一株ι-卡拉膠降解菌及其發(fā)酵方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株ι-卡拉膠降解菌及其發(fā)酵方法和應(yīng)用，涉及一種嗜纖維素菌屬的細(xì)菌。ι-卡拉膠降解菌（Cellulophaga?sp.）KL-A的保藏編號(hào)為CGMCC?No：8694。ι-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法：將活化的ι-卡拉膠降解菌（Cellulophaga?sp.）KL-A涂布于ι-卡拉膠固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液；按1%～5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)，得發(fā)酵上清液；4℃條件下，將所得發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析和DEAE-纖維素層析，透析除鹽，真空冷凍干燥，得到ι-卡拉膠水解酶。ι-卡拉膠寡糖可在制備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等中應(yīng)用。
【專利說明】一株1-卡拉膠降解菌及其發(fā)酵方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種嗜纖維素菌屬的細(xì)菌，特別是涉及一株t -卡拉膠降解菌及其發(fā)酵方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]卡拉膠(Carrageenan)，又名鹿角膠、角叉膠等，是從紅藻中提取的一種高分子親水性多糖，以重復(fù)的α-(1 — 4)-D_半乳吡喃糖-β-(1 — 3)-D_半乳吡喃糖(或3，6內(nèi)醚-D-半乳吡喃糖)二糖單元為基本骨架連接而成。根據(jù)是否含有3，6內(nèi)醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基的含量以及硫酸基在分子中的位置不同，將卡拉膠主要分為K-、λ-、t -3族。
[0003]卡拉膠因具有優(yōu)良的熱可逆凝膠化、抗蛋白凝膠、親水無毒等性能而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。目前卡拉膠已廣泛應(yīng)用于果凍、軟糖、冰淇淋、肉制品、啤酒等食品工業(yè)中，主要作用表現(xiàn)在凝膠、增稠和蛋白反應(yīng)性3個(gè)方面。隨著人們對(duì)卡拉膠結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的深入，其應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用變得日益廣泛。
[0004]已有研究成果表明，卡拉膠具有多種生物活性，如抗凝血、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等，但由于卡拉膠相對(duì)分子質(zhì)量過大，使其溶解性和吸收性受到影響，限制了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用?？ɡz寡糖與之相比，相對(duì)分子質(zhì)量較小，溶解性、穩(wěn)定性和安全性都有所增加，且生物活性也具有一定程度的提高。
[0005]目前降解卡拉膠的方法有物理法、化學(xué)法、酶解法。其中酶降解法是制備寡糖的一個(gè)重要途徑，由于其具有特異性，可選擇性地酶解切斷糖鏈上的特定位點(diǎn)，從而制得特定的寡糖；并且反應(yīng)條件溫和，降解過程易于控制，在多糖降解中的運(yùn)用日益增多。目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)卡拉膠寡糖進(jìn)行的研究，已有成果表明卡拉膠寡糖在功能性食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。因此，利用從海洋微生物中提取到的卡拉膠降解酶制備卡拉膠低分子量活性片段，成為卡拉膠工業(yè)高值化研究的重要方向。尋找具有能降解卡拉膠的菌種是十分必要的。
[0006]中國專利CN1544623公開一種K 一卡拉膠降解酶及其制備方法和應(yīng)用，一種酶能使K 一卡拉膠降解，用于制備卡拉膠低聚糖，能夠降解K 一卡拉膠的β — 1，4 一糖苷鍵，故亦稱為K 一卡拉膠降解酶，該酶的分子量為30，OOODa。制備該酶時(shí)，將海洋噬纖維菌用2216E培養(yǎng)基28 - 35°C搖瓶培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液離心獲得發(fā)酵酶液，將酶液超濾濃縮后，以40 % — 80 %的(NH4) 2S04鹽析收集沉淀蛋白，冷凍干燥。
[0007]中國專利CN102994408A公開一種卡拉膠降解菌及其發(fā)酵方法和應(yīng)用，涉及一種新土地桿菌屬的細(xì)菌，其命名為卡拉膠降解菌13-Q,即Pedobacter hainanensis sp.13-Q,該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCN0.5564。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的第一目的在于提供一株能分泌卡拉膠降解酶的菌株。[0009]本發(fā)明的第二目的在于提供一種t -卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法。
[0010]本發(fā)明的第三目的在于提供^ -卡拉膠寡糖在制備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等中應(yīng)用。
