一種遲鈍愛德華氏菌亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種遲鈍愛德華氏菌亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。揭示了一種新型抗原1，6-二磷酸果糖醛縮酶（FbaA)，其具有良好的免疫原性，可制備廣譜型保護(hù)性疫苗。本發(fā)明為養(yǎng)殖魚類的愛德華氏菌病及其他致病菌引起的魚類疾病提供安全，有效，經(jīng)濟(jì)的疫苗。
【專利說明】一種遲鈍愛德華氏菌亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種遲鈍愛德華氏菌 亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著漁業(yè)養(yǎng)殖的不斷穩(wěn)步發(fā)展，各種病害問題日益突出，對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)量及成長(zhǎng)造成 嚴(yán)重影響。在我國(guó)，近幾年發(fā)展起來的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖魚類的突發(fā)性、爆發(fā)性疾 病頻繁發(fā)生。目前，我國(guó)的海水養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)160 億元，病害問題已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。
[0003] 針對(duì)各種病害的發(fā)生，以抗生素為代表的化學(xué)療法對(duì)病害的控制和防治曾發(fā)揮了 積極作用。但是，這種病害控制措施造成的環(huán)境污染、抗藥病原的大量出現(xiàn)、水產(chǎn)品的藥物 殘留等負(fù)面影響日趨嚴(yán)重。在歐盟、美國(guó)和加拿大，以抗生素為主的化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè) 中已逐漸被禁用。相對(duì)于抗生素，疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)、抗病周期長(zhǎng)、可終身免疫、效果顯著和 防治主動(dòng)的優(yōu)勢(shì)。以病原菌細(xì)胞滅活體為基礎(chǔ)形式的滅活疫苗為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供了 有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便（注射給藥才具有較好的免疫保護(hù)力）的技術(shù)應(yīng) 用缺陷，對(duì)于需要免疫成千上萬數(shù)量的魚類養(yǎng)殖業(yè)來說極為不便，給藥成本往往不能為水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所承受。而且，對(duì)于病害發(fā)生嚴(yán)重的魚苗和幼魚則無法實(shí)施注射給藥，同時(shí)，對(duì)許 多病害滅活疫苗往往效果不佳或無效。這一切都給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)的廣泛應(yīng)用 帶來了阻礙。
[0004] 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)要求病害防治技術(shù)必須經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用實(shí)施方便。因此，疫苗產(chǎn) 品的開發(fā)除高效價(jià)的技術(shù)要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養(yǎng)殖業(yè)的承受能力。亞單位 疫苗因具有免疫效價(jià)高（可減少給藥劑量）、成本低廉、可開發(fā)廣譜疫苗（活菌疫苗往往具 有交叉保護(hù)性）的新技術(shù)優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)前國(guó)際上水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗研究和開發(fā)的熱點(diǎn)和前 沿領(lǐng)域。
[0005] 愛德華氏菌屬是導(dǎo)致淡水、海水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病的一類常見的病原體，具體 分為遲純愛德華氏菌（Edwardsiella tarda)，餘魚愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri) 和?？茞鄣氯A氏菌（Edwardsiella hoshinae)。由其引起的魚類出血性敗血癥統(tǒng)稱為愛德 華氏菌病（Edwardsiellosis)。該病傳播面積廣，無明顯季節(jié)性，感染率及死亡率高，危害的 種類多，有鯉魚，羅非魚，鰻鱺，鯔魚，鮭魚，鱒魚，鲆鰈等大多數(shù)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚種。 此外，遲鈍愛德華氏菌還感染貝類、爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類。值得注意，遲鈍愛德華氏 菌還是一種重要的人畜共患病原菌，它是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。目前，我國(guó) 養(yǎng)殖魚類愛德華氏菌病病害比較嚴(yán)重的病原體主要為遲鈍愛德華氏菌，并有存在病原體向 人體轉(zhuǎn)移的巨大威脅。目前在我國(guó)尚無該病害的有效防治措施。
