但有時副作用嚴重。重組亞單位疫苗和dna疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫苗的許多缺陷，不含有感染性組分，無致病性，而且對腺鼠疫和肺鼠疫具有一定的免疫保護作用。目前，在鼠疫菌中發(fā)現(xiàn)的保護性抗原包括f1(莢膜抗原)、lcrv(v-抗原)、yscf和yopd。f1抗原由鼠疫菌pmt1質(zhì)粒上的f1操縱子編碼，以多聚體的形式在細胞表面形成莢膜，f1抗體通過阻斷f1蛋白的抗吞噬作用從而具有免疫保護作用(duy,rosqvistr,forsberga.roleoffraction1antigenofyersiniapestisininhibitionofphagocytosis.infectimmun2002mar；70(3):1453-60.)。lcrv、yscf和yopd由鼠疫菌pcd1質(zhì)粒編碼，通過iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)分泌與轉(zhuǎn)運(cornelisgr.molecularandcellbiologyaspectsofplague.procnatlacadsciusa2000aug1；97(16):8778-83.)。lcrv是一種多功能蛋白，與鼠疫菌的抗吞噬能力有關，具有免疫保護和免疫抑制作用(petterssonj,holmstroma,hillj,learys,frithz-lindstene,voneuler-matella,etal.thev-antigenofyersiniaissurfaceexposedbeforetargetcellcontactandinvolvedinvirulenceproteintranslocation.molmicrobiol1999jun；32(5):961-76.)。yscf是鼠疫菌iii型分泌系統(tǒng)分泌的針狀表面蛋白，最近發(fā)現(xiàn)對鼠疫具有較好的免疫保護作用。yopd也是iii型分泌系統(tǒng)分泌的表面蛋白，參與iii型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運過程，免疫保護作用不明顯。肺鼠疫的早期癥狀類似于呼吸系統(tǒng)疾病，而且病程發(fā)展迅速，是致死性最強的鼠疫。生物戰(zhàn)和生物恐怖常采用氣溶膠的方式進行攻擊，因此研究針對肺鼠疫有效的疫苗是極其重要的(leonanicolecalhouny-mk.salmonella-basedplaguevaccinesforbioterrorism.jmicrobiolimmunolinfect2006；39:92-7.)。為了有效地預防肺鼠疫，一般認為疫苗必須經(jīng)粘膜途徑免疫才最有效。因為微生物感染粘膜的過程包括粘附、定居、侵入、釋放毒素。粘膜免疫接種的目的就是誘導局部產(chǎn)生免疫應答,阻止上述感染過程發(fā)生。粘膜免疫不但可在粘膜部位引起局部免疫應答，也可有效地誘導全身性系統(tǒng)免疫反應。其次，由于粘膜淋巴細胞的歸巢性，在一個粘膜部位激活的部分淋巴細胞可以通過淋巴液進入血液循環(huán)遷移到遠處，將免疫應答擴散到其它粘膜部位，因此，在一個粘膜部位接種疫苗即可預防其它粘膜感染。所以，為了引起肺部粘膜保護反應，必須經(jīng)粘膜途徑免疫，粘膜疫苗對于肺鼠疫免疫保護具有很好的效果，而皮下、肌肉注射是以氫氧化鋁為佐劑，注射免疫誘導主要以系統(tǒng)免疫igg為主，均不能誘導有效的局部粘膜免疫應答(p.b.historyoforaltoleranceandmucosalimmunity.annnyacadsci1996；778:1-27.)。雖然粘膜疫苗具有很多優(yōu)點,但是單純將疫苗接種到粘膜表面效果并不理想。因此，用于粘膜接種的疫苗常需與佐劑混合才能提高粘膜保護效果。鼠毒素是由鼠疫菌產(chǎn)生的一種對小鼠、大鼠強毒，但對豚鼠以上大動物低毒的毒素。過去一直認為鼠毒素是一種胞內(nèi)毒素，但近來的研究發(fā)現(xiàn)鼠毒素具有分泌到胞外的特性，因此鼠毒素既是一種胞內(nèi)毒素也是一種分泌性毒素。從鼠疫菌培養(yǎng)物種中提取純化的鼠毒素，腹腔注射小白鼠的ld50(按每公斤體重計算)大約是10-185μg(hinnebuschj,cherepanovp,duy,rudolpha,dixonjd,schwant,etal.murinetoxinofyersiniapestisshowsphospholipasedactivitybutisnotrequiredforvirulenceinmice.intjmedmicrobiol2000oct；290(4-5):483-7.)