[0011]所述能分泌卡拉膠降解酶的菌株為1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A,分離自福建省東山島，菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No:86940菌落形態(tài)特征為:在
1-卡拉膠固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落黃色，圓形，表面略突起，光滑，反光，不透明，短桿狀，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性，不生孢，可運(yùn)動(dòng)。
[0012]菌株的生理學(xué)特征為:生長(zhǎng)需要NaCl，無NaCl時(shí)幾乎不能生長(zhǎng)，高濃度的NaCl抑制其生長(zhǎng)，0.2%的^ -卡拉膠能促進(jìn)卡拉膠降解酶的產(chǎn)生。最適生長(zhǎng)溫度為28~32°C。
[0013]根據(jù)16S rRNA序列分析比對(duì)結(jié)果,所述的菌株鑒定為Cellulophaga sp.KL-A。
[0014]遺傳學(xué)特征:所述！-卡拉膠降解菌的16S rRNA堿基序列，序列共1075bp。
[0015]與Genebank國際基因序列數(shù)據(jù)庫記錄的最相似的菌株Cellulophaga Iytica的相似性為99%。
[0016]所述一種t -卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0017]I)將活化的1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A涂布于ι_卡拉膠固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落接入 種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液；
[0018]2)按1%~5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)，得發(fā)酵上清液；
[0019]3)4°C條件下，將步驟2)所得發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析和DEAE-纖維素層析，透析除鹽，真空冷凍干燥，得到1-卡拉膠水解酶。
[0020]在步驟I)中，所述t -卡拉膠固體培養(yǎng)基的組成為:質(zhì)量濃度為0.5%~1%的碳源，0.3%~0.5%的氮源，2%的氯化鈉，0.5%的硫酸鎂，0.1%的氯化鈣，0.03%的硫酸亞鐵，0.1%的磷酸氫二鉀，0.2%的t -卡拉膠的水溶液；所述碳源可選自葡萄糖，甘油，半乳糖，蔗糖，乙酸鈉，淀粉等中的一種，優(yōu)選葡萄糖；所述氮源可選自蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，硫酸銨，硝酸鈉，尿素等中的一種，優(yōu)選酵母粉；所述培養(yǎng)的條件可為30°C，200rpm培養(yǎng)30h。
[0021]在步驟2)中，所述搖床培養(yǎng)的條件可為30°C，200rpm搖床培養(yǎng)30h。
[0022]所述t -卡拉膠水解酶降解t -卡拉膠，降解產(chǎn)物為2個(gè)t -卡拉膠寡糖，聚合度分別為2~4糖和6~10糖。
[0023]所述t -卡拉膠寡糖可在制備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等中應(yīng)用。海水養(yǎng)殖中，對(duì)蝦的存活率能提高20%~30%。
[0024]本發(fā)明具有以下技術(shù)效果:
[0025]1、1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A在ι _卡拉膠的誘導(dǎo)下合成ι -卡拉膠水解酶，單因子篩選得到最佳碳氮源分別是葡萄糖和酵母粉。通過響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，獲得的ι -卡拉膠水解酶活力達(dá)到226.73U/mL。與國內(nèi)外已報(bào)道的相比，所述的^ -卡拉膠降解菌水解酶生產(chǎn)能力大為提高，具有一定開發(fā)前景。
[0026]2、本發(fā)明提供的^ -卡拉膠降解菌能穩(wěn)定的產(chǎn)生較高含量的水解酶，利用此水解酶能夠制備與其他細(xì)菌不同聚合度的卡拉膠寡糖。
[0027]3、本發(fā)明提供的t -卡拉膠水解酶的分子量為70kD，專一性水解t -卡拉膠，不能水解K -卡拉膠、λ -卡拉膠、瓊膠，纖維素，幾丁質(zhì)和淀粉，水解的產(chǎn)物最終為2~8糖，得到的1-卡拉膠寡糖具有很高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0028]4、本發(fā)明提供的t -卡拉膠水解酶具有一定的熱穩(wěn)定性，42°C熱處理Ih能保持90%的酶活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為ι -卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.) KL-A降解ι_卡拉膠產(chǎn)物的薄層層析圖。
[0030]圖2為ι -卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.) KL-A在ι_卡拉膠平板上的降解效果(降解圈)。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1
[0032]ι -卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.) KL-A的分離純化。