[0006] 因?yàn)閷?duì)遲鈍愛德華氏菌致病機(jī)理仍然缺少系統(tǒng)性的認(rèn)識(shí)，其多宿主適應(yīng)性也導(dǎo)致 對(duì)該菌的防治尤為困難。目前，愛德華氏菌病的控制主要依靠抗生素的使用，以化學(xué)治療為 主。由于抗生素能被不斷的耐受，它們?cè)谒a(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越受到限制。此外，致病的 遲鈍愛德華氏菌常常被發(fā)現(xiàn)對(duì)多重抗菌素復(fù)合物有自然抗性，增加了以抗生素為基礎(chǔ)的治 療的難度。相比之下，從一個(gè)長(zhǎng)期的觀點(diǎn)來看，疫苗是疾病控制更安全更有效的方法。由于 滅活疫苗的抗原性較弱，而減毒疫苗的安全性不穩(wěn)定，為此，研制使用方便、高效、易商品化 大規(guī)模生產(chǎn)、切實(shí)有效的亞單位疫苗，對(duì)水產(chǎn)業(yè)尤為必要。
[0007] 鑒于此，本領(lǐng)域迫切需要研究和開發(fā)新型的效果良好的免疫疫苗，使得養(yǎng)殖魚類 具備良好的對(duì)抗致病菌的免疫能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種遲鈍愛德華氏菌亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶（FbaA)的用途，用 于制備保護(hù)魚類免受致病菌感染的疫苗。
[0010] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶（FbaA)的氨基酸序 列如SEQ ID N0:1所示。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的致病菌包括（但不限于）：遲鈍愛德華氏菌（E. tarda)，鰻 弧菌（V.anguillarum)，嗜水氣單胞菌（A.hydrophila)，哈維氏弧菌（V.harveyi)，溶藻弧 菌（V. alginolyticus)〇
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種保護(hù)魚類免受致病菌感染的疫苗，所述的疫苗包 括：愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶和有效量的免疫佐劑。
[0013] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的愛德華氏菌1,6-二磷酸果糖醛縮酶與免疫佐劑的 比例是1:(1-5);較佳地比例是1:(1. 5-4);更佳地比例是1:(2-3);進(jìn)一步更佳地是 1: (2-2. 5)。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的免疫佐劑是M0NTANIDE?ISA763A。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗中還包括藥學(xué)上可接受的載體。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供制備所述的疫苗的方法，所述方法包括：將愛德華氏菌 1，6-二磷酸果糖醛縮酶和有效量的免疫佐劑混合，獲得所述的疫苗。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的愛德華氏菌1,6-二磷酸果糖醛縮酶與免疫佐劑的 比例是1:(1-5);較佳地比例是1:(1. 5-4);更佳地比例是1:(2-3);進(jìn)一步更佳地是 1: (2-2. 5)。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的免疫佐劑是M0NTANIDE?ISA763A。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種保護(hù)魚類免受致病菌感染的試劑盒，所述的試劑 盒中包含所述的疫苗。
[0020] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1、遲鈍愛德華氏菌重組抗原FbaA的氨基酸序列。
[0022] 圖2、本發(fā)明重組抗原FbaA表達(dá)純化后SDS-PAGE圖。
[0023] 圖3、本發(fā)明重組抗原FbaA免疫斑馬魚后的相對(duì)免疫保護(hù)分析。
[0024] 圖4、本發(fā)明重組抗原FbaA免疫大菱鲆后的相對(duì)免疫保護(hù)分析。
[0025] 圖5、本發(fā)明重組抗原FbaA免疫大菱鲆后針對(duì)FbaA和其他魚類致病菌的抗血清分 析。
[0026] 圖6、本發(fā)明重組抗原FbaA免疫斑馬魚后針對(duì)多種魚類致病菌的相對(duì)免疫保護(hù)分 析。
[0027] 圖7、基于反向疫苗學(xué)的遲鈍愛德華氏菌候選抗原蛋白篩選過程。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明人經(jīng)過大量的篩選研究，找到一種新型抗原1，6_二磷酸果糖醛縮酶 (FbaA)，其具有良好的免疫原性，可制備廣譜型保護(hù)性疫苗。本發(fā)明為養(yǎng)殖魚類的愛德華氏 菌病及其他致病菌引起的魚類疾病提供安全，有效，經(jīng)濟(jì)的疫苗。
[0029] FbaA