，而靜脈途徑的ld50大約是10μg(ajlsj,rustj,jr.,hunterd,woebkej,bentdf.preparationofserologicallyhomogeneousplaguemurinetoxinanditsreactionswithphysical,chemicalandenzymaticagents.jimmunol1958jun；80(6):435-40.)。最近，研究人員實現(xiàn)了鼠毒素在大腸桿菌中的重組表達。用大腸桿菌重組表達的鼠毒素分別腹腔、靜脈、肌肉和皮下注射小白鼠，測得的ld50分別是50、25.6、160和89μg(fany,zhouy,fengn,wangq,tiang,wux,etal.recombinantmurinetoxinfromyersiniapestisshowshightoxicityandb-adrenergicblockingactivityinmicemicrobesandinfection2016；18:329-35.)。由此可見，重組表達的鼠毒素具有與天然鼠毒素相當?shù)亩玖?，為鼠毒素毒力的研究提供了便利條件。鼠毒素是一種細菌毒素，與其它細菌毒素相比，鼠毒素與某些毒素的毒力相當，如化膿性鏈球菌溶血素等；許多細菌毒素的毒力比鼠毒素強，如嗜水氣單胞菌菌溶素等；某些細菌毒素的毒力比鼠毒素的毒力弱，如蠟樣芽孢桿菌腸毒素等(gilldm.bacterialtoxins:atableoflethalamounts.microbiologicalreviews1982；46(1):86-94.)。粘膜是機體抵抗感染的第一道防線，粘膜相關淋巴組織則是機體最大的淋巴器官系統(tǒng)，可對外來物質(zhì)產(chǎn)生相應的應答。粘膜免疫可以誘導局部粘膜產(chǎn)生分泌性iga、igm和igg等保護性抗體，并可誘導其它部位的粘膜也產(chǎn)生iga，這是粘膜免疫保護作用的主要機制。目前，粘膜免疫反應的機制還不完全清楚，但粘膜免疫佐劑能顯著提高免疫反應強度的特性使其成為感染免疫和疫苗領域的一個研究熱點。粘膜免疫佐劑的種類多種多樣，但無共同特征，因此無法判斷一種物質(zhì)是否具有粘膜免疫佐劑的特性。目前，人們通過動物實驗已開發(fā)出多種粘膜佐劑，其中有相當一部分具有良好的免疫佐劑活性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供一種鼠毒素的新用途。本發(fā)明所提供的鼠毒素的新用途是鼠毒素可以用于制備能顯著提高粘膜免疫應答強度的粘膜免疫佐劑。所述鼠毒素可為天然鼠毒素或重組表達的鼠毒素。鼠毒素基因的genbank號為x92727，其序列如序列表中序列1所示。所述天然鼠毒素來源于鼠疫菌培養(yǎng)物，提取方法為高效液相色譜法(matthewc.seguin,danieln.harrison,jamese.williams.arapidandsafeprocedureforpreparingthemurinetoxinsoftheplaguebacillus(yersiniapestis)toxicon1987；25(9):989-994.)。所述重組表達的鼠毒素可為用大腸桿菌重組表達的鼠毒素。方法為常規(guī)原核表達方法。所述用鼠毒素制備粘膜免疫佐劑的方法為：將鼠毒素50-80℃加熱0.5-3h使其滅活，滅活的鼠毒素即可直接作為粘膜免疫佐劑使用。所述鼠毒素的滅活條件優(yōu)選為：56℃加熱1小時。本發(fā)明所提供的鼠毒素粘膜免疫佐劑在制備鼠疫菌粘膜疫苗中的應用也屬于本發(fā)明。鼠疫菌粘膜疫苗的制備方法，是將鼠毒素粘膜免疫佐劑與鼠疫菌保護性抗原混合，得到鼠疫菌粘膜疫苗。本發(fā)明的第二個目的是提供一種鼠疫菌粘膜疫苗。本發(fā)明提出的鼠疫菌粘膜疫苗，能實現(xiàn)粘膜免疫應答，包含鼠疫菌保護性抗原和所述鼠毒素粘膜免疫佐劑，或包含鼠疫菌保護性抗原和任何滅活后的鼠毒素。這里，所述保護性抗原包括但不限于f1(莢膜抗原)、lcrv(v-抗原)、yscf和yopd。具體的一種鼠疫菌粘膜疫苗，所述鼠疫菌保護性抗原為f1，將滅活后鼠毒素或所述鼠毒素粘膜免疫佐劑與f1混合得到，每20重量份f1中滅活后鼠毒素或所述鼠毒素粘膜免疫佐劑的加入量大于或等于5重量份即可。作為鼠疫菌粘膜疫苗的具體組配，每20重量份f1中滅活后鼠毒素或所述鼠毒素粘膜免疫佐劑的加入量為5-20重量份。