人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)(hIgE Fc)片段蛋白以及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)(hIgE Fc)片段蛋白及其生產(chǎn)方法和用途。所述的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)(hIgE Fc)片段蛋白，其能夠結(jié)合于FcεRI分子上的IgE的結(jié)合位點。本發(fā)明提供的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)(hIgE Fc)片段蛋白能夠用于過敏疾病，如過敏哮喘、鼻炎等。
【專利說明】人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白以及制備 方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及用于治療過敏疾病的人免疫球蛋白ε重鏈 恒定區(qū)OiIgE Fe)片段蛋白以及制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 過敏疾病也稱變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬于常見疾病，發(fā)病時還可引起多種并發(fā)癥。常見 過敏疾病主要有過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性休克等。隨著全球范圍內(nèi)的空氣和環(huán)境 的惡化,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。過敏疾病的發(fā)生主要由于機體內(nèi)的過敏反應(yīng)細(xì)胞（血 液中的嗜堿性粒細(xì)胞和組織間隙中的肥大細(xì)胞）受抗原性物質(zhì)（過敏原），如花粉顆粒、塵 螨、食物（牛奶、雞蛋、蝦蟹等）、藥物（青霉素、磺胺等）、寄生蟲等刺激后，釋放大量的組胺 等血管活性和促炎介質(zhì)，這些介質(zhì)作用于人體不同組織和器官，引起相應(yīng)的臨床癥狀，如作 用于血管引起血管舒張并使血管通透性增加，作用于支氣管引起支氣管痙攣。參見文獻(xiàn)， Fang Cj Corrigan CJj Ying S.The treatment targets of asthma:from laboratory to clinic. Inflammation Allergy-Drug Targets 2008, 7:119-128并如圖 I所不，當(dāng)體質(zhì)差的 人，或者說易過敏人群，首先接觸到過敏原時，抗原遞呈細(xì)胞通過抗原的遞呈活化原態(tài)輔助 T細(xì)胞（ThO)，ThO細(xì)胞進(jìn)一步分化成Thl，Th2, Thl7和TReg細(xì)胞，其中，Th2細(xì)胞釋放IL-4 和IL-13,并在B細(xì)胞生產(chǎn)過敏原特異的IgE抗體中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Neurath MF，F(xiàn)inotto S，Glimcher LH. The role of Thl/Th2 polarization in mucosal immunity. Nat Med 2002, 8:567-573.)。IgE抗體是過敏反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵分子。
[0003] 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種IgE受體，高親和力受體Fc ε RI (Ravetch JV. Fe receptors. Curr Opin Immunol 1997, 9:121-125.)和低親和力受體Fee RII (CD23)(Lemieux GAjBlumenkron FjYeung NjZhou PjWilliams JjGrammer ACjPetrovich RjLipsky PEjMoss ML, Werb Z. The low affinity IgE receptor (CD23) is cleaved by the metalloproteinase ADAM10.J Biol Chem 2007,282:14836-14844·)。高親和力受體 FceRI 表達(dá)在肥大細(xì) 胞、嗜堿性粒細(xì)胞的表面，屬于免疫球蛋白超家族，為四聚體蛋白，含有α鏈、β鏈和 通過二硫鍵相連的兩個Y鏈。α鏈為配基結(jié)合鏈，其胞外功能區(qū)能與IgE重鏈恒定區(qū) 第三域的末端部分相作用（Hakimi J，Seals C，Kondas JA，Pettine L，Danho W，Kochan J. The alpha subunit of the human IgE receptor (Fe ε RI) is sufficient for high affinity IgE binding. J Biol Chem 1990,265:22079-22081, Blank UjRa CSjKinet JP.Characterization of truncated alpha chain products from human, rat, and mouse high affinity receptor for immunoglobulin E. J Biol Chem 1991,266:2639-2646, Riske F，Hakimi J，Mallamaci M，Griffin M，Pilson B，Tobkes N，Lin P，Danho Wj Kochan Jj Chizzonite R. High affinity human IgE receptor(Fe epsilon RI). Analysis of functional domains of the alpha-subunit with monoclonal antibodies. J Biol Chem 1991,266:11245-11251.)。β 鏈和 Y 鏈可介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Shirakawa T，Li A，Dubowitz MjDekker JWjShaw AEjFaux JAjRa CjCookson WjHopkin JM. Association between atopy and variants of the β subunit of the high - affinity immunoglobulin E receptor. Nat Genet 1994,7:125-130.)。其中，β鏈跨膜4次，其N端和C端均位于胞漿內(nèi)；Y鏈為跨膜 蛋白，胞外的N段經(jīng)二硫鍵相連成二聚體。β鏈和γ鏈胞漿內(nèi)的C端末端分別含有免疫 受體酪氨酸活化基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，與受 體的信號傳導(dǎo)相關(guān)?，F(xiàn)已經(jīng)鑒定出人IgE與人Fe ε RI相互作用的特異性氨基酸Arg-408、 361-411、1^8-415、6111-452、六找-465 和]\161：-469(?代8七&1^3]1161(18 1?，0'〇〇11116111^1^]^ S,Porter J,Gorman C,Jardieu P.The binding site on human immunoglobulin E for its high affinity receptor. J Biol Chem 1994,269:26368-26373·)。IgE 與 FceRI 的作用具有非常高的特異性，結(jié)合常數(shù)約為l〇-l〇mol/L(Kinet JP. THE HIGH-AFFINITY IgE RECEPTOR (Fe ε RI): From Physiology to Pathology.Annu Rev Immunol 1999, 17:931-972〇Galli SJjKalesnikoff J1Grimbaldeston MA1Piliponsky AM1Williams CM, Tsai M. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells:recent advances. Annu Rev Immunol 20〇5, 23: 7^:9-786.)。低親和力受體 Fe ε RII (CD23)表達(dá)在 炎癥細(xì)胞的表面，包括嗜酸粒細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、血小板和氣道平滑肌細(xì)胞的表 面。Fe eRII不屬于免疫球蛋白超家族，是氨基端在胞內(nèi)的跨膜蛋白?，F(xiàn)已知道有兩種形 式Fc ε RII，分別稱為Fc ε RIIa和Fc ε Rllb。它們的胞外部分相同，胞內(nèi)N端存在差異。 Fc ε RIIa通常表達(dá)在B細(xì)胞的表面，F(xiàn)c ε RIIb則表達(dá)在T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和經(jīng)IL-4 誘導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞表面。Fc ε RII與IgE抗體的生成有關(guān)，在過敏性疾病的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮 作用。