[0030] 1,6-二磷酸果糖醛縮酶（FbaA)是一種參與愛德華氏菌糖酵解途徑的蛋白，分子 量約40kD。它是糖酵解途徑中的酶，可以將1，6-二磷酸果糖分解成3-磷酸甘油醛和磷酸 二羥丙酮?，F(xiàn)有技術(shù)通常將之作為糖酵解途徑相關(guān)酶進(jìn)行研究，也有研究將之作為藥物分 析的靶點(diǎn)。然而，鑒于其糖酵解途徑相關(guān)功能，通常人們認(rèn)為其表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，且在細(xì) 胞內(nèi)發(fā)揮作用。
[0031] 本發(fā)明人致力于魚類免疫保護(hù)性抗原的研究，在深入研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)baA可以由愛 德華氏菌表達(dá)并達(dá)到細(xì)菌細(xì)胞的胞外。更令人意外地，還發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性。將 FbaA蛋白制備成疫苗，能有效保護(hù)魚類免受遲鈍愛德華氏菌及其他魚類致病菌的感染，有 效防治遲鈍愛德華氏菌病等魚類疾病的發(fā)生。
[0032] FbaA蛋白可以是：（a) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的蛋白；或（b)將SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)（優(yōu)選1-20個(gè)，更佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)；更佳 地1-3個(gè)）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO: 1相同功能的由 (a)衍生的蛋白；或（c)SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。
[0033] FbaA蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長(zhǎng)的FbaA 蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50 %的全長(zhǎng)FbaA的活 性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長(zhǎng)FbaA的55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、95%、97%、99%、或100%的活性。FbaA或其生物活性片段包括一部分保 守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。 適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施，并且確保不改變所 得分子的生物活性。一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變 生物活性。
[0034] FbaA蛋白的編碼基因是容易獲得的，在蛋白已知的情況下，本領(lǐng)域人員均了解如 何獲得FbaA的編碼基因，例如可以采用PCR擴(kuò)增的方式從基因組中獲得，或采用化學(xué)合成 的方式。
[0035] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，將FbaA蛋白疫苗在斑馬魚和大菱鲆上進(jìn)行免疫分析， 均具有較高的免疫保護(hù)力。
[0036] 另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)baA蛋白在多種病原菌中具有高度的保守性，并且在斑馬 魚模型上表現(xiàn)出了較好的交叉免疫效果。FbaA的發(fā)現(xiàn)為我們遲鈍愛德華氏菌抗原的研究提 供了靶點(diǎn)。
[0037] FbaA疫苗及其制備
[0038] 本發(fā)明還提供一種組合物，優(yōu)選的是組合物是疫苗，所述的疫苗是指將本發(fā)明的 FbaA蛋白和佐劑混合后獲得的可用于預(yù)防致病菌感染的疫苗。所述的組合物中通常還包括 其它藥學(xué)上可接受的載體，所述的疫苗可用于魚類，通?？芍瞥勺⑸鋭┑男问?。
[0039] 所述"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋 齊U。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒 性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有 液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、 助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。
[0040] 本發(fā)明中，所述的"致病菌"是指感染魚類的一類細(xì)菌，其表面表達(dá)FbaA或類似 蛋白或同源蛋白，能夠由抗FbaA的抗體結(jié)合并被抑制。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的致 病菌包括但不限于：遲鈍愛德華氏菌（E. tarda)，鰻弧菌（V. anguillarum)，嗜水氣單胞菌 (A.hydrophila)，哈維氏弧菌（V.harveyi)，溶藻弧菌（V.alginolyticus)。
[0041] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的疫苗可以包括：愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮 酶和有效量的免疫佐劑。