所述鼠疫菌保護性抗原f1是從鼠疫菌中提取、純化的，提取、純化方法為飽和硫酸銨沉淀結(jié)合分子篩過濾的方法(wangt,qiz,wub,zhuz,yangy,cuib,etal.anewpurificationstrategyforfraction1capsularantigenanditsefficacyagainstyersiniapestisvirulentstrainchallenge.proteinexprpurif2008sep；61(1):7-12.)，具體方法為：將鼠疫菌ev76疫苗株接種bhi-xy培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)接種到含無菌玻璃珠的bhi-xy培養(yǎng)基中，37℃再培養(yǎng)72h，離心收集上清，上清用不同飽和度(飽和度依次為40％、25％和5％)的硫酸銨分步沉淀后，用sephacryls-200hr柱過濾得到天然f1抗原。本發(fā)明所提供的鼠疫菌粘膜疫苗可通過滴鼻的方式進行免疫，免疫劑量為250-1000μg/kg體重，免疫時間為3-6周。免疫劑量和免疫時間可根據(jù)實際情況進行調(diào)整。本發(fā)明提供了一種鼠毒素的新用途，即作為粘膜免疫佐劑的應用。將含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗通過滴鼻的方式免疫balb/c小鼠，然后分離血清和肺灌洗液，通過elisa測定igg和iga抗體水平，檢測結(jié)果表明鼠毒素粘膜免疫佐劑能顯著提高血清中針對鼠疫菌保護性抗原(例如f1)產(chǎn)生的igg和iga抗體水平，同時也能提高肺灌洗液中的iga抗體水平，表明鼠毒素粘膜免疫佐劑是一種能顯著提高粘膜免疫應答效果的針對鼠疫菌保護性抗原的粘膜免疫佐劑。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。附圖說明圖1為用大腸桿菌表達的重組鼠毒素的12％sds-page電泳圖譜(a幅)和wb鑒定圖譜(b幅)；圖2為純化的重組鼠毒素的12％sds-page電泳圖譜(a幅)和wb鑒定圖譜(b幅)；圖3為含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗免疫小鼠的血清igg抗體滴度的elisa測定結(jié)果；圖4為含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗免疫小鼠的血清iga抗體滴度的elisa測定結(jié)果；圖5為含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗免疫小鼠的肺沖洗液iga抗體滴度的elisa測定結(jié)果。具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1、制備鼠毒素粘膜免疫佐劑1、獲得重組鼠毒素參照文獻(fany,zhouy,fengn,wangq,tiang,wux,etal.recombinantmurinetoxinfromyersiniapestisshowshightoxicityandb-adrenergicblockingactivityinmice.microbesandinfection2016；18:329-35.)中記載的方法用大腸桿菌重組表達鼠毒素，表達方法包括以下步驟：1)pcr擴增鼠毒素基因：根據(jù)已知的鼠毒素基因(genbank號：x92727)設計pcr擴增引物，引物序列為f：5′-catgcatatgggatgcttcaaatagataatg-3′和r：5′-cccctcgagatttgggcttaattttgg-3′，再以鼠疫菌基因組dna為模板，在引物f和r的引導下pcr擴增鼠毒素基因，pcr反應體系為：dna模板(20ng)1μl，上下游引物(5μm)各1μl，dntp(10μm)3μl，10×buffer3μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.2μl，加無菌去離子水至總體積30μl，pcr反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性40sec，56℃退火40sec，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr反應結(jié)束后，對pcr擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了1764bp的目的基因，與預期結(jié)果相符，回收并純化該目的基因，測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的鼠毒素基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。