本發(fā)明涉及一種防治牛支原體病的中藥復(fù)方噴鼻劑的制備方法。

背景技術(shù)：

牛支原體(mycoplasmabovis)是一種能夠?qū)е屡．a(chǎn)生各種疾病和高感染率的重要病原體。它可以導(dǎo)致牛發(fā)生肺炎、關(guān)節(jié)炎、久治不愈乳腺炎、結(jié)膜角膜炎、懷孕母牛流產(chǎn)、生殖器感染等疾病。癥狀為發(fā)燒、咳嗽、鼻孔流有鐵銹色鼻液、腹瀉、關(guān)節(jié)腫大、嚴(yán)重乳房炎、頭胎牛發(fā)生流產(chǎn)、死胎，新生犢牛在飼喂乳房炎奶牛的乳汁后，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)和蹄部腫大，行走困難，甚至無法站立等。牛支原體肺炎有傳染性，故影響集約化牛場(chǎng)的生產(chǎn)，且常常由于高病死率、治療昂貴以及病牛生長(zhǎng)緩慢而給奶牛養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)文獻(xiàn)記載歐洲每年因牛病損失的5.79億歐元中有1/3是由牛支原體引起的在英國(guó)，約有190萬頭?；加信Ｖгw肺炎，死亡可達(dá)15.7萬頭，經(jīng)濟(jì)損失超過5400萬英鎊，在這些呼吸道感染牛中，至少有1/4-1/3是由牛支原體引起的。在我國(guó)，1983年黎濟(jì)申首次報(bào)道了從乳房炎牛乳中分離得到牛支原體，此后僅少數(shù)臨床報(bào)道證實(shí)了牛支原體導(dǎo)致奶牛乳房炎；2008年湖北多地報(bào)道了牛支原體可導(dǎo)致牛傳染性支原體肺炎。

目前，牛支原體病的臨床處置主要以西藥防治為主，而長(zhǎng)期使用西藥不僅會(huì)產(chǎn)生許多副作用，損傷肝腎，同時(shí)處理炎癥時(shí)抗生素的使用也會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，而且藥物的殘留對(duì)食品安全及人類的健康也會(huì)產(chǎn)生不良影響。中草藥屬于純天然物質(zhì)，含有多種生物活性成分，具有疏通消導(dǎo)和降逆、健脾益氣、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，毒害作用小、環(huán)保等特點(diǎn)，并且利用中藥制劑防治牛支原體病屬于非抗生素療法，因此應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于防治牛支原體病傳統(tǒng)中藥驗(yàn)方的基礎(chǔ)上，提取中藥有效成分，進(jìn)一步離心、過濾、濃縮，制備出的一種主要具有牛支原體抑菌效果、治療牛支原體所引起肺炎，用藥安全、方便、低殘留與的特點(diǎn)的中藥復(fù)方噴鼻劑。

本發(fā)明的方案如下：一種防治牛支原體病的中藥復(fù)方噴鼻劑由苦參3份、魚腥草3份、大黃3份、黃柏3份、透骨草3份、胡黃連3份、花椒2份、黃連2份、丁香2份、甘草2份、連翹3份；所有藥材分別提取有效成分后混合提取物，分裝噴霧瓶制成。

采用本發(fā)明方法制備中藥復(fù)方噴鼻劑的有益效果是：

1、本發(fā)明的制劑為純中藥制劑，具無殘留、無公害、抑菌消炎等作用，可有效緩解由牛支原體引起的呼吸道癥狀，組方藥物療效確切。

2、現(xiàn)有的抗生素西藥治療方法在臨床上有一定的治療效果。但易引起菌株的耐藥性，還會(huì)造成藥物殘留，影響畜產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明的中藥復(fù)方噴鼻劑，純中藥配方，無殘留且不易耐藥。

3、治療效果：在實(shí)驗(yàn)室建立的牛支原體家兔感染模型上進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，噴鼻劑噴鼻給藥，0.5ml/kg體重，1次/天，連續(xù)給藥5天，治療效果顯著。藥物安全性檢測(cè)結(jié)果顯示，本藥物安全無毒。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：

1、各種中藥有效成分提?。?/p>

（1）苦參的提取：

首先將苦參粉碎至40目，然后將粉碎后的苦參放入藥材8倍量，體積濃度為65%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取3次，每次提取時(shí)間1.5h，提取溫度80℃，將三次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（2）魚腥草的提?。?/p>

首先將魚腥草粉碎至40目，然后將粉碎的魚腥草放入藥材20倍、體積濃度為70%的乙醇溶液中，采用超聲震蕩的方法提取，提取1~3次，每次提取時(shí)間為1.5h，提取溫度為55℃，功率為100w，然后將3次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（3）大黃的提?。?/p>

首先將大黃粉碎至40目，然后將粉碎后的大黃放入藥材10倍量，體積濃度為80%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取3次，每次提取時(shí)間1.5h，提取溫度80℃，將三次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（4）黃柏的提?。菏紫葘ⅫS柏切成厚度為2mm的薄片，然后將切片的黃柏放入藥材10倍量、體積濃度為75%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取3次，每次提取時(shí)間2h，提取溫度80℃，將3次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（5）透骨草的提?。?/p>

首先將透骨草粉碎至40目，然后將粉碎的透骨草放入藥材10倍、體積濃度為80%的乙醇溶液中，采用超聲震蕩的方法提取，提取3次，每次提取時(shí)間為2.5h，提取溫度為55℃，功率為100w，然后將3次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（6）胡黃連的提?。?/p>

首先將胡黃連粉碎至40目，然后將粉碎后的黃連放入藥材12倍量、體積濃度為65%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取1次，再放入藥材8倍量、體積濃度為60%的乙醇溶液中再提取一次，每次提取時(shí)間3h，提取溫度80℃，然后將2次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（7）花椒的提?。?/p>