[0042] 用于魚類免疫的多種佐劑可應(yīng)用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的免 疫佐劑是 M0NTANIDE?ISA763A、M0NTANIDE?ISA780VG 和 M0NTANIDE?MS1312VG PR。
[0043] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶與免疫佐劑 的比例是1:(1-5);較佳地比例是1:(1. 5-4);更佳地比例是1:(2-3);進(jìn)一步更佳地是 1: (2-2. 5)，所述比例具有較好的給藥效果，能夠在魚體內(nèi)產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體。
[0044] 在得知了所述愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟 知的方法來將所述的疫苗給藥于魚類。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予等。
[0045] 本發(fā)明的抗原有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu) 選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定。所述的因素包括但 不限于：所述的愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、 代謝、半衰期等；魚的種類、體重、免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的抗原以約 0. 1-100 μ g/尾（較佳的0. 5-50 μ g/尾）的劑量給予，能得到令人滿意的效果。當(dāng)用于斑 馬魚時(shí)優(yōu)選1. 5 μ g/尾左右，當(dāng)用于大菱鲆時(shí)優(yōu)選約1. 5 μ g/尾，其它魚類可參照斑馬魚和 大菱鲆的體重來改變注射劑量。
[0046] 本發(fā)明構(gòu)建的遲鈍愛德華氏菌保護(hù)性抗原FbaA，免疫斑馬魚和大菱鲆所獲得的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果說明抗原蛋白FbaA有較好的免疫與交叉免疫保護(hù)作用。同時(shí)，對(duì)于亞單位疫苗開發(fā) 而言，F(xiàn)baA也將作為后續(xù)疫苗設(shè)計(jì)的優(yōu)選靶點(diǎn)。
[0047] 本發(fā)明的疫苗，可以被制備成藥盒或試劑盒的形式，以便于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用。 可選地在其中還包括使用說明書。
[0048] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0049] 實(shí)施例1、重組蛋白疫苗的制備
[0050] 實(shí)驗(yàn)材料
[0051] 1、菌株和質(zhì)粒
[0052] 大腸桿菌 Escherichia coli DH5a、大腸桿菌 E. coli BL21(DE3)購自 天根生化科技（北京）有限公司；遲鈍愛德華氏菌E. tarda EIB202,保藏號(hào)為： CCTCC_M208068(Edwardsiella tarda EIB202,肖婧凡等，"Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda from mariculture in China"，《Aquaculture Research》Vol. 40,2009);獲弧菌 V.anguillarum MVM425(分離于花 S盧，Wu，H. Z. , Ma, Y. , Zhang, Η. Z. and Zhang, Y. X. (2004) Complete sequence of virulence plasmid from the marine fish pathogen Vibrio anguillarum strain MVM425and location of its replication region. J Appl Microbio97, 1021-1028)，嗜水氣單 胞菌 A. hydrophila LSA34(分離于淡水魚，Zhou，L· Υ·，Wang，Χ· Η·，Liu，Q.，Wang，Q. Y. , Zhao, Y. and Zhang, Y. X. (2010) A novel multivalent vaccine based on secretary antigen-delivery induces protective immunity against Vibrio anguillarum and Aeromonas hydrophila.J Biotechnoll46, 25-30)，哈維氏弧菌V.harveyi VIB647(分離于 海涯，Zhang，X. H.，Meaden，P. G. and Austion，B. (2001)Duplication of hemolysin genes in a virulent isolate of Vibrio harveyi. Appl Environ Microbiol67, 3161-3167.), 溶藻弧菌 V. alginolyticus EPGS020401 (分離于點(diǎn)帶石斑魚，Rui，Η. P.，Liu，Q.，Wang，Q. Y. , Ma, Y. , Liu, H. , Shi, C. B. and Zhang, Y. X. (2009) Role of alkaline serine protease Asp in Vibrio alginolyticus virulence and regulation of its expression by LuxO-LuxR regulatory system. J Microbiol Biotechnoll9, 431 - 438)，pET28a(+)載體 購自寶生物工程（大連）有限公司。
