治療血紅蛋白病的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供治療諸如地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病的血紅蛋白病的組合物和方法。組合物和方法包含/包括一種或多種內(nèi)切核酸酶或內(nèi)切核酸酶融合蛋白，該內(nèi)切核酸酶或內(nèi)切核酸酶融合蛋白包括一種或多種歸巢內(nèi)切核酸酶和/或歸巢內(nèi)切核酸酶融合蛋白和/或CRISPR內(nèi)切核酸酶和/或CRISPR內(nèi)切核酸酶融合蛋白：(a)以破壞Bel11a編碼區(qū)；(b)以破壞Bel11a基因調(diào)節(jié)區(qū)；(c)以修飾成人β-球蛋白基因座；(d)以破壞HbF沉默DNA調(diào)節(jié)元件或通路，諸如Bel11a-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)；(e)以突變一種或多種γ-球蛋白基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)γ-球蛋白基因表達(dá)增加；(f)以突變一種或多種δ-球蛋白基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)δ-球蛋白基因表達(dá)增加；和/或(g)以修正一種或多種β-球蛋白基因突變。
【專利說明】治療血紅蛋白病的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請作為PCT國際專利申請于2013年2月22日提交，并要求2012年2月24 日提交的美國臨時(shí)專利申請No. 61/603, 231的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容在此以全文引用的方式 并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請包括作為txt文件的電子形式的序列表，其標(biāo)題是"序列表 54428. 0006W0U1_ST25"并于2013年2月22日創(chuàng)建并且其大小為174千字節(jié)（KB)。所述 txt文件"序列表54428. 0006W0U1_ST25"的內(nèi)容通過引用方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本公開總體涉及遺傳病的治療。更具體地，本公開提供用于改變球蛋白基因表達(dá) 的基于內(nèi)切核酸酶的組合物和方法，包括基于歸巢內(nèi)切核酸酶和基于Cas9內(nèi)切核酸酶的 組合物和方法，所述組合物和方法用于治療地中海貧血、鐮狀細(xì)胞病和其它血紅蛋白病。

【背景技術(shù)】
[0006] 血紅蛋白病，諸如地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病，是在全球?qū)е嘛@著健康負(fù)擔(dān)的非常 普遍的紅細(xì)胞遺傳病。每年有超過1，300, 000名患有嚴(yán)重血紅蛋白病癥的患者出生。當(dāng)全 球人口的5%是攜帶者時(shí)，對于臨床顯著形式的地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病（SCD)的出生率 分別是〇. 44個(gè)/千人和1. 96個(gè)/千人。
[0007] 在正常狀態(tài)下，哺乳動(dòng)物紅系細(xì)胞中存在的血紅蛋白主要由兩條α樣鏈（多肽） 和兩條β樣鏈的異源四聚體構(gòu)成。所述β_球蛋白基因座的五個(gè)基因以簇的形式位于染 色體11上。所述基因在紅系細(xì)胞中表達(dá)，并且伴隨發(fā)育在特異性位置進(jìn)行；所述ε、A Υ 和GY、及δ和β基因主要分別在胚胎期、胎兒期和產(chǎn)后期表達(dá)。出生時(shí)95%的β樣 鏈?zhǔn)铅?，剩下的是β。這一比率在出生后第一年逐漸轉(zhuǎn)變，這解釋了為什么限于β_球 蛋白基因的表型諸如鐮狀細(xì)胞和大多數(shù)β_地中海貧血直到數(shù)月大時(shí)才表現(xiàn)出來。基于 染色體16的α樣基因的表達(dá)不同；胚胎ζ-基因與ε的表達(dá)對應(yīng)，但是成對的α-基 因從胎兒期開始表達(dá)。因此，α異常在子宮內(nèi)表現(xiàn)，潛在地伴有毀滅性的結(jié)果（如胎兒水 腫）。所得的α -異源四聚體、β -異源四聚體伴隨發(fā)育表達(dá)；胚胎：Hb Gowerl ( ζ 2, ε 2)、 Hb Gower2(a2，e2)和 Hb ?〇竹1&11(1((2，￥2);胎兒：冊卩（胎兒）（〇2，￥2)以及成人 ： HbA2 ( a 2, δ 2)和 HbA (成人）（a 2, β 2)。