首先將干燥花椒（去仁、去梗），然后將干燥的花椒放入藥材10倍量、體積濃度為90%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取2次，每次提取時(shí)間3h，提取溫度80℃，然后將2次提取的溶液混合、單層濾紙加壓抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（8）黃連的提?。?/p>

首先將黃連粉碎至40目，然后將粉碎后的黃連放入藥材10倍量、體積濃度為60%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取2次，每次提取時(shí)間2h，提取溫度80℃，然后將2次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（9）丁香的提?。?/p>

首先將丁香粉碎至40目，然后將粉碎的甘草放入藥材14倍、體積濃度為60%的乙醇溶液中，采用超聲震蕩的方法提取，提取3次，每次提取時(shí)間為60min，提取溫度為60℃，功率為180w，然后將3次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（10）甘草的提?。?/p>

首先將甘草粉碎至40目，然后將粉碎的甘草放入藥材10倍、體積濃度為75%的乙醇溶液中，采用超聲震蕩的方法提取，提取3次，每次提取時(shí)間為40min，提取溫度為45℃，功率為200w，然后將3次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

（11）連翹的提?。?/p>

首先將連翹粉碎至40目，然后將粉碎后的連翹放入藥材10倍量，體積濃度為80%的乙醇溶液中，采用回流提取法提取4次，每次提取時(shí)間2h，提取溫度60℃，將4次提取的溶液混合、單層濾紙真空抽濾后收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的流浸膏，即原藥材1g制成1ml的流浸膏；

2、配置復(fù)方中藥：

將從所有藥材中分別提取到的有效成分混合，在常溫下靜置18-24小時(shí)后，以3000-3500r/min離心25-30min然后收集上清液，棄去殘?jiān)?，再將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成1:1的混合液，即原藥材1g制成1ml的混合溶液。

3、噴鼻劑的制備：

靜置、過濾、離心取上清后，溶液無殘?jiān)?、均勻、透亮，含有糖成分所以有一定粘性，可以附著在鼻腔、氣管、支氣管及肺泡?nèi)部以釋放有效成分達(dá)到治療效果。將藥液分裝于噴霧瓶中，即得到含量為1g原藥/ml溶劑的中藥復(fù)方噴鼻劑。

4、體外抑菌試驗(yàn)：

使用中藥提取物及復(fù)方中藥溶液，針對(duì)牛支原體致病菌株進(jìn)行藥敏片法體外抑菌實(shí)驗(yàn)：常用治療西藥抗牛支原體藥物抑菌圈直徑為四環(huán)素d=31.17±1.04mm、泰秒菌素d=47.17±1.61mm、環(huán)丙沙星d=21.50±2.60mm，自制中藥液藥敏片（含藥量20mg/片）抑菌圈直徑：魚腥草d=26.67±0.89mm、黃連d=50.00±1.33mm、黃柏d==24.83±1.89mm、透骨草d=21.33±0.76mm、大黃d=26.33±0.89mm、胡黃連d=24.50±0.33mm、苦參d=14.67±3.01mm、甘草d=20.83±0.56mm、丁香d=20.50±3.04mm、花椒d=17.17±0.76mm、連翹d=25.50±2.04mm、復(fù)方制劑d=28.56±1.33mm。與治療常用西藥抑菌圈直徑結(jié)果進(jìn)行比較，證明中藥組方各成分以及混合液均有較好的抑制牛支原體生長(zhǎng)的效果。

5、臨床治療效果：

在制造的牛支原體感染家兔模型上進(jìn)行治療，待體溫升高，出現(xiàn)一定臨床癥狀后，通過噴鼻給藥，藥量0.5ml/kg，1次/天，連續(xù)給藥五天。治療第二天體溫開始下降，第三天即＜35℃回歸正常范圍；剖檢情況可知，感染牛支原體20d未治療家兔的肺臟有明顯紅色肉變、出血點(diǎn)密集、輕微皺縮現(xiàn)象，氣管環(huán)出血，淋巴結(jié)腫大粘連且內(nèi)有膿液。而感染20d經(jīng)過治療的家兔肺部出血點(diǎn)輕微、略微水腫、無其他病變，氣管環(huán)出血不明顯，淋巴結(jié)輕微腫大無膿液；病理組織切片結(jié)果可知，感染未治療組組織切片結(jié)果出現(xiàn)肺組織淤血、肺組織出血、肺泡塌陷、小血管淤血、肺泡隔增厚等，而治療組則未見明顯出血，也無纖維素性滲出、淤血及水腫、肺泡隔清晰；所以該中藥復(fù)方制劑有較好的臨床治療效果。

6、安全性檢測(cè)結(jié)果：

在spf小鼠上進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)安全性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腹腔注射急性毒性試驗(yàn)，小鼠的最大耐受量ld0=20000mg/kg，最小致死量mld=25940mg/kg，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算公式：ld50=lg-1[xm-i(∑p-0.5)]，式中xm為最大劑量的對(duì)數(shù)，p為各組動(dòng)物的死亡率，∑p為各組動(dòng)物死亡率總和，i為組間距（相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值），計(jì)算出ld50=41438mg/kg。根據(jù)公式slogld50=d，式中d為對(duì)數(shù)組距，p為各組死亡率，n為每組動(dòng)物數(shù)，得出標(biāo)準(zhǔn)誤slogld50=0.01067，ld50的95%的可信限范圍為39490.26～43482.05mg/kg。根據(jù)毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，ld50＞10000mg/kg屬于無毒性物質(zhì)，本試驗(yàn)中復(fù)方中藥片對(duì)小鼠安全無毒。