[0053] 2、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
[0054] LB培養(yǎng)基：1% (w/v)蛋白胨，0. 5% (w/v)酵母提取物，1% (w/v)NaCl。固體培養(yǎng) 基加入2% (w/w)瓊脂。121°C高壓滅菌20min。用于大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌E.taixla EIB202、嗜水氣單胞菌A. hydrophila LSA34的培養(yǎng)。
[0055] LB20培養(yǎng)基：1% (w/v)蛋白胨，0. 5% (w/v)酵母提取物，2% (w/v)NaCl。固體培 養(yǎng)基加入2% (w/w)瓊脂。12rC高壓滅菌20min。用于鰻弧菌V.anguillarum MVM425、哈 維氏弧菌 V.harveyi VIB647、溶藻弧菌 V. alginolyticus EPGS020401 的培養(yǎng)。
[0056] DHL培養(yǎng)基：60g膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基溶于1L去離子水中，反復(fù)煮沸溶解至澄清，冷 卻后制作平板。
[0057] 培養(yǎng)條件：
[0058] 大腸桿菌在37°C LB固體培養(yǎng)基中平板靜置培養(yǎng)或LB液體培養(yǎng)基中搖床震蕩培 養(yǎng)。
[0059] 遲鈍愛德華氏菌與嗜水氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基，SCTCdOOi'/min過夜振 搖；鰻弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌接種于LB20培養(yǎng)基，SCTCdOOi'/min過夜振搖。遲鈍愛 德華氏菌液涂布或劃線于DHL固體培養(yǎng)基上，倒置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，在DHL固 體培養(yǎng)基上形成邊緣半透明的黑心菌落；嗜水氣單胞菌涂布或劃線于LB固體培養(yǎng)基上，倒 置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；鰻弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌涂布或劃線于LB20固體 培養(yǎng)基上，倒置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
[0060] 3、實(shí)驗(yàn)試劑
[0061] 常規(guī)分子生物學(xué)試劑及試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切 酶BamH I，Xho I購自寶生物工程（大連）有限公司。蛋白表達(dá)及純化常規(guī)試劑，購自上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。親和層析介質(zhì)Ni-S印harose FF購自GE Healthcare。 抗大菱鲆IgM的單克隆抗體購自Aquatic Diagnostics,羊抗鼠單克隆抗體購自Tiangen。
[0062] 生理海水配方：配制1升生理海水，每升含：NaC120g，MgCl2 · 2H204. 8g， MgS04 · 7Η203· 5g，KC10. 7g，NaHC030. llg，CaCl2 · 2Η201· 208g。
[0063] 4、抗原蛋白基因序列
[0064] 根據(jù)E. tarda EIB202全基因組序列，得到相應(yīng)fbaA基因的DNA序列。其氨基酸 序列見圖 1(SEQ ID N0:1)。
[0065] 5、抗原蛋白引物
[0066] 用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)fbaA基因的特異性引物，引物經(jīng)上海生物工程公司 合成，為PAGE純化產(chǎn)物。
[0067] fbaAF ：CGCGGATCCATGTCTAAAATCTTTGACTTT(BamH I)(SEQ ID NO:2)；
[0068] fbaAR ：CCGCTCGAGCAGCACGTCGATGCAG(Xho I) (SEQ ID N0:3)〇
[0069] 6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及免疫試劑
[0070] 斑馬魚，購于上海養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)4cm，體重約0.4g。實(shí)驗(yàn)前先置于水族箱內(nèi)適應(yīng)馴 養(yǎng)2周，后移至魚飼養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)2周。魚飼養(yǎng)系統(tǒng)每天流動(dòng)更換水體，養(yǎng)殖溫度22°C左右。 每天喂養(yǎng)2次并及時(shí)清除糞便殘?jiān)?br> [0071] 大菱鲆，購于山東濰坊養(yǎng)殖場(chǎng)，體重30g，體長(zhǎng)10cm，置于水槽內(nèi)適應(yīng)馴養(yǎng)2周，備 用。實(shí)驗(yàn)中每天使用天然海水替換2/3體積養(yǎng)殖水并充氣，水溫14-16°C。免疫接種前后按 照常規(guī)的養(yǎng)殖程序管理。