[0004] IgE通過與高親和力受體Fc ε RI作用，在一系列急性和慢性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作 用，如哮喘、過敏性鼻炎、遺傳性過敏性皮炎和嚴(yán)重的食物過敏、風(fēng)疹、血管性水腫和過敏休 克等。當(dāng)個體再次接觸過敏原時，兩個IgE分子識別同一個過敏原，導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞和肥 大細(xì)胞表面的Fc ε RI受體交聯(lián)，首先激活酪氨酸激酶Lyn，然后Fc ε RI受體的亞單位β 和Y鏈上的ITAM磷酸化，促使脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase，SYK)活化并聚集 Fe ε RI受體的磷酸化亞單位，啟動下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，包括脫顆粒作用釋放介體、絲裂原 活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase)的活化以及憐脂酶（Phospholipase) A2 的活化（Kraft S, Novak N. Fe receptors as determinants of allergic reactions. Trends Immunol 2006, 27:88-95.)。因此，F(xiàn)e ε RI受體介導(dǎo)了 I型過敏反應(yīng)的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)。血管活性和促炎性介體的釋放對急性和晚期的過敏反應(yīng)有作用，表現(xiàn)出臨床過敏癥狀， 如噴嚏、瘙癢癥和支氣管痙攣等。
[0005] 哮喘是最典型的過敏性疾病，在工業(yè)化國家是最常見的慢性疾病。預(yù)測在今后的 10年中，發(fā)生率將會持續(xù)增加。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2005年全世界有3億人口患有哮 喘，其中22. 5萬人死于哮喘。在我國至少有2000萬哮喘患者，但只有不足5%的哮喘患者 接受過規(guī)范化的治療。哮喘已對人類的健康、生活和學(xué)習(xí)造成嚴(yán)重的危害，隨著人民健康意 識的增強，就診人數(shù)的增加，哮喘類藥物的市場潛力巨大。
[0006] 目前哮喘的治療藥物有以下幾種：
[0007] 哮喘屬I型超敏反應(yīng)性疾病，90%以上的病變都是由IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)導(dǎo)致。哮 喘的藥物治療主要有兩種，逆轉(zhuǎn)或阻止氣道炎癥和逆轉(zhuǎn)或阻止支氣管平滑肌肉的緊縮。但 這兩種治療方式均是著眼于過敏反應(yīng)發(fā)生（即炎性介質(zhì)釋放后）的炎癥的治療，而不能解 決炎癥發(fā)生的根源。吸入性的皮質(zhì)類固醇（Inhaled corticosteroids, ICS)和速效、長效 的腎上腺素受體的激動劑（SABAS和LABAS)是治療哮喘的主要藥物，越來越多地應(yīng)用于具 有持續(xù)癥狀的哮喘病人，形成了標(biāo)準(zhǔn)的臨床治療方案。但是，依然有5?8%的哮喘病人對 大劑量的皮質(zhì)類固醇和腎上腺素受體激動劑的治療無效，這一類哮喘稱為慢性嚴(yán)重哮喘或 者嚴(yán)重惡化哮喘。嚴(yán)重過敏哮喘病人占哮喘病人的5%左右，對他們尚缺少有效的治療手 段。
[0008] 1)皮質(zhì)類固醇
[0009] 皮質(zhì)類固醇通過抑制細(xì)胞因子、催化因子和黏附分子的表達(dá)，壓制Th2細(xì)胞介導(dǎo) 的哮喘氣道中的炎癥反應(yīng)（Barnes PJ, Chung KF, Page CP. Inflammatory mediators of asthma:an update. Pharmacol Rev 1998,50:515_596.)〇
[0010] 皮質(zhì)類固醇能夠明顯減少氣道炎癥和超反應(yīng)性，改善肺功能，減輕癥狀，有效 阻止或減少急性哮喘惡化的發(fā)生。但是，皮質(zhì)類固醇不涉及到疾病發(fā)生的根源，即使 從兒童時期開始治療也不能夠治愈（Bisgaard H，Hermansen MN，Loland L, Halkjaer LB, Buchvald F. Intermittent inhaled corticosteroids in infants with episodic wheezing. New Engl J Med 2006, 354:1998-2005. Guilbert Tff1Morgan WJ1Zeiger RS, Mauger DT, Boehmer SJ, Szefler SJ, Bacharier LB, Lemanske Jr RF, Strunk RC, Allen DB. Long-term inhaled corticosteroids in preschool children at high risk for asthma. New Engl J Med 2006,354:1985-1997.)，不影響疾病的過程，對病毒感染導(dǎo)致的 哮喘惡化沒有效果（Harrison TW, Oborne J, Newton S, Tattersfield AE. Doubling the dose of inhaled corticosteroid to prevent asthma exacerbations!randomised controlled trial. Lancet 2004, 363:271-275·)，對吸煙哮喘病人也沒有作用（Chaudhuri R, Livingston E, McMahon AD, Thomson L, Borland W, Thomson NC. Cigarette smoking impairs the therapeutic response to oral corticosteroids in chronic asthma. Am J Resp Crit Care 2003,168:1308-1311.)。并且，大劑量地系統(tǒng)性吸收皮質(zhì)類固醇，可導(dǎo) 致局部性和系統(tǒng)性的副作用，如發(fā)聲障礙、聲音撕啞、骨質(zhì)疏松和壓制丘腦-腦下垂體-腎 上腺軸的作用。
[0011] 對皮質(zhì)類固醇治療無效的嚴(yán)重哮喘的治療更具有挑戰(zhàn)性，也更為緊迫。研究發(fā)現(xiàn)， 皮質(zhì)類固醇治療無效的哮喘病人，糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)構(gòu)是正常的。但是，也許環(huán)境刺激因 子改變了其功能，使得皮質(zhì)激素受體失去了轉(zhuǎn)錄抑制作用。分子修飾也影響糖皮質(zhì)激素受 體作用，例如糖皮質(zhì)激素受體的磷酸化影響其與皮質(zhì)類固醇的親和力和核轉(zhuǎn)座的能力，靶 基因上靠近糖皮質(zhì)激素受體作用位點附近的組織蛋白乙?；灿绊懫渥饔?。
[0012] 2) β腎上腺素受體的激動劑
[0013] 速效腎上腺素受體激動劑，如沙丁胺醇和特布他林，是最有效的支氣管擴張劑，吸 入后可以快速地緩解哮喘癥狀。當(dāng)激動劑與β腎上腺素受體結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白刺激 腺苷酸環(huán)化酶，增加 cAMP的生成，從而激活蛋白激酶Α。蛋白激酶A促使肌球蛋白輕鏈激酶 磷酸化和打開Ca2+依賴的K離子通道，調(diào)節(jié)平滑肌的松馳，減輕哮喘中的支氣管收縮。吸入 式的長效腺素受體激動劑，如福莫特羅和沙美特羅，作為補充的治療手段應(yīng)用于皮質(zhì)類固 醇激素?zé)o法控制的哮喘治療，可以維持支氣管舒張達(dá)12h(Palmqvist M, Persson G, Lazer L，Rosenborg J，Larsson P，Lotvall J. Inhaled dry-powder formoterol and salmeterol in asthmatic patients:onset of action, duration of effect and potency. Eur Respir J 1997, 10:2484-2489. Usmani OSjIto KjManeechotesuwan KjIto MjJohnson MjBarnes PJj Adcock IM. Glucocorticoid receptor nuclear translocation in airway cells after inhaled combination therapy. Am J Resp Crit Care 2005, 172:704-712. )〇 長效腺素受體激動劑可能會掩蓋惡化中的炎癥而不宜單獨使用，以免耽誤治療。因 此，對于這些藥物是好處大于壞處還是壞處大于好處一直存在爭論（Andrew Mcivor R,Pizzichini E,Turner MO, Hussack P, Hargreave FE, Sears MR. Potential masking effects of salmeterol on airway inflammation in asthma. Am J Resp Crit Care 1998,158:924-930.)。
