本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，涉及一種神經(jīng)修復(fù)用神經(jīng)導(dǎo)管及其制備方法，特別涉及一種導(dǎo)電納米纖維管狀支架和一種用于管內(nèi)作為促進(jìn)神經(jīng)再生的新型組織工程填充材料及制備方法。

背景技術(shù)：

由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除等原因造成的周圍神經(jīng)組織損傷在臨床非常多見。神經(jīng)一旦受損，將使病人無法正常生活與工作，但大段神經(jīng)缺損的修復(fù)和功能重建仍然是臨床難題。神經(jīng)移植是臨床上公認(rèn)的比較有效的治療大段神經(jīng)缺損方法，但自體神經(jīng)來源有限，異體神經(jīng)很難避免免疫排斥，用骨骼肌或靜脈代替神經(jīng)進(jìn)行移植，修復(fù)效果又有限。隨著神經(jīng)組織工程學(xué)的發(fā)展，生物可吸收神經(jīng)導(dǎo)管成為最有希望成功修復(fù)大段神經(jīng)缺損的方法。神經(jīng)導(dǎo)管的基本功能是為神經(jīng)的生長提供一個通道，為了給軸突生長提供理想的微環(huán)境，國內(nèi)外研究人員在制備具有縱向排列孔結(jié)構(gòu)神經(jīng)導(dǎo)管、負(fù)載生物活性物質(zhì)的神經(jīng)導(dǎo)管、導(dǎo)電性神經(jīng)導(dǎo)管等多方面進(jìn)行了深入探索，這些導(dǎo)管材料據(jù)稱都能加速神經(jīng)生長和減少神經(jīng)瘤的形成。但從組織工程學(xué)的角度，除了生物相容性和生物可降解性，用于神經(jīng)再生修復(fù)的理想支架材料應(yīng)該同時具有：引導(dǎo)軸突生長方向的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)；刺激軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)的仿生電生理特性；提高神經(jīng)再生速度和質(zhì)量的生物活性物質(zhì)；負(fù)載利于神經(jīng)修復(fù)的細(xì)胞等。滿足以上條件，制備出完全仿生的神經(jīng)導(dǎo)管支架，將大幅度提高神經(jīng)修復(fù)的效果。

目前的研究中，各種神經(jīng)導(dǎo)管材料和設(shè)計不斷被推出，如專利cn102525689b采用靜電紡絲法制備了一種取向納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管，引導(dǎo)神經(jīng)沿纖維取向方向生長；專利cn1303946c公開了一種神經(jīng)組織工程管狀支架的制備方法及其專用模具，構(gòu)建了內(nèi)部帶有軸向多通道結(jié)構(gòu)的殼聚糖管狀支架；專利cn101579246a公開了一種雙層神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管的制備，其內(nèi)外層分別由平行和垂直導(dǎo)管延展方向排列的絲素蛋白纖維構(gòu)成；專利cn103230622a也公開了一種多層纖維膜構(gòu)建的、降解速度由內(nèi)向外逐漸減慢的神經(jīng)移植導(dǎo)管；專利cn10105194729a中采用高分導(dǎo)電材料制備一種具有導(dǎo)電能力的管體支架，通過體內(nèi)植入電極，施加電刺激，大鼠坐骨修復(fù)效果良好；專利cn103263695a中公開了一種全氟三乙胺乳液與種子細(xì)胞復(fù)合的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法，是將混有種子細(xì)胞的全氟三乙胺乳液注入多微孔可降解膠原-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)得到。但尚未有一種導(dǎo)管支架材料能為神經(jīng)組織工程提供多功能的仿生微環(huán)境。因此，如何優(yōu)化設(shè)計和制備一種更加全面促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和再生的組織工程支架，是保障再生神經(jīng)功能恢復(fù)和充分發(fā)揮功效的必要前提。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為神經(jīng)組織工程提供一種管狀支架材料，采用導(dǎo)電性高分子材料，制備同時負(fù)載神經(jīng)營養(yǎng)因子和利于神經(jīng)再生種子細(xì)胞的導(dǎo)電性管狀支架。該支架管壁具有通透性，但阻隔纖維組織的進(jìn)入生長；該支架內(nèi)管壁具有平行導(dǎo)管延展方向的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，利于神經(jīng)軸突和種子細(xì)胞的取向生長；該管狀支架內(nèi)填充有導(dǎo)電凝膠材料，可防止導(dǎo)管結(jié)構(gòu)塌陷，并作為促神經(jīng)再生的種子細(xì)胞和生長因子的載體。這種復(fù)合功能化的神經(jīng)組織工程管狀支架，結(jié)合電刺激進(jìn)行細(xì)胞功能（如粘附、增殖、遷移和分化）的調(diào)節(jié)，可有效促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)。