[0033]采集福建省東山島附近海域的新鮮活體海藻葉片后，加入無菌海水清洗，放入初篩培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)2~3天。將培養(yǎng)液在含有初篩培養(yǎng)基的瓊脂平板上劃線，培養(yǎng)3天。將在瓊脂平板上形成透明圈的菌落轉(zhuǎn)移到新的瓊脂平板上培養(yǎng)，重復(fù)劃線，直至獲得純培養(yǎng)物。初篩培養(yǎng)基成分(質(zhì)量體積比):ι -卡拉膠0.2%，NaCll.5%，NaNO30.2%，MgSO4.7Η200.05%, CaC120.01%，磷酸鐵 0.005%, pH 值 7.5。
[0034]將初篩分離到的純培養(yǎng)物接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)液在復(fù)篩固體培養(yǎng)基上劃線，將產(chǎn)生最大降解圈的菌落挑取出來進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。所有篩選出來的菌株，分離純化后保存。
[0035]復(fù)篩培養(yǎng)基成分(質(zhì)量體積比):ι -卡拉膠0.2%，酵母粉0.1%，NaCl 1.5%，NaNO30.2%, MgSO4.7Η200.05%, CaCl20.01%,磷酸鐵 0.005%, pH 值 7.5。
[0036]實(shí)施例2 [0037]單因子篩選碳氮源
[0038]1、分別選取幾種不同的碳源，濃度為10g/L，以5g/L的蛋白胨作為固定氮源，另加2g/L的！-卡拉膠和15g/L的NaCl，配制培養(yǎng)基，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)48h，DNS法測(cè)酶活,碳源對(duì)ι -卡拉膠水解酶發(fā)酵的影響如表1所示,葡萄糖為最佳碳源。
[0039]表1
[0040]
mmI葡萄糖__[￥1 I半乳糖?β I乙酸納~[?
酶活力(u/mg) 287.6 201.3 234.7 168.2171.1 168.2
[0041]2、以15g/L葡萄糖為固定碳源,分別選取幾種不同的氮源,濃度為5g/L,另加2g/L的ι -卡拉膠和15g/L的NaCl，配制培養(yǎng)基，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,培養(yǎng)48h，DNS法測(cè)酶活,氮源對(duì)ι -卡拉膠水解酶發(fā)酵的影響如表2所示,酵母粉為最佳氮源。
[0042]表2[0043]
【權(quán)利要求】
1.一株1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A,菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No:86940
2.—種t -卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將活化的1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A涂布于ι_卡拉膠固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液； 2)按1%~5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)，得發(fā)酵上清液； 3)4°C條件下，將步驟2)所得發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析和DEAE-纖維素層析，透析除鹽，真空冷凍干燥，得到1-卡拉膠水解酶。
3.如權(quán)利要求2所述一種^-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟I)中，所述1-卡拉膠固體培養(yǎng)基的組成為:質(zhì)量濃度為0.5%~1%的碳源，0.3%~0.5%的氮源，2%的氯化鈉，0.5%的硫酸鎂，0.1%的氯化鈣，0.03%的硫酸亞鐵，0.1%的磷酸氫二鉀，0.2%的1-卡拉膠的水溶液。
4.如權(quán)利要求3所述一種^-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述碳源選自葡萄糖，甘油，半乳糖，蔗糖，乙酸鈉，淀粉中的一種，優(yōu)選葡萄糖。
5.如權(quán)利要求3所述一種^-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述氮源選自蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，硫酸銨，硝酸鈉，尿素中的一種，優(yōu)選酵母粉。
6.如權(quán)利要求2 所述一種^-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養(yǎng)的條件為30°C，200rpm培養(yǎng)30h。
7.如權(quán)利要求2所述一種^-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟2)中，所述搖床培養(yǎng)的條件為30°C，200rpm搖床培養(yǎng)30h。
8.如權(quán)利要求2~7中任一所述一種t-卡拉膠水解酶的生產(chǎn)方法所生產(chǎn)的^ -卡拉膠水解酶在制備降解產(chǎn)物中的應(yīng)用，所述降解產(chǎn)物為1-卡拉膠寡糖。
9.如權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于所述^-卡拉膠寡糖包括聚合度為2~4糖的1-卡拉膠寡糖和聚合度為6~10糖的t -卡拉膠寡糖。
10.如權(quán)利要求8或9所述應(yīng)用，其特征在于所述^-卡拉膠寡糖在制備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P37/02GK103789241SQ201410043525
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】邵宗澤, 單大鵬, 李旭, 古錚, 應(yīng)見喜 申請(qǐng)人:國家海洋局第三海洋研究所