[0014] 速效的β腎上腺素受體激動劑的副作用相對較小，因為他們具有較高的特異性， 并且是經(jīng)皮給藥。在哮喘病人的管理中，反復(fù)使用慢性的β腎上腺素受體的激動劑可能導(dǎo) 致副作用，這些副作用包括肌肉顫抖和痙攣、心臟病、增加哮喘的病死率和發(fā)生率。臨床數(shù) 據(jù)提示，有規(guī)律地使用長效的β腎上腺素受體的激動劑應(yīng)當(dāng)同時使用抗炎藥物，如糖皮質(zhì) 激素。吸入或口服糖皮質(zhì)激素不僅可以減少哮喘死亡的危險，也可抵消單獨使用長效β腎 上腺素受體激動劑帶來的危險。
[0015] 3)磷酸二酯酶（PDE)抑制劑
[0016] 茶堿對磷酸二酯酶活性具有非選擇性的抑制作用，同時也能拮抗腺苷受體的活 性。曾經(jīng)認(rèn)為低劑量的茶堿具有一定的抗炎作用，然而缺少證據(jù)支持。茶堿作為支氣管擴 張劑已經(jīng)應(yīng)用于治療哮喘70多年。但是，在治療哮喘的有效劑量下，也能導(dǎo)致心臟和中央 神經(jīng)系統(tǒng)損傷的副作用，因此，茶堿已經(jīng)退出了哮喘的主流藥物。
[0017] 4)白三烯抑制劑
[0018] 在不同的免疫和炎癥刺激響應(yīng)中，花生四烯酸合成的白三烯是強大的脂介體。大 部分已知的白三烯通過白三烯受體I發(fā)揮作用。白三烯（LTC4、LTD4和LTE4)是功能強 大的氣道平滑肌收縮的激動劑。LTD4引起支氣管收縮的能力比組胺強100多倍。接觸 到過敏原后，白三烯釋放到哮喘氣道中，介導(dǎo)一系列的哮喘反應(yīng)，包括水腫、過量黏液分 泌和支氣管超反應(yīng)。他們對嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、黏液 腺和神經(jīng)有廣泛的作用，并增強了氣道炎癥和重構(gòu)的病理過程（Simons F. Comparative pharmacology of Hlantihistamines: clinical relevance. Am J Med 2002,113:38-46. Samuelsson B. Leukotrienes:mediators of immediate hypersensitivity reactions and inflammation. Science 1983, 220:568-575.)。體外試驗發(fā)現(xiàn)，高劑量皮質(zhì)類固醇抑制 磷酯酶依賴的花生四烯酸從細(xì)胞膜上的釋放，從而阻止白三烯的合成。但在體內(nèi)，皮質(zhì)類 固醇對白三烯的生物合成和作用均沒有影響（Gyllfors P，Dahl6n SE, Kumlin M, Larsson K,Dahlen B.Bronchial responsiveness to leukotriene D4is resistant to inhaled fluticasone propionate. J Allergy Clin Tmmun 2006, 118:78-83.)。其他的白三烯 合成抑制劑也有研究報道，但仍處于臨床開發(fā)中（Kemp JP. Recent advances in the management of asthma using leukotriene modifiers. Am J Resp Med 2003,2:139-156.)〇 有人認(rèn)為，白三烯抑制劑對哮喘的控制與皮質(zhì)類固醇相比，作用較小并且昂貴，僅對 那些白三烯釋放導(dǎo)致的過敏炎癥的病人起作用（Polosa R. Critical appraisal of antileukotriene use in asthma management. Curr Opin Pulm Med 2007,13:24-30.)〇當(dāng) 前，白三烯受體的拮抗劑，如孟魯司特、普魯司特、扎魯司特，已作為皮質(zhì)類固醇治療的補充 藥物（Nayak A, Langdon RB. Montelukast in the treatment of allergic rhinitis:an evidence-based review. Drugs 2007,67:887-901·)。但是，很少有醫(yī)生單獨使用白 三烯受體的拮抗劑（Friedmann PS，Palmer R，Tan E，0gboli M，Barclay G, Hotchkiss K, Berth-Jones J. A double-blind, placebo-controlled trial of montelukast in adult atopic eczema. Clin Exp Allergy 2007,37:1536-1540·)。
[0019] 5)抗IgE單克隆抗體
[0020] Omalizumab (商品名Xolair)是Genentech公司于2003年6月上市的人源化單 克隆抗體，是目前唯一獲得美國FDA批準(zhǔn)用于治療哮喘的蛋白藥物。在過敏炎癥和過敏哮 喘中，IgE是最初的一個介導(dǎo)因子。Xolair特異性抗IgE Fc片段上與Fe eRI結(jié)合的表 位，可阻止過敏原-IgE復(fù)合體與Fc ε RI的結(jié)合（Busse W, Corren J, Lanier BQ, McAlary M, Fowler-Taylor A, Cioppa GD, van As A, Gupta N. Omalizumab, anti-IgE recombinant humanized monoclonal antibody, for the treatment of severe allergic asthma. J Allergy Clin Tmmun 2001, 108:184-190.)，其過程如圖 2 所不。同時，Xolair 也可與血 液中IgE結(jié)合形成可溶的免疫復(fù)合體，并最終在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中清除。因此，Xolair給藥 之后，血清中游離的IgE水平快速降低。IgE的下降進(jìn)而下調(diào)嗜堿性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞 和單核細(xì)胞上的Fc ε RI的表達(dá)，也減少IL-13、B淋巴細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞在外周血中的含 量和哮喘病人組織中的嗜酸性粒細(xì)胞。XoIair可以減少重復(fù)過敏原刺激誘導(dǎo)的晚期皮膚 過敏反應(yīng)，并對早期過敏反應(yīng)的作用明顯。III期臨床實驗中，觀察到Xolair可以減少哮 喘的惡化，也可以減少皮質(zhì)類固醇和速效腎上腺素受體激動劑的用量，同時改善哮喘病人 的肺功能，如呼氣流量和第一秒強制呼氣體積（FEVl)的峰值（Soler M，Matz JJownley R, Buhl R, 0'Brien J, Fox H, Thirlwell J, Gupta N, Della Cioppa G. The anti-IgE antibody omalizumab reduces exacerbations and steroid requirement in allergic asthmatics. Eur Resp J 2001,18:254-261.)〇
[0021] FDA批準(zhǔn)Xolair應(yīng)用于12歲及以上人群的中度到重度的持續(xù)哮喘病人的治療和 那些常年性的對空氣中過敏原，如花粉、草和塵螨敏感的病人。FDA推薦其作為二線治療手 段，應(yīng)用于類固醇治療沒有足夠療效的病人。
[0022] 上市以來，臨床專家和美國FDA注意到Xolair存在一些不足（Corren J, Casale T, Deniz Y, Ashby M. Omalizumab, a recombinant humanized anti-IgE antibody, reduces asthma-related emergency room visits and hospitalizations in patients with allergic asthma. J Allergy Clin Tmmun 2003, 111 :87-90.)。首先，Xolair 可導(dǎo)致人體 內(nèi)IgE水平降低。IgE在人體的抗腫瘤方面起著積極的作用，因此臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用 了 Xolair的病人中，腫瘤發(fā)生病例增加約一倍。其次，Xolair的使用中，有些病人產(chǎn)生可 能導(dǎo)致威脅生命的過敏反應(yīng)，這些不良反應(yīng)包括支氣管痙攣、血壓下降、呼吸困難、暈厥、喉 腫等。另外，以前使用沒有發(fā)生不良反應(yīng)的病人，不能排除在后續(xù)使用中依然發(fā)生過敏的 可能。在大約39, 500名使用過Xolair的病人中，過敏不良反應(yīng)的比例至少0. 1%，但是 Xolair導(dǎo)致過敏不良反應(yīng)的原因尚不清楚。雖然對Xolair的臨床應(yīng)用一直存在爭論，但是 在2008年Xolair在美國的銷售額依然達(dá)到了 5億多美元，說明臨床實踐中對新的治療哮 喘藥物的渴望。