上述發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種神經(jīng)組織工程導(dǎo)電管狀支架，其特征在于：該支架由導(dǎo)電纖維管和導(dǎo)電性水凝膠填充材料構(gòu)成；導(dǎo)電納米纖維管由內(nèi)外兩層纖維膜復(fù)合而成，即管外層為非導(dǎo)電無紡排布纖維膜，管內(nèi)層為沿導(dǎo)管軸向取向的平行排布導(dǎo)電纖維膜；填充材料由天然大分子水凝膠和負(fù)載生長因子的導(dǎo)電納米管復(fù)合而成。

所述的非導(dǎo)電纖維膜，其材料為生物可降解脂肪族聚酯，可以是聚丙交酯、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯及它們的共聚物中的一種。

所述的導(dǎo)電纖維膜，其材料為導(dǎo)電性聚吡咯（ppy）與生物可降解脂肪族聚酯的共混復(fù)合物。

所述的天然大分子水凝膠選自海藻酸鈉或透明質(zhì)酸鈉中的一種。

所述的導(dǎo)電納米管為ppy納米管，直徑為300-600nm，管壁厚80-130nm。

所述的促神經(jīng)再生的生長因子可以是神經(jīng)生長因子（ngf）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bfgf）中的一種或兩種。

所述的促神經(jīng)生長的種子細(xì)胞可以是雪旺細(xì)胞、髓鞘細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種。

本發(fā)明還提供了一種神經(jīng)組織工程導(dǎo)電纖維管狀支架的制備方法，其步驟如下：

（1）將單體吡咯（py）、摻雜劑十二烷基苯磺酸（dbsa）采用去離子水溶解混合均勻后，加入引發(fā)劑過硫酸銨（aps），在0℃下引發(fā)py聚合，聚合完成后，產(chǎn)物分別用甲醇、水、丙酮清洗純化，干燥后重新溶解于氯仿（chcl3），過濾除去不可溶解部分后，將濾液旋蒸除去溶劑，得到干燥、可溶解的ppy。

（2）將步驟（1）制備的ppy，按一定重量比，與生物可降解脂肪族聚酯共同溶于氯仿與二甲基甲酰胺（dmf）混合溶液（體積比1:1）中，采用高速旋轉(zhuǎn)的金屬滾筒為接收裝置，通過靜電紡絲制備纖維高度平行取向的導(dǎo)電聚酯/ppy復(fù)合纖維膜。

（3）將步驟（2）制備的高度平行取向的聚酯/ppy復(fù)合纖維膜，采用多巴胺水溶液在室溫進(jìn)行表面改性后，固定在鋁箔上。

（4）將生物可降解脂肪族聚酯溶于三氟乙醇，采用步驟（3）固定有平行纖維膜的鋁箔為接收裝置，通過靜電紡絲，在其上直接堆積纖維無規(guī)排列的無紡聚酯纖維膜。

（5）將步驟（4）制備的雙層纖維膜，以平行纖維膜為內(nèi)層，垂直于纖維取向方向卷曲成管，得到雙層的纖維管體。

（6）將生物可降解脂肪族聚酯溶于三氟乙醇，采用鋁箔為接收裝置，通過靜電紡絲制備無紡聚酯納米纖維膜，將此納米纖維膜浸泡于py單體水溶液中，加入催化劑fecl3溶液，py聚合并沉積在聚酯納米纖維上，然后用氯仿浸泡該ppy/聚酯復(fù)合納米纖維，溶解去除聚酯、干燥后得到導(dǎo)電的ppy納米管。