2)構(gòu)建鼠毒素的重組表達載體：用ndei酶和xhoi酶對步驟1)獲得的鼠毒素基因進行雙酶切，回收并純化1764bp的雙酶切鼠毒素基因片段，用ndei酶和xhoi酶對pet28a載體(購自novagen公司)進行雙酶切，回收并純化5000bp的雙酶切pet28a載體片段，將雙酶切鼠毒素基因片段與雙酶切pet28a載體片段進行連接，連接體系為：載體1μl，目的片段4μl，t4dna酶和10×緩沖液各1μl，加無菌去離子水至10μl，連接條件為4℃連接過夜(6-12小時)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.coli.bl21感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，測序，測序結(jié)果表明獲得了序列及連接位置均正確的攜帶鼠毒素基因的重組表達載體，命名為pet28a-ymt。3)用大腸桿菌表達鼠毒素：將步驟2)構(gòu)建的鼠毒素重組表達載體pet28a-ymt轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆。將陽性單菌落接種于10mllb液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素200ug/ml，卡那霉素30ug/ml和四環(huán)素25ug/ml)中，在37℃、250rpm條件下培養(yǎng)過夜(6-12小時)。將10ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至1llb液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素200ug/ml，卡那霉素30ug/ml和四環(huán)素25ug/ml)中，在37℃、250rpm條件下培養(yǎng)至od600≈0.6(約4小時)。加入iptg至終濃度為0.1mm(加入1miptg溶液100ul)，在23℃、250rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)結(jié)束后，6000rmp離心5分鐘收獲細菌。將細菌沉淀重懸于40ml10mmtris·hcl(ph8.0)中，冰浴中超聲破碎(功率300w，每次5秒，間隔5秒，共50次)，在4℃、12000rpm下離心30分鐘，收集上清。取離心前、后樣品進行12％sds-page電泳和wb鑒定，鑒定蛋白可溶性，鑒定結(jié)果如圖1所示(a：sds-page電泳結(jié)果；b：wb鑒定結(jié)果。泳道m(xù)為低分子量蛋白質(zhì)標準，泳道1為沉淀中的鼠毒素蛋白，泳道2為上清中的鼠毒素蛋白)，鑒定結(jié)果表明：經(jīng)iptg誘導表達后，獲得了分子量為67kda的鼠毒素重組蛋白，與預期結(jié)果一致，并主要以可溶的形式表達。4)純化鼠毒素：純化重組表達的鼠毒素，方法為鎳柱親和層析(seemamukhijaandbernharderni.purificationbyni2+affinitychromatography,andfunctionalreconstitutionofthetransporterforn-acetylglucosamineofescherichiacoli.journalofbiologicalchemistry1996,271(25):14819-14824.)，對純化的重組鼠毒素進行12％sds-page電泳和wb鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示(a：sds-page電泳結(jié)果；b：wb鑒定結(jié)果。泳道m(xù)為低分子量蛋白質(zhì)標準，泳道1為含50mm咪唑的ps洗脫獲得的鼠毒素蛋白，泳道2為含100mm咪唑的ps洗脫獲得的鼠毒素蛋白，泳道3為含200mm咪唑的ps洗脫獲得的鼠毒素蛋白)，鑒定表明獲得了分子量為67kda的純化的重組鼠毒素。2、鼠毒素的滅活將鼠毒素56℃加熱1小時(50-80℃加熱0.5-3時間均可)使其滅活，滅活的目的是降低鼠毒素對免疫動物的毒力而保留佐劑活性，滅活的鼠毒素即可直接作為粘膜免疫佐劑使用。