[0023] 目前治療哮喘的新藥開發(fā)的方向如下：
[0024] 人們一直在嘗試尋找安全有效的哮喘治療藥物，除了基于傳統(tǒng)藥物的改良和優(yōu)化 夕卜，更多地把希望寄托新的治療靶點和生物藥物的開發(fā)上，目前處于臨床研究中的治療哮 喘的生物藥物達(dá)十多種，另有更多臨床前研究中的候選藥物。
[0025] 1)傳統(tǒng)藥物的改良
[0026] 盡管皮質(zhì)類固醇只能改善哮喘的癥狀，但一直是治療哮喘的主流藥物，人們也一 直設(shè)法降低其副作用，如開發(fā)所謂的軟類固醇化合物。Ciclesonide是一種新的吸入皮質(zhì)類 固醇的前體藥物，與皮質(zhì)類固醇相比，局部抗炎功能延長，且更加安全，人體對其的耐受力 更好。這可能是由其藥理和藥代動力學(xué)的特點所決定的，如與蛋白質(zhì)的結(jié)合強，較低的口服 生物相容性和快速的清除速率。其次，非類固醇類的糖皮質(zhì)激素受體激活劑也處于研究開 發(fā)中，如AL-438正處于臨床試驗中，其副作用也小于皮質(zhì)類固醇。
[0027] 2)細(xì)胞因子及其拮抗劑
[0028] 普遍認(rèn)為T細(xì)胞，尤其是Th2細(xì)胞在哮喘的病理中起著關(guān)鍵作用。Thl細(xì)胞能夠抑 制Th2。因此，抑制那些促進(jìn)Th2細(xì)胞生成或功能的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13,和促 進(jìn)那些可以誘導(dǎo)Thl細(xì)胞生成或功能的細(xì)胞因子，如IL-12和IFN γ，也許能夠重新平衡人 體內(nèi)的Thl/Th2比例，起到抗哮喘作用。細(xì)胞因子治療哮喘的途徑如圖3所示。
[0029] IL4誘導(dǎo)IgE同種異型基因轉(zhuǎn)換的開關(guān)，促進(jìn)初期T淋巴細(xì)胞發(fā)育生成Th2細(xì)胞， 并維持Th2的表型。動物實驗表明，阻止IL-4的生成或者抑制IL-4的活性對過敏哮喘有明 顯作用。針對IL-4,已經(jīng)有兩個藥物處于臨床實驗中，一是使用可溶的IL-4的受體（IL-4R， Altrakincept)中和IL-4,早期的臨床試驗表明，病人給藥后，不再使用吸入式的皮質(zhì)類 固醇激素也不會復(fù)發(fā)（Borish LC，Nelson HS，Lanz MJ，Claussen L, Whitmore JB, Agosti JM, Garrison L. Interleukin-4receptor in moderate atopic asthma. A phase I/II randomized, placebo-controlled trial. Am J Resp Crit Care 1999,160:1816-1823·)。 然而，進(jìn)一步的大規(guī)模的臨床實驗發(fā)現(xiàn)，可溶的IL-4受體并不能改善哮喘的癥狀和惡化。 另一個臨床研究中的藥物是IL_4Ra抗體Pascolizumab，該抗體能夠特異性阻斷IL-4 的作用，但是臨床試驗的結(jié)果也不理想，這大大地打擊了人們開發(fā)以IL-4為靶向的治療 哮喘的生物藥物的熱情（Hart TK, Blackburn MN, Brigham-Burke M, Dede K, Al-Mahdi N, Zia-Amirhosseini P1Cook RM. Preclinical efficacy and safety of pascolizumab (SB 240683): a humanized anti-interleukin_4antibody with therapeutic potential in asthma. Clin Exp Tmmun 2002,130:93-100. ) 〇
[0030] IL-5是響應(yīng)過敏刺激，調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖、引發(fā)、在組織中富集和生存 的核心因子。在哮喘病人的支氣管黏膜中，嗜酸性粒細(xì)胞的累積可能是哮喘病理的重要 機制。動物實驗表明，IL-5在各種哮喘模型中發(fā)揮重要作用，阻斷IL-5是治療哮喘的 可能方向（Menzies-Gow AN, Flood-Page PT, Robinson DS, Kay AB. Effect of inhaled interleukin_5on eosinophil progenitors in the bronchi and bone marrow of asthmatic and non-asthmatic volunteers. Clin Exp Allergy 2007,37:1023-1032·)。
[0031] IL-13可以調(diào)節(jié)IgE的生成、嗜酸性粒細(xì)胞炎癥、杯狀細(xì)胞增殖、黏液生成、氣道平 滑肌的增生、氣道超反應(yīng)性和富集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞到氣道中。這預(yù)示著IL-13 也許是過敏和哮喘治療中的一個重要祀點（Wynn TA. IL_13effector functions. Annu Rev Immunol 2003, 21:425-456.)。
[0032] IL-10具有廣譜的抗炎效果。哮喘病人，尤其是比較嚴(yán)重的哮喘病人，不能分泌 IL-10。IL-10是由Treg細(xì)胞分泌的過敏原免疫治療中主要的抑制性細(xì)胞因子。IL-10基 因缺失小鼠的過敏原刺激后氣道炎癥反應(yīng)增強（Griinig G, Corry DB, Leach MW, Seymour BffP, Kurup VP, Rennick DM. Interleukin-IOis a natural suppressor of cytokine production and inflammation in a murine model of allergic bronchopulmonary aspergillosis. J Exp Med 1997,185:1089-1100·Fu CL, Chuang YH, Chau LY,Chiang BL. Effects of adenovirus-expressing IL-IOin alleviating airway inflammation in asthma. J Gene Med 2006,8:1393-1399·)。IL-10治療哮喘的功效仍需要進(jìn)一步的臨床試 驗研究。
[0033] IFN Y是ThI細(xì)胞因子，其抑制Th2細(xì)胞介導(dǎo)過敏炎癥的功能最強。然而，皮下注 射IFNy治療哮喘的結(jié)果令人失望。IL-12、IL-18和IL-23也許能抑制哮喘中T h2介導(dǎo)的 反應(yīng)，但仍需要進(jìn)一步的研究。
[0034] 3)催化因子和受體
[0035] 趨化因子作用于細(xì)胞表面的受體。趨化因子受體與哮喘中各種炎癥細(xì)胞，如T細(xì) 胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的富集有關(guān)。許多功能強且高度特 異性的趨化因子受體的拮抗劑已經(jīng)進(jìn)入了早期的臨床研究中，主要針對CC趨化因子受體 3 (CCR3)。CCR3表達(dá)在嗜酸性粒細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的表面，并與 趨化因子 CCL5 (CC 趨化配體 5)、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL24、CCL26 和 CCL28 結(jié)合。過敏 原刺激可以上調(diào)這些趨化因子的表達(dá)（Palmqvist C, Wardlaw AJ, Bradding P. Chemokines and their receptors as potential targets for the treatment of asthma. Brit J Pharmacol 2007, 151:725-736.)。已有抗CCR3的單克隆抗體和小分子CCR3拮抗劑的治療 效果的研究，但是盡管在動物模型中的數(shù)據(jù)比較有前景，這些策略尚沒有進(jìn)入人體試驗階 段。過敏哮喘中，存在許多趨化因子的累積，有著豐富的功能，僅僅阻止其中一個，難以達(dá)到 予頁期的效果（Pease JE, Williams TJ. The attraction of chemokines as a target for specific anti-inflammatory therapy. Brit J Pharmacol 2006, 147:S212-S221.)〇
[0036] 4)信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子