（7）將步驟(6）制備的導(dǎo)電ppy納米管采用多巴胺水溶液改性、干燥、研磨、滅菌后，分散浸漬于經(jīng)過濾除菌的生長因子水溶液中，通過納米管的吸附作用來負(fù)載生長因子。

（8）配置海藻酸鈉或透明質(zhì)酸鈉的水溶液，向其中加入一定密度的種子細(xì)胞懸液，并同時加入步驟（7）制備的負(fù)載生長因子的ppy納米管，得到混合液a，將該混合液a從步驟（5）制備的納米纖維管體一端注射，海藻酸鈉或透明質(zhì)酸鈉與培養(yǎng)基中的鈣或鎂離子作用后，形成凝膠。

所述制備步驟（1）中，優(yōu)化的摻雜劑比例為0.5（摩爾比dbsa:ppy），優(yōu)化的單體與催化劑的摩爾比為7，在0℃下優(yōu)化的聚合時間為8h。

所述制備步驟（2）中，優(yōu)化的ppy與生物可降解脂肪族聚酯的重量比為1:10，所配置混合溶液的優(yōu)選質(zhì)量體積百分濃度為20%。

所述制備步驟（2）中，高速旋轉(zhuǎn)的金屬滾筒，優(yōu)選的表面線速度范圍為12.5m/s-20m/s，紡絲時間不小于10h，獲得厚度不低于60um的高度取向平行纖維膜。

所述制備步驟（2）和步驟（6）中使用的生物可降解脂肪族聚酯，可以是相同的，也可以是不同的。

所述步驟（6）中制備的ppy/聚酯復(fù)合納米纖維，是一種以聚酯纖維為芯、以ppy為殼的核殼結(jié)構(gòu)納米纖維，經(jīng)氯仿溶解去除芯部的聚酯纖維后，得到中空的ppy納米管。

所述步驟（3）和所述步驟（7）中，聚酯/ppy復(fù)合纖維和ppy納米管改性所采用的多巴胺水溶液，其優(yōu)化的多巴胺溶液濃度為2mg/ml，溶液ph值為8.5，改性反應(yīng)時間為24h。

所述步驟（7）中，ppy納米管可分別負(fù)載不同的生長因子，也可同時負(fù)載兩種生長因子。

發(fā)明效果

本發(fā)明為神經(jīng)再生修復(fù)提供的一種具有導(dǎo)電性的纖維管狀支架，其特征是具有可設(shè)計性和多功能性。該纖維管狀支架壁具有的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使支架具有通透性，利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的擴(kuò)散；纖維管狀支架的管壁為雙層結(jié)構(gòu)，外層的無紡纖維膜，纖維堆積密度高，可阻隔外界纖維組織進(jìn)入管內(nèi)生長，影響神經(jīng)修復(fù)，內(nèi)層的導(dǎo)電平行纖維膜，具有平行于導(dǎo)管延展方向的軸向拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，利于神經(jīng)軸突和種子細(xì)胞的取向生長，同時，內(nèi)層纖維膜所具有的導(dǎo)電特性，在電場的刺激下，能夠更加促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖與分化，有利于神經(jīng)突的生長與延伸。纖維管狀支架的雙層結(jié)構(gòu)管壁，它們所應(yīng)用的生物可降解脂肪族聚酯，可以是相同的，也可以是不同的，由此可根據(jù)神經(jīng)再生對支架完整度保留時間的需要，控制支架管壁內(nèi)外層具有一致的降解速率或由內(nèi)到外降解速率降低的梯度。