實施例2：制備含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗1、獲得鼠疫菌保護性抗原f1參照文獻(wangt,qiz,wub,zhuz,yangy,cuib,etal.anewpurificationstrategyforfraction1capsularantigenanditsefficacyagainstyersiniapestisvirulentstrainchallenge.proteinexprpurif2008sep；61(1):7-12.)中記載的方法用從鼠疫菌中提取、純化鼠疫菌保護性抗原f1，提取、純化方法包括以下步驟：將鼠疫菌ev76疫苗株(購自蘭州生物制品研究所)接種bhi-xy培養(yǎng)基(購自difcolaboratories,subsidiaryofbecton,dickinsonandcompany)，37℃培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)接種到含無菌玻璃珠的bhi-xy培養(yǎng)基中，37℃再培養(yǎng)72h，離心收集上清，上清用不同飽和度(飽和度依次為40％、25％、5％)的硫酸銨分步沉淀后，用sephacryls-200hr柱(購自amershambiosciences)過濾得到天然f1抗原。2、制備含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗及其免疫應答效果檢測1)鼠疫菌粘膜疫苗及對照的組成⑴f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(1μg，10μl)⑵f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(5μg，10μl)⑶f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(10μg，10μl)⑷f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(15μg，10μl)⑸f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(20μg，10μl)⑹f1抗原(20μg，20μl)⑺滅活鼠毒素(20μg，20μl)⑻空白對照組(20μl生理鹽水)將上述⑴-⑻組疫苗分別命名為f1+y(20+1μg),f1+y(20+5μg)，f1+y(20+10μg)，f1+y(20+15μg)，f1+y(20+20μg)，f1(20μg)，y(20μg)，s(20μl)。2)制備鼠疫菌粘膜疫苗將鼠疫菌f1抗原用去離子水稀釋成2μg/μl,分別取10μl稀釋后的f1抗原與10μl含不同量(見步驟1，混合比例為20(f1):1-20(y))的滅活鼠毒素(實施例1得到的鼠毒素粘膜免疫佐劑)混合，得到配比如(1)-(5)的鼠疫菌粘膜疫苗。分別取20μl含20μg的f1抗原和20μl滅活鼠毒素作為對照。取20μl生理鹽水作為空白對照。3)免疫動物將6-8周雌性balb/c小鼠(購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)隨機分為8組，其中包括7個鼠疫菌粘膜疫苗組和1個空白對照組，每組包含10只小鼠。各組動物免疫前用戊巴比妥麻醉，分別滴鼻免疫小鼠，免疫劑量為20μl/只小鼠，空白對照組免疫生理鹽水。每隔1周免疫一次，共免疫3次，免疫方法同上。4)血清igg和iga抗體滴度的elisa測定初次免疫后第4周小鼠尾靜脈采血，4℃冰箱放置過夜(8-12小時)，分離血清備用。將制備的f1抗原用pbs稀釋至終濃度500ng/ml，每孔加100μl，置4℃過夜，包被酶聯(lián)板。每孔加200μl干酪素溶液(0.1％)封閉酶聯(lián)板，置37℃孵箱后2小時，取出，拍干。將各實驗組動物血清(一抗)分別用0.05％干酪素溶液稀釋，以正常小鼠血清為陰性對照。每孔加入1:500稀釋的實驗動物血清100μl，然后，置37℃孵箱內(nèi)濕盒中30分鐘，取出酶聯(lián)板用洗液洗5次，拍干。然后，加入用0.05％干酪素溶液配制的、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠igg或辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠iga(二抗)，置37℃濕盒中20分鐘，加底物tmb液(50μl/孔)，37℃置濕盒中10min，取出直接加入終止液(50μl/孔)，用酶聯(lián)儀測定各孔od450值?？贵w滴度以od450值的平均值±sd表示。