[0037] 毫無疑問，關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中間分子是哮喘治療的有效靶點，因為它們可 以上調(diào)或下調(diào)哮喘病理相關(guān)的某些分子。如磷酯3激酶（PI3K)家族，它們控制著與哮喘 相關(guān)的大部分炎癥細(xì)胞的生長、分化、生存、增殖和細(xì)胞因子的生成等。絲裂原激活的蛋 白激酶（MPK)可更多地抑制T h2細(xì)胞因子的合成（與ThI細(xì)胞相比），通過激活凋亡途 徑降低嗜酸性粒細(xì)胞生存。這些特征表明，激酶抑制劑有可能用于哮喘的治療（Rahman MS, Yamasaki A, Yang J,Shan L,Halayko AJ,Gounni AS.IL-17A induces eotaxin-1/ CC chemokine ligand llexpression in human airway smooth muscle cells:role of MAPK(Erkl/2，JNK, and p38)pathways. J Immunol 2006,177:4064-4071·)。另外，SYK 酪氨 酸激酶和其上游的酪氨酸激酶LYN，在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的活化中發(fā)揮重要作用，它 們的抑制劑也有可能應(yīng)用于哮喘的治療。
[0038] 5) IgE 和 IgE 受體
[0039] 阻斷IgE-多價抗原復(fù)合體與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的受體Fe ε RI的結(jié)合 可以從源頭上阻止過敏反應(yīng)的發(fā)生，是治療過敏疾病的主要方向。這主要包括可溶性受體、 針對于IgE受體的抗體以及已在臨床上應(yīng)用的IgE抗體和基于ITIM的信號抑制分子。
[0040] 6)可溶性 Fe ε RI
[0041] 鑒于多價抗原的IgE抗體與Fe ε RI的α鏈結(jié)合，Yanagida課題組嘗試了可 溶性Fe eRIa治療過敏性疾病的可能性。可溶性Fe eRIa與IgE結(jié)合，避免或減少 了 IgE與過敏細(xì)胞表面Fe sRI的結(jié)合，阻止過敏信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生。該課題組實驗觀察 到可溶性FceRIa可以消除小鼠模型上的被動皮膚過敏反應(yīng)，也能抑制IgE結(jié)合到 人外周血的嗜堿性粒細(xì)胞，進(jìn)而抑制組胺的釋放（Yanagida M，Irikura M，Suto H，Yagi Sj Ogawa Hj Ra C. Kinetic analysis of the interaction between recombinant human Fe ε RI a and serum IgEs from allergic patients. Clin Immunol 2000,95:190-196.)〇 Haak-Frendscho等設(shè)計了 Fee RI a-IgG融合蛋白。與可溶的Fee RI α相比，該融合蛋白 具有較長的半衰期，與IgE的親和力相當(dāng)。由于具有更長的血清半衰期，它能有效阻止IgE 分子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合（Haak-Frendscho M，Ridgway J，Shields R，Robbins K，Gorman CjJardieu P. Human IgE receptor alpha-chain IgG chimera blocks passive cutaneous anaphylaxis reaction in vivo. J Immunol 1993，151:351_358·)。但除了這些早期的研 究報道外，沒有進(jìn)一步臨床試驗報道。
[0042] 7)抗IgE受體Fc ε RII的抗體
[0043] 抗 Fc ε RII 的人源化抗體（IDEC-152，或者 Lumiliximab)是 Biogen-Idec 公 司開發(fā)的產(chǎn)品。體外研究表明，小鼠 FceRII的交聯(lián)可以下調(diào)IgE的生成。在I期 臨床試驗中，也確實觀察到Lumiliximab能夠長期地（?85天）減小體內(nèi)IgE水平 (Byrd JCjOiBrien SjFlinn IWjKipps TJjWeiss MjRai KjLin TSjWoodworth JjWynne Dj Reid J.Phase lstudy of lumiliximab with detailed pharmacokinetic and pharmacodynamic measurements in patients with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res 2007，13:4448_4455·)。盡管單劑量的 I 期 臨床試驗沒有觀察到Lumiliximab改善過敏哮喘病人的肺功能指征，但是臨床試驗專家 認(rèn)為，Lumiliximab明顯降低了人體內(nèi)的IgE水平，使人們有理由期待Lumiliximab的 重復(fù)給藥對過敏哮喘的治療作用（Poole JA，Meng J，Reff M，Spellman MC，Rosenwasser LJ.Anti-CD23monoclonal antibody, lumiliximab, inhibited allergen-induced responses in antigen-presenting cells and T cells from atopic subjects.J Allergy Clin Immunol 2005,116:780-788.)〇
[0044] 8) ITIM信號抑制分子
[0045] 肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的表面除了表達(dá)有刺激過敏信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體Fe ε RI外， 也表達(dá)含有免疫受體釀氨酸抑制基序Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)的低親和力受體 Fe γ RIIb(Da ron M，Latour S，Malbec 0,Espinosa Ej Pina P，Pasmans S，F(xiàn)ridman WH. The same tyrosine-based inhibition motif, in the intra-cytoplasmic domain of Fe γ RIIBj regulates negatively BCR-，TCR-，and FcR-dependent cell activation. Immunity 1995,3:635_646·)。FcyRIIb 是抑制 受體超家族（Inhibitory receptor superfamily，IRS)的代表，可以負(fù)調(diào)節(jié)含有免 疫受體酪氨酸活化基序 Immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM) 的激活受體（如Fee RI)的功能和一系列細(xì)胞應(yīng)答。IRS成員與激活受體的交聯(lián) 可導(dǎo)致ITIM的酪氨酸殘基磷酸化，隨后激活含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP-I和肌醇多磷酸磷酸酶SHIP，抑制下游的激活受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Fong DC，Malbec 0,Arock M, Cambier JC, Fridman WH, Da ron M.Selective in vivo recruitment of the phosphatidyl inositol phosphatase SHIP by phosphorylated Fe[gamma]RIIB during negative regulation of IgE-dependent mouse mast cell activation. Immunol Lett 1996,54:83-91. Ono M，Bolland S，Tempst P，Ravetch JV.Role of the inositol phosphatase SHIP in negative regulation of the immune system by the receptor Fey RIIB. Nature 1996,383:263-266·)?；谶@樣的原理，文 獻(xiàn)報道了 雙特異性抗體（Jacman J，Chen Y，Huang A，Moffat B，Scheer J，Leong S, Lee ff, Zhang J, Sharma N, Lu Y, Lyer S, Shields R, Chiang N, Bauer M, Wadley D, Roose-Girma M,Vandlen R, Yansura D, Wu Y, Wu L.Development of a two part strategy to identify a therapeutic human bispecific antibody that inhibits IgE receptor signaling.J.Biol.Chem(2010), 285:20850-20859. Tam Sff1Demissie S, Thomas D, Daeron M. A bispecific antibody against human IgE and human FcrRII that inhibits antigen-induced histamine release by human mast cells and basophils. Allergy (20040, 59:772-780·)、已經(jīng)有 IgG Fe 和人 IgE Fe 構(gòu)成的融合 蛋白(Zhu D, Kepley C, Zhang M, Zhang K, Saxon A. A novel human immunoglobulin Fcr-Fce bifunctional fusion protein inhibits FceRI-mediated degranulation. Nat Med(2002)，8:518-521.)。這些生物分子的功能主要在于交聯(lián)肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞表面 的Fc ε RI和Fe Y Rllb，從而利用Fe Y RIIb分子上的Ι--Μ信號抑制Fc ε RI的信號途徑，阻 止細(xì)胞活化釋放炎性介質(zhì)，達(dá)到治療過敏疾病的目的。目前這類生物分子尚處于臨床研究 階段。