[0072] 魚用麻醉劑 tricaine methanesulphonate (MS-222)購于 Sigma 公司。魚用佐劑 M0NTANIDE?ISA763A，購買于法國(guó) SEPPIC 公司。
[0073] 實(shí)施例1、用于制備疫苗的抗原的篩選
[0074] 本發(fā)明利用反向疫苗學(xué)方法進(jìn)行前期候選疫苗篩選。
[0075] 基于反向疫苗學(xué)基本原理，采用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)遲鈍愛德華氏菌全基因組 序列進(jìn)行分析。
[0076] 遲鈍愛德華氏菌EIB202分離自山東煙臺(tái)大菱鲆病灶組織，進(jìn)行其全基因組測(cè)序， 該菌基因組序列全長(zhǎng)3. 7Mbp，約含3500個(gè)開放閱讀框，其中包括由53個(gè)開放閱讀框構(gòu)成的 質(zhì)粒?；谌蚪M序列的候選抗原蛋白分析預(yù)測(cè)流程如圖7。
[0077] 對(duì)遲鈍愛德華氏菌強(qiáng)毒株EIB202全基因組序列分析后獲得3486個(gè)開放閱讀框， 利用TMMHM軟件分析其編碼產(chǎn)物的跨膜螺旋和跨膜次數(shù)，去除跨膜螺旋結(jié)構(gòu)大于2的蛋白， 進(jìn)一步利用PS0RT程序進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析，最終獲得蛋白530個(gè)，包括細(xì)胞膜外蛋白 質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)I吳蛋白和分泌蛋白等。
[0078] 對(duì)所得候選蛋白進(jìn)行篩選，同時(shí)分析上述蛋白的粘附情況；分析各蛋白與斑馬魚 及大菱鲆MHC I分子的結(jié)合能力，避免產(chǎn)生自身免疫；篩選免疫效率高的同源蛋白，最終獲 得275個(gè)候選抗原蛋白。
[0079] 以斑馬魚動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析候選抗原蛋白的免疫保護(hù)率。PBS緩沖液稀釋候選抗原蛋 白溶液至lmg/ml，候選抗原蛋白與ISA763A油性佐劑以3:7的比例混合，使最終免疫劑量 為1.5 μ g/尾。免疫周期4周，按照預(yù)攻毒確定的攻毒劑量攻毒。攻毒2?3天后斑馬魚 出現(xiàn)潰瘍現(xiàn)象，并在3?7天內(nèi)達(dá)死亡高峰期。記錄斑馬魚死亡情況，直至斑馬魚體表潰瘍 痊愈，游動(dòng)攝食等生理指標(biāo)趨于穩(wěn)定，結(jié)束記錄（一般要20日左右），根據(jù)公式計(jì)算出候選 抗原蛋白的相對(duì)免疫保護(hù)率。
[0080] 通過上述過程，對(duì)遲鈍愛德華氏菌強(qiáng)毒株EIB202的候選保護(hù)性抗原進(jìn)行了大規(guī) 模的廣篩，測(cè)定了多個(gè)候選抗原蛋白的相對(duì)免疫保護(hù)率，如表1。
[0081] 表1、斑馬魚免疫攻毒實(shí)驗(yàn)鑒定遲鈍愛德華氏菌候選保護(hù)性抗原蛋白的RPS
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶的用途，其特征在于，用于制備保護(hù)魚類免受致 病菌感染的疫苗。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的致病菌包括：遲鈍愛德華氏 菌（E. tarda)，鰻弧菌（V. angui 1 larum),嗜水氣單胞菌（A. hydrophila)，哈維氏弧菌 (V. harveyi)，溶藻弧菌（V. alginolyticus)。
4. 一種保護(hù)魚類免受致病菌感染的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包括：愛德華氏菌 1，6-二磷酸果糖醛縮酶和有效量的免疫佐劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶 與免疫佐劑的比例是1: (1-5);較佳地比例是1: (1. 5-4);更佳地比例是1: (2-3);進(jìn)一步 更佳地是1: (2-2. 5)。
6. 如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的免疫佐劑是M0NTANIDE?ISA763A。
7. 制備權(quán)利要求5或6所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：將愛德華氏菌 1，6-二磷酸果糖醛縮酶和有效量的免疫佐劑混合，獲得所述的疫苗。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的愛德華氏菌1，6-二磷酸果糖醛縮酶 與免疫佐劑的比例是1: (1-5);較佳地比例是1: (1. 5-4);更佳地比例是1: (2-3);進(jìn)一步 更佳地是1: (2-2. 5)。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的免疫佐劑是M0NTANIDE?ISA763A。
10. -種保護(hù)魚類免受致病菌感染的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包含權(quán)利要 求4-6任一所述的疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/02GK104208665SQ201410200936
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】吳海珍, 沈斌兵, 孫忠洋, 王啟要, 肖婧凡, 張?jiān)d 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)