檢測結(jié)果如圖3和圖4(縱坐標為od值)所示，可以看出，與未添加鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗⑹f1抗原(20μg，20μl)相比，⑵f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(5μg，10μl)、⑶f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(10μg，10μl)、⑷f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(15μg，10μl)和⑸f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(20μg，10μl)各添加鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗均引起血清igg和iga抗體水平的顯著提高，但⑴f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(1μg，10μl)鼠疫菌粘膜疫苗產(chǎn)生的各抗體水平與不加佐劑的疫苗⑹f1抗原(20μg，20μl)相當。然而，在⑵、⑶、⑷和⑸疫苗之間抗體水平無顯著差異。檢測結(jié)果表明，鼠毒素粘膜免疫佐劑能顯著提高f1抗原粘膜免疫應答的效果，但鼠毒素的加入量應高于1μg，而5μg或以上加入量能顯著提高f1抗原粘膜免疫應答的效果，但過多加入鼠毒素量也無意義。5)肺灌洗液iga抗體滴度的elisa測定初次免疫后第4周，腹腔注射1％戊巴比妥溶液100μl，麻醉后剪開頸部皮膚，充分暴露氣管，沿氣管上端剪一楔形口，用1ml生理鹽水沖洗肺泡，反復抽吸3次，收集沖洗液，離心，收集上清。肺沖洗液iga抗體滴度測定方法同血清抗體滴度測定方法，所不同的是二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠iga。檢測結(jié)果如圖5所示(縱坐標為od值)，可以看出，與未添加鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗⑹f1抗原(20μg，20μl)相比，⑵f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(5μg，10μl)、⑶f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(10μg，10μl)、⑷f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(15μg，10μl)和⑸f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(20μg，10μl)各添加鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗均引起肺灌洗液iga抗體水平的顯著提高，但⑴f1抗原(20μg，10μl)+滅活鼠毒素(1μg，10μl)鼠疫菌粘膜疫苗產(chǎn)生的各抗體水平與不加佐劑的疫苗⑹f1抗原(20μg，20μl)相當。然而，在⑵、⑶、⑷和⑸疫苗之間抗體水平無顯著差異。檢測結(jié)果表明，鼠毒素粘膜免疫佐劑能顯著提高f1抗原粘膜免疫應答的效果，但鼠毒素的加入量應高于1μg，而5μg或以上加入量能顯著提高f1抗原粘膜免疫應答的效果，但過多加入鼠毒素量也無意義。實施例3：制備含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗分別用其它鼠疫菌保護性抗原lcrv(v-抗原)、yscf和yopd替代實施例2中的f1(莢膜抗原)，其它制備鼠疫菌粘膜疫苗與驗證其針對不同抗原粘膜免疫應答效果的方法相同。結(jié)果顯示：lcrv中加入鼠毒素粘膜免疫佐劑制備的鼠疫菌粘膜疫苗能顯著提高lcrv抗原粘膜免疫應答的效果，yscf中加入鼠毒素粘膜免疫佐劑制備的鼠疫菌粘膜疫苗能顯著提高yscf抗原粘膜免疫應答的效果，yopd中加入鼠毒素粘膜免疫佐劑制備的鼠疫菌粘膜疫苗能顯著提高yopd抗原粘膜免疫應答的效果。以上實施例驗證了將含有鼠毒素粘膜免疫佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗通過滴鼻的方式免疫balb/c小鼠，然后分離血清和肺灌洗液，通過elisa測定igg和iga抗體水平，檢測結(jié)果表明鼠毒素粘膜免疫佐劑能顯著提高血清中針對鼠疫菌保護性抗原產(chǎn)生的igg和iga抗體水平，同時也能提高肺灌洗液中的iga抗體水平，表明鼠毒素粘膜免疫佐劑是一種能顯著提高粘膜免疫應答效果的針對鼠疫菌保護性抗原的粘膜免疫佐劑。