[0046] 總體上，目前臨床中尚缺少有效的治療過敏疾病的藥物。而治療過敏疾病的創(chuàng)新 藥物開發(fā)依然寄希望于生物藥物。鑒于此，我們設(shè)計和開發(fā)了重組人IgE Fc片段蛋白，并 應(yīng)用于過敏疾病的治療。
[0047] 根據(jù)現(xiàn)有知識，人IgE與Fc ε RI的結(jié)合是過敏細(xì)胞活化的基礎(chǔ)，也是所有過敏疾 病發(fā)生的根源。因此，任何阻止人IgE與Fc ε RI的結(jié)合都具有治療過敏疾病的潛力。因此， 本發(fā)明目的在于開發(fā)人IgE Fc片段蛋白，并利用之競爭性結(jié)合于Fc ε RI受體從而阻止IgE 與Fc ε RI結(jié)合，以實現(xiàn)治療過敏疾病的目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0048] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)OiIgE Fe)片段蛋 白。
[0049] 本發(fā)明的另一個目的是提供該人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白 的制備方法。
[0050] 本發(fā)明的又一個目的是提供該人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)OiIgE Fe)片段蛋白 的醫(yī)藥用途。
[0051] 本發(fā)明再一目的是提供包含hlgE Fe蛋白的藥物組合物。
[0052] 本發(fā)明再一目的是提供包含hlgE Fe蛋白的藥物組合物在過敏類疾病治療中的應(yīng) 用。
[0053] 本發(fā)明提供一種人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白，其能夠結(jié)合于 Fe ε RI分子上的IgE的結(jié)合位點。
[0054] 在本發(fā)明的個優(yōu)選實施例中，所述人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋 白包含了人人IgE_CH3中與人Fe ε RI相互作用的特異性氨基酸。
[0055] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段 蛋白包含了人IgE的CH2-CH3-CH4區(qū)域。
[0056] 眾所周知，蛋白分子上的某個或某些氨基酸的變化或某一片段的缺失并不會影響 該蛋白的功能，甚至有可能增強該蛋白的功能，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人免疫 球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白包含人IgE的CH2-CH3-CH4區(qū)域任何部位氨基 酸殘基片段進(jìn)行突變修飾獲得的變異體。
[0057] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段 蛋白如序列表中SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0058] 眾所周知，一個氨基酸可以有多種密碼子編碼。在某些實施方案中，可以根據(jù)實際 需要對核酸密碼子進(jìn)行突變，特別是使用CHO細(xì)胞偏愛的密碼子，但人免疫球蛋白ε重鏈 恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的氨基酸序列不變。因此在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述 人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白中至少有一個核酸密碼子采用CHO細(xì)胞 進(jìn)行突變。
[0059] 本發(fā)明中所指的CHO細(xì)胞包括CHO-Kl，CH0-DG44等商業(yè)化的CHO細(xì)胞株。
[0060] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段 蛋白如序列表中SEQ ID N0:2所示的核甘酸序列。
[0061] 本發(fā)明提供一種人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的制備方法，包 括如下步驟：
[0062] (1)將編碼hlgE Fe核苷酸序列可操作地連于表達(dá)載體，得到hlgE Fe重組表達(dá)載 體；
[0063] (2)將步驟（1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄CHO細(xì)胞，篩選獲得表達(dá)hlgE Fe的工程細(xì) 胞株；
[0064] (3)在合適的條件下培養(yǎng)步驟（2)獲得的工程細(xì)胞株；
[0065] (4)從步驟（3)中的培養(yǎng)產(chǎn)物中分離所述的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白。
[0066] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，在合適的條件下培養(yǎng)表達(dá)hlgE Fe蛋白的工程 細(xì)胞株的步驟包括：將經(jīng)篩選得到的工程細(xì)胞株培養(yǎng)在不含有牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條 件為：溫度36°C?37. 5°C，CO2濃度為5%。培養(yǎng)15天后，離心培養(yǎng)液得上清，經(jīng)過疏水層 析和離子交換層析分離獲得hlgE Fe蛋白。
[0067] 本發(fā)明使用的表達(dá)載體可以選用各種已知的載體，如商業(yè)化載體：p⑶NA3. 1、 PSecTag等等。將重組表達(dá)載體通過電轉(zhuǎn)染或化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，利用合適的條 件篩選穩(wěn)定的重組細(xì)胞，作為制備人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的工程 細(xì)胞株。
[0068] 眾所周知，也可以利用其他表達(dá)載體和宿主細(xì)胞建立工程細(xì)胞株來表達(dá)本發(fā)明所 述的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白。
[0069] 本發(fā)明提供一種包含人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)OiIgE Fe)片段蛋白在制備預(yù) 防和治療過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
[0070] 本發(fā)明提供一種包含人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hIgE Fe)片段蛋白的藥物組 合物。
[0071 ] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述藥物組合物為由適應(yīng)性載體和人免疫球蛋白 ε重鏈恒定區(qū)OiIgE Fe)片段蛋白制備的注射針劑、口服制劑、含服制劑、肺部給藥制劑、 氣道給藥制劑、鼻腔給藥制劑或其他非腸道給藥制劑。
[0072] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述適應(yīng)性載體選自藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦 形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑中的一 種或任意混合。
[0073] 本發(fā)明提供一種包含人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hIgE Fe)片段蛋白的藥物組 合物在在制備預(yù)防和治療過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