本發(fā)明的導(dǎo)電性纖維管狀支架內(nèi)部填充的含ppy納米管的導(dǎo)電凝膠材料，其中，ppy納米管的功能一是作為生長因子的控釋載體，功能二是賦予凝膠材料更優(yōu)異的導(dǎo)電性，功能三是對水凝膠有一定的增強(qiáng)效果；海藻酸鈉或透明質(zhì)酸鈉水凝膠的功能是作為種子細(xì)胞和負(fù)載生長因子的ppy納米管的載體，通過生長因子的持續(xù)釋放，為神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞提供更好的增殖與分化微環(huán)境。此外，導(dǎo)電性纖維管狀支架內(nèi)部填充的含ppy納米管的導(dǎo)電凝膠材料，還能夠起到支撐柔軟的纖維管狀支架的作用，以防止導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的塌陷，獲得好的神經(jīng)再生修復(fù)效果。

以下結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于以下這些實例，在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

附圖說明：

圖1無規(guī)排列的無紡聚（丙交酯-乙交酯）共聚物（plga）纖維的sem圖。

圖2高度取向的平行排布的plga/ppy復(fù)合纖維的sem圖。

圖3ppy納米管的tem圖。

具體實施方式：

實施例1

（1）將4gpy和10gdbsa溶解于100ml去離子水，置于冰浴中，機(jī)械攪拌下，向其中逐滴加入預(yù)冷的aps水溶液[20%（w/v）]10ml，在機(jī)械攪拌下在py/dbsa溶液中引發(fā)py聚合，反應(yīng)溫度控制在0℃，8h后加入過量甲醇使反應(yīng)終止，離心收集黑色沉淀物，分別用去離子水、甲醇、丙酮洗滌，直至液體變?yōu)闊o色透明。將黑色固體產(chǎn)物溶于氯仿、過濾除去不溶物、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，制備得到可溶性ppy。

（2）將2gplga7525(丙交酯含量75mol%，分子量10萬)溶于5.5ml氯仿，將0.2g步驟（1）制備的ppy溶于5.5mldmf，兩者等比例混合后得到質(zhì)量體積百分比濃度為20%的混合溶液，以高速旋轉(zhuǎn)（表面線速度16.7m/s）的金屬滾筒為接收裝置,靜電紡絲制備平行的plga/ppy復(fù)合纖維膜a，其中plga7525與ppy的重量比為10。紡絲參數(shù)為：接收距離20cm，流速0.4ml/h，電壓15kv，滾筒轉(zhuǎn)速1500rpm。

（3）將0.6g多巴胺鹽酸鹽溶解于300ml去離子水，用tris調(diào)節(jié)水溶液ph值為8.5，將步驟（2）制備的高度平行取向的聚酯/ppy復(fù)合纖維膜，浸泡在多巴胺水溶液中，室溫下振蕩反應(yīng)處理24h。取出后用去離子水清洗真空干燥后，固定在鋁箔上。

（4）將2gplga7525溶于10ml的三氟乙醇中，得到濃度為20%的紡絲液，采用步驟（3）固定有平行纖維膜a的鋁箔為接收裝置，通過靜電紡絲在其上直接堆積纖維無規(guī)排列的無紡plga7525纖維膜，得到雙層纖維膜b。紡絲參數(shù)為：接收距離20cm，流速0.6ml/h，電壓18kv。

（5）將步驟（4）制備的雙層纖維膜b，以平行纖維膜為內(nèi)層，垂直于纖維取向方向卷曲成管，縫合固定并運(yùn)用紫外滅菌得到雙層的纖維管體。管體長度10-60mm,內(nèi)徑為0.5-10mm,壁厚為0.1-0.3mm。

（6）采用鋁箔為接收裝置，對步驟（4）中的plga7525溶液進(jìn)行靜電紡絲，紡絲參數(shù)同步驟（4），得到無紡納米纖維膜c。配置濃度均為14mmol?l^-1的py和對甲苯磺酸鈉混合水溶液（摩爾比為1:1）。將100mm×70mm大小纖維膜c浸泡于100ml上述混合溶液中，超聲處理30s,0℃孵化1h后,加入50ml預(yù)冷的濃度為38mmol?l^-1氯化鐵（fecl3）水溶液，0℃下振蕩聚合10h。將膜取出用去離子水清洗，然后用氯仿浸泡48h,取出干燥得到導(dǎo)電的ppy納米管，直徑為300-600nm，管壁厚80-130nm。