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所<120>鼠毒素作為粘膜免疫佐劑的應用及含有該佐劑的鼠疫菌粘膜疫苗<130>cgcnb175051w<160>1<210>1<211>1764<212>dna<213>鼠毒素基因<400>1atgcttcaaatagataatgtcattaataatattggaaactactttcatcatctaagtaac60attaattatatacgacttctggataccccccatgcttggggagccccatttggtaaagaa120atcatgcagcaatcttacttacggcaagaggagtttgcaggggcaatgactgaagtactg180cggaattcgcgttatcgctgtgatatatcatcacttaatagccccgatgcagagtggcga240aaagtgatttttaaggccattgatgaatccttatcgaaaaaaatggggcgaactcagcca300actcagtataggtttcttttcggccaatctccaacagtatttatgaatgggttatctgct360gcaacaaatggctcccctgactttgttgcttttaaatcagagttaattcagctaattaag420gagcgaggacaatattgggaaaaaatgcctgaaatttggctaggccgtttctttagaata480gaagaagggttggctacatcatttatgagaaacgtgtatcctgatttcccaccaatcaac540gatacaagaatgacatggaatcacacaaaaataatggcctcagatggtactgaagctctt600gttggtggacataacatgaacatggatctatttagaaattatccacctgttcatgatgta660tcaattatcactcatggttcttctgcttatggctcccagctatatcttaacgaactatgg720tcatgtaattcagatttactaaaaaaagaatattttgattatgaaagcatgatgtgggcg780gtcggaacaaagttctatgataagcctgaagatccgcttaaaagctcagttgctatgaat840tatatgaagcaacggcaagaggacctactcaacttgcatgaaaactttaatcagaaggta900gcgactcgtattagtgaatacgaaaacatggaagagtataaaaaagcagacagagtttta960tcagtaggtaaatattggacaggacctaatatggagcatgactaccaaagagggtctgaa1020ataatgaaagagcaactgataaaaaatgctaagcgcataattagaatttcacagcaagat1080ctcgtgagtgcttggaaaaaaaaatggaaagaccactttacgtgtaattggattattgag1140gctttgttagaaaataaagatcttcatattcatgttgtagtctctgctctagatgcagca1200gctggagctgctggtgatcagtactcatttggttctggagcagaacggacctatgaatta1260tttaagtattacctaacccatgatattgataccgatgaagtattagacgatcctgatggt1320agccgtgctgatgccttaaaaagaatattgattgcaccattcttctttacagataaagta1380cctgatgaaaatacaattgaaggcgaaacctacaagtggcctgatttagaacaaagcgct1440tatactgcaacacttaagcaaaaaccactttcggaaaaacccccgcatcaaggtattatt1500ggtagtgcactaatgtcagcaattaaaggtagtggacttttctatcctaaagtccctgtt1560gcacctggtaatcacgccaaattaatgattattgacgatgagttgtacgttgttggatca1620gataatctttatcccggttatctgtcagagtttgactatttagtcgaaggaaaagatgca1680gttaatgaattaatgaaatcttactgggaaccattgtggaaatattctagcccacatgca1740tttccaaaattaagcccaaattga1764當前第1頁12當前第1頁12