[0074] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述過敏疾病為過敏鼻炎、過敏哮喘、過敏皮炎或 藥物過敏。
[0075] 上述藥物的用量一般為0· l_5mg人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hIgE Fe)片段蛋 白/kg/week，療程一般為10至30天。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0076] 圖1為過敏的機制示意圖。
[0077] 圖2為過敏反應(yīng)中的IgE的作用示意圖。
[0078] 圖3為過敏分子途徑中的細(xì)胞因子示意圖。
[0079] 圖4為hlgE Fe蛋白抑制嗜堿性粒細(xì)胞活化和組胺的釋放示意圖。
[0080] 圖5為系統(tǒng)給藥hlgE Fe蛋白抑制恒河猴過敏反應(yīng)的PCA模型試驗示意圖。

【具體實施方式】
[0081] 本發(fā)明提供的一種人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白，其能夠結(jié)合 于Fe ε RI分子上的IgE的結(jié)合位點。并且包含了人人IgE_CH3中與人Fe ε RI相互作用的 特異性氨基酸。尤其是包含了人IgE的CH2-CH3-CH4區(qū)域。
[0082] 眾所周知，蛋白分子上的某個或某些氨基酸的變化或某一片段的缺失并不會影響 該蛋白的功能，甚至有可能增強該蛋白的功能，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人免疫 球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白包含人IgE的CH2-CH3-CH4區(qū)域任何部位氨基 酸殘基片段進(jìn)行突變修飾獲得的變異體。
[0083] 本發(fā)明的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白如序列表中SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。眾所周知，一個氨基酸可以有多種密碼子編碼。在某些實施方案 中，可以根據(jù)實際需要對核酸密碼子進(jìn)行突變，特別是使用CHO細(xì)胞偏愛的密碼子，但人免 疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的氨基酸序列不變。因此在本發(fā)明的一個優(yōu) 選實施例中，所述人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白中至少有一個核酸密碼 子采用CHO細(xì)胞進(jìn)行突變。
[0084] 本發(fā)明中所指的CHO細(xì)胞包括CHO-Kl，CH0-DG44等商業(yè)化的CHO細(xì)胞株。
[0085] 本發(fā)明的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白如序列表中SEQ ID N0:2所示的核甘酸序列。
[0086] 本發(fā)明提供一種人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的制備方法，包 括如下步驟：
[0087] (1)將編碼hlgE Fe核苷酸序列可操作地連于表達(dá)載體，得到hlgE Fe重組表達(dá)載 體；
[0088] (2)將步驟（1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄CHO細(xì)胞，篩選獲得表達(dá)hlgE Fe的工程細(xì) 胞株；
[0089] (3)在合適的條件下培養(yǎng)步驟（2)獲得的工程細(xì)胞株；
[0090] (4)從步驟（3)中的培養(yǎng)產(chǎn)物中分離所述的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白。
[0091] 步驟（3)中在合適的條件下培養(yǎng)表達(dá)hlgE Fe蛋白的工程細(xì)胞株的步驟包括： 將經(jīng)篩選得到的工程細(xì)胞株培養(yǎng)在不含有牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：溫度36°C? 37. 5°C，CO2濃度為5 %。培養(yǎng)15天后，離心培養(yǎng)液得上清，經(jīng)過疏水層析和離子交換層析 分離獲得hlgE Fe蛋白。本發(fā)明使用的表達(dá)載體可以選用各種已知的載體，如商業(yè)化載體： p⑶NA3. UpSecTag等等。將重組表達(dá)載體通過電轉(zhuǎn)染或化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，利 用合適的條件篩選穩(wěn)定的重組細(xì)胞，作為制備人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段 蛋白的工程細(xì)胞株。
[0092] 眾所周知，也可以利用其他表達(dá)載體和宿主細(xì)胞建立工程細(xì)胞株來表達(dá)本發(fā)明所 述的人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白。
[0093] 本發(fā)明提供的包含人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白在制備預(yù)防 和治療過敏疾病藥物中的應(yīng)用。尤其是在制備預(yù)防和治療過敏鼻炎、過敏哮喘、過敏皮炎、 藥物過敏等過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
[0094] 本發(fā)明還提供了一種包含人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的藥 物組合物。該藥物組合物為由適應(yīng)性載體和人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段 蛋白制備的注射針劑、口服制劑、含服制劑、肺部給藥制劑、氣道給藥制劑、鼻腔給藥制劑或 其他非腸道給藥制劑。例如可以制成用于靜脈注射等的注射劑，用于皮下注射、表皮外敷等 的經(jīng)皮吸收劑，用于噴鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的噴霧劑，用于滴鼻、眼、耳等的滴劑，用于 肛腸等的栓劑、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥 物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0095] 制備藥物組合物過程中使用的適應(yīng)性載體選自藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、 填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑中的一種或任 意混合。
[0096] 上述包含人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋白的藥物組合物在在制 備預(yù)防和治療過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
[0097] 上述藥物的用量一般為0. l_5mg人免疫球蛋白ε重鏈恒定區(qū)（hlgE Fe)片段蛋 白/kg/week，療程一般為10至30天。
[0098] 實施例
[0099] 下面用實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任 何變動都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0100] 實施例IhIgE Fc蛋白的表達(dá)
[0101] hlgE Fc蛋白的表達(dá)過程包括以下步驟：合成基因；把基因插入表達(dá)載體，用表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞；利用Hygromycin篩選表達(dá)hlgE Fc融合蛋白CHO工程細(xì)胞株，培養(yǎng)該 細(xì)胞株，最后從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化RANKL-Fc蛋白。具體地：
[0102] 1)基因合成
[0103] 委托基因合成的專業(yè)公司合成SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，并在5'端依次加 上BamHI的酶切位點和Kozak序列；在3'端加上Xba I酶切位點。
[0104] 2)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0105] 從基因合成公司得到上述合成的基因后，用BamHI和Xba I雙酶切基因和載體 p⑶NA3. 1，分別回收基因和載體的酶切片段，用T4連接酶將基因插入到載體中，構(gòu)成表達(dá) 載體 pCDNA/hlgE Fe.