（7）將步驟(6）制備的導(dǎo)電ppy納米管采用步驟（3）中多巴胺水溶液改性方法處理，干燥后充分研磨并紫外滅菌。將0.01mgngf溶解在10ml去離子水中，過濾除菌，將滅菌后的0.1gppy納米管分散浸漬于促神經(jīng)生長因子水溶液中，通過納米管的吸附作用來負(fù)載生長因子。

（8）配置濃度為6%（w/v）透明質(zhì)酸鈉的水溶液，過濾除菌后加入步驟（7）制備的負(fù)載生長因子的ppy納米管，加入含鈣、鎂離子的hanks平衡鹽溶液（cellgro公司），混合均勻使?jié)舛冗_(dá)到5%，得到混合液a，將該混合液a從步驟（5）制備的納米纖維管體一端注射，透明質(zhì)酸鈉與平衡鹽溶液中的鈣或鎂離子作用后，形成凝膠，得到一種負(fù)載ngf的神經(jīng)組織工程導(dǎo)電纖維管狀支架。

實施例2：

采用與實施例1相同的方法制備填充導(dǎo)電水凝膠的導(dǎo)電纖維管狀支架，除管狀支架的外層生物可降解聚酯無紡纖維膜，采用降解速度慢于plga7525的聚左旋乳酸（plla，分子量10萬)來制備，由此得到纖維管壁從內(nèi)到外具有一定降解梯度的一種負(fù)載ngf的神經(jīng)組織工程導(dǎo)電纖維管狀支架。

步驟（4）操作如下，其他操作步驟同實施例1：

將1gplla溶于10ml三氟乙醇，得到質(zhì)量體積百分比濃度為10%的粘稠溶液，將固定有平行纖維膜a的鋁箔為接收裝置，通過靜電紡絲在其上直接堆積纖維無規(guī)排列的plla纖維膜得到雙層紡絲纖維膜c。紡絲參數(shù)為：接收距離20cm，流速0.4ml/h，電壓15kv。

實施例3：

采用與實施例1相同的方法制備填充導(dǎo)電水凝膠的導(dǎo)電纖維管狀支架，除步驟（7）中所配置的生長因子水溶液為同時含有ngf和bfgf的溶液，由此得到一種同時負(fù)載兩種促神經(jīng)再生生長因子的神經(jīng)組織工程導(dǎo)電纖維管狀支架。

步驟（7）操作如下，其他操作步驟同實施例1：

將步驟(6）制備的導(dǎo)電ppy納米管采用步驟（3）中多巴胺水溶液改性方法處理，干燥后充分研磨并紫外滅菌。將0.01mgngf和0.01mgbfgf同時溶解于10ml去離子水，過濾除菌，將滅菌后的0.1gppy納米管分散浸漬于促神經(jīng)生長因子水溶液中，通過納米管的吸附作用來負(fù)載兩種生長因子。

實施例4：

采用與實施例1相同的方法制備填充導(dǎo)電水凝膠的導(dǎo)電纖維管狀支架，除在其內(nèi)部填充的水凝膠材料中負(fù)載雪旺細(xì)胞，由此得到一種同時負(fù)載促神經(jīng)再生的種子細(xì)胞和生長因子的神經(jīng)組織工程導(dǎo)電纖維管狀支架。

步驟（8）操作如下，其他操作步驟同實施例1：

選用生長狀態(tài)較好的雪旺細(xì)胞，配置濃度為200個/ml的細(xì)胞懸液。配置濃度為6%透明質(zhì)酸鈉的水溶液，過濾除菌后加入步驟（7）制備的負(fù)載生長因子的ppy納米管，加入細(xì)胞懸液混合均勻使透明質(zhì)酸鈉濃度達(dá)到5%，得到混合液b，將該混合液b從步驟（5）制備的納米纖維管體一端注射，透明質(zhì)酸鈉與培養(yǎng)基中的鈣或鎂離子作用后，形成凝膠，由此得到一種同時負(fù)載促神經(jīng)再生的種子細(xì)胞和生長因子的神經(jīng)組織工程導(dǎo)電纖維管狀支架。