[0106] 3)CH0工程細(xì)胞株的建立
[0107] 利用大腸桿菌擴增上述表達(dá)載體。抽提質(zhì)粒后，用電轉(zhuǎn)的方法把表達(dá)載體轉(zhuǎn)入 CHO-S細(xì)胞中。將細(xì)胞培養(yǎng)與含有500mg/L的hygromycin的無血清清培養(yǎng)基中，14天后， 得到抗性細(xì)胞庫。經(jīng)過克隆篩選，獲得穩(wěn)定的hlgE Fc表達(dá)的CHO工程細(xì)胞株。
[0108] 4) hlgE Fc融合蛋白的生產(chǎn)
[0109] 利用CD CH0(INVITR0GEN，CA)培養(yǎng)基，在37°C，5% C02培養(yǎng)上述CHO工程細(xì)胞株 15天，2000rpm離心后，收集上清，再用離子交換和疏水層析分離純化得到hlgE Fc蛋白。
[0110] 實施例2hIgE Fc蛋白抑制嗜堿性粒細(xì)胞活化釋放組胺
[0111] 從健康人外周血中分離出嗜堿性粒細(xì)胞，按照lXl〇6cells/孔分裝到96板中， 然后加入圖4中所示量的hlgE和hlgE Fc，4個小時后，小心吸出培養(yǎng)上清，并用無鈣鎂 的HBSS緩沖液洗兩次，用IOOyL Anti-IgE Fc多抗刺激，半小時后，取出上清，利用組胺 ELISA分析試劑盒檢測組胺濃度。組胺釋放的百分率為細(xì)胞激發(fā)后釋放的組胺量與等量細(xì) 胞KKTC煮沸6分鐘后釋放的組胺量的比值。
[0112] 實施例3利用恒河猴評價系統(tǒng)性給藥hlgE Fc蛋白對IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。
[0113] 本實驗觀察了 hlgE Fc靜脈滴注給藥后對恒河猴PCA反應(yīng)的抑制作用。實驗中取 12只恒河猴，雌雄各半，3?4歲，隨機分成3個給藥組（0. 17、0. 50、I. 50mg/kg)和1個對 照組（靜脈滴注給藥氯化鈉注射液），每組3只。給藥后在猴腹部皮內(nèi)注射Anti-NP-IgE溶 液，每只猴注射3個點；4h后從右前肢靜脈注射過敏原和染料（NP-BSA溶于1 %伊文氏藍(lán)溶 液）；30min后觀察腹部局部皮膚顏色反應(yīng)；照相并測量藍(lán)色反應(yīng)斑的短徑和長徑，計算各 組動物的藍(lán)斑徑值。藍(lán)斑徑值統(tǒng)計見圖5。結(jié)果表明，系統(tǒng)性給藥hlgE Fc可以劑量依賴抑 制IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，說明，hlgE Fc可應(yīng)用于過敏疾病的治療。
[0114] 工業(yè)實用性
[0115] 本發(fā)明的hlgE Fc蛋白完全是人源（human) IgE的序列，因此，該蛋白作為一種藥 物進(jìn)入人體，沒有任何異體蛋白的免疫源性。hlgE Fe競爭性結(jié)合于Fe ε RI，從而阻止IgE/ Fe ε RI介導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化，從源頭上，控制過敏疾病的發(fā)生，將在過敏 性疾病的治療中發(fā)揮重要作用。
【權(quán)利要求】
1. 一種人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其能夠結(jié)合于Fee RI分子 上的IgE的結(jié)合位點。
2. 如權(quán)利要求1所述人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其包含了人人 IgE_CH3中與人Fc e RI相互作用的特異性氨基酸。
3. 如權(quán)利要求1所述人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其包含了人 IgE 的 CH2-CH3-CH4 區(qū)域。
4. 如權(quán)利要求1所述的所述人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其包含 人IgE的CH2-CH3-CH4區(qū)域任何部位氨基酸殘基片段進(jìn)行突變修飾獲得的變異體。
5. 如權(quán)利要求1所述人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其如序列表中 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
6. 如權(quán)利要求1所述人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其中至少有一 個核酸密碼子采用CH0細(xì)胞進(jìn)行突變。
7. 如權(quán)利要求6所述的人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其所指的 CH0 細(xì)胞包括 CH0-K1 或 CH0-DG44。
8. 如權(quán)利要求1所述人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白，其如序列表中 SEQ ID N0:2所示的核甘酸序列。
9. 如權(quán)利要求1至8任一項權(quán)利要求所述的一種人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將編碼hlgE Fc核苷酸序列可操作地連于表達(dá)載體，得到hlgE Fc重組表達(dá)載體； (2) 將步驟（1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄CH0細(xì)胞，篩選獲得表達(dá)hlgE Fc的工程細(xì)胞 株； (3) 在合適的條件下培養(yǎng)步驟（2)獲得的工程細(xì)胞株； (4) 從步驟（3)中的培養(yǎng)產(chǎn)物中分離所述的人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片 段蛋白。
10. 如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟（3)中，在合適的條件下培 養(yǎng)表達(dá)hlgE Fc蛋白的工程細(xì)胞株的步驟包括：將經(jīng)篩選得到的工程細(xì)胞株培養(yǎng)在不含有 牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：溫度36°C?37. 5°C，C02濃度為5%。培養(yǎng)15天后，離心 培養(yǎng)液得上清，經(jīng)過疏水層析和離子交換層析分離獲得hlgE Fc蛋白。
11. 權(quán)利要求1至8任一項權(quán)利要求所述的一種包含人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū) (hlgE Fc)片段蛋白在制備預(yù)防和治療過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
12. 權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中所述過敏疾病為過敏鼻炎、過敏哮喘、過敏皮炎或藥 物過敏。
13. 權(quán)利要求1至8任一項權(quán)利要求所述的一種包含人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū) (hlgE Fc)片段蛋白的藥物組合物。
14. 權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，為由適應(yīng)性載體和人免疫球蛋白e 重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白制備的注射針劑、口服制劑、含服制劑、肺部給藥制劑、氣道 給藥制劑、鼻腔給藥制劑或其他非腸道給藥制劑。
15. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其特征在于，所述適應(yīng)性載體選自藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī) 的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤 滑劑中的一種或任意混合。
16. -種權(quán)利要求13所述的包含人免疫球蛋白e重鏈恒定區(qū)（hlgE Fc)片段蛋白的 藥物組合物在在制備預(yù)防和治療過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
17. 權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中所述過敏疾病為過敏鼻炎、過敏哮喘、過敏皮炎或藥 物過敏。
【文檔編號】A61K39/395GK104403000SQ201410513318
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】孫祥明, 王紅勛, 祝道成, 包駿 申請人:上海科新生物技術(shù)股份有限公司