[0008] β-地中海貧血的起因是成人β-球蛋白基因座的異常，進(jìn)而導(dǎo)致β樣球蛋白鏈 與α樣鏈的異常化學(xué)計(jì)量，造成未配對的α樣鏈沉淀。地中海貧血的嚴(yán)重程度直接與該 球蛋白鏈的不平衡度相關(guān)。接下來通過數(shù)條通路介導(dǎo)的損傷（包括細(xì)胞蛋白和膜蛋白的氧 化）的最終結(jié)果是無效的紅細(xì)胞生成、凋亡和紅細(xì)胞存活減少。已經(jīng)描述了導(dǎo)致β_地中 海貧血的超過200個(gè)突變。
[0009] 鐮狀細(xì)胞病的起因是球蛋白基因內(nèi)的單核苷酸置換，進(jìn)而造成谷氨酸被纈氨 酸在肽的第6位氨基酸處所置換，產(chǎn)生i3S。與正常成人血紅蛋白（HbA)相反，攜帶該突變 的血紅蛋白S(a 2, β S2)被稱為HbS。在低氧濃度的情況下，HbS發(fā)生別構(gòu)變化，在別構(gòu)位 點(diǎn)處其可聚合。脫氧形式的血紅蛋白在E和F螺旋之間的蛋白上呈現(xiàn)疏水補(bǔ)丁。在血紅蛋 白β -鏈的第6位處的疏水性纈氨酸形成疏水補(bǔ)丁，所述疏水補(bǔ)丁可與其它血紅蛋白S分 子的疏水補(bǔ)丁相結(jié)合，導(dǎo)致血紅蛋白S分子聚集并形成纖維沉淀，繼而引起紅細(xì)胞變?yōu)殓?刀狀并導(dǎo)致數(shù)條通路變化，這通過血管堵塞和溶血導(dǎo)致組織損傷。
[0010] 盡管β -地中海貧血和鐮狀細(xì)胞?。⊿⑶）分別是β -球蛋白基因座的定量病癥和 定性病癥，但正常β樣球蛋白基因的表達(dá)可改善這兩種疾病。在地中海貧血中，任何對球 蛋白鏈不平衡的改進(jìn)都可為每個(gè)細(xì)胞提供選擇優(yōu)勢，并產(chǎn)生臨床效益。在鐮狀細(xì)胞病中，正 ?；蚰承┩蛔兊摩聵渔湹拇嬖诳赏ㄟ^比突變的鐮狀細(xì)胞鏈更有效地競爭a樣鏈從而減少 HbS的量，通過形成阻斷Hbs (如HbF)的聚合的血紅蛋白和增加每個(gè)細(xì)胞非鐮變血紅蛋白的 量，來改善臨床表型。例如，在鐮狀細(xì)胞病中，僅8%的胎兒血紅蛋白（HbF)水平可抑制HbS 聚合，這導(dǎo)致存活率提高，而20%的HbF水平提供近乎完全的表型校正。重要的是，含有正 常HbA的供體紅系細(xì)胞的后代在造血干細(xì)胞移植（HSCT)之后具有超過含HbS的內(nèi)源來源 的細(xì)胞的較強(qiáng)選擇性優(yōu)勢。在骨髓中有11 %供體細(xì)胞的患者具有35%的供體BFUe和73% 的供體紅細(xì)胞，這導(dǎo)致輸血獨(dú)立性。因此，修正相對小部分的移植HSC具有臨床益處。
[0011] 嚴(yán)重型地中海貧血需要慢性輸血，這導(dǎo)致鐵過量。盡管費(fèi)用、副作用和依從性嚴(yán)重 限制了功效，但存活率與螯合功效直接相關(guān)。FDA批準(zhǔn)的唯一針對SCD的藥物是羥基脲，其 可降低發(fā)病率和死亡率。然而，該治療劑量過小，依從性差，且其不能完全保護(hù)健康。
[0012] 對于每年數(shù)以千計(jì)的患有惡性血液病和相關(guān)病癥的患者來說，造血細(xì)胞移植 (HCT)是重要的治療選擇。根據(jù)國際血液和骨髓移植研究中心（CIBMTR)，在2009年進(jìn)行了 大約60, 000例移植，與過去的十年相比每年增加超過15, 000例的移植。移植的有效性也 增加了，更多的近期結(jié)果表明復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)、非復(fù)發(fā)的死亡率和總死亡率顯著降低。Gooley 等，N. Engl. J. Med 363:2091-101(2011)。
[0013] 來自HLA-匹配的同胞或不相關(guān)的供體的同種異體造血細(xì)胞移植（HCT)治愈了患 有血紅蛋白病的患者，但受限于對適度匹配的相關(guān)或不相關(guān)供體的需要，且并發(fā)移植物抗 宿主?。℅VHD)和感染。此外，主要障礙是高移植失敗率，其高于對惡性腫瘤HCT所觀察到 的移植失敗率?？商娲姆椒òㄓ霉w臍帶血細(xì)胞進(jìn)行HCT，因?yàn)閹缀跛谢颊叩哪殠а?供體可被鑒別。額外的實(shí)驗(yàn)方法著重于使用患者自身的造血干細(xì)胞（HSC)并誘導(dǎo)內(nèi)源球蛋 白基因表達(dá)，或添加外源β樣球蛋白基因。
[0014] 對于許多不能找到供體的患者特別是那些少數(shù)族裔或混血背景的患者來說，臍帶 血（CB)移植可最有希望治愈疾病。作為供體干細(xì)胞（在出生時(shí)易于收集，且母親或嬰兒沒 風(fēng)險(xiǎn)）的來源，CB的優(yōu)點(diǎn)還為易于獲取和可安全用于HLA-不匹配的情況而不增加 GVHD風(fēng) 險(xiǎn)。
[0015] 不幸地是，幾種因素，包括在許多臍帶血單元可獲得的低細(xì)胞劑量，導(dǎo)致在成人和 較大兒童中植入緩慢和移植相關(guān)死亡率升高。嗜中性粒細(xì)胞和血小板的顯著延遲的造血功 能重建對于臍血移植（CBT)接受者是已知的風(fēng)險(xiǎn)因素，并且與在單份或雙份CB移植物中提 供的低的總有核細(xì)胞（TNC)和CD34+細(xì)胞劑量有關(guān)。類似地，這些低的細(xì)胞數(shù)與較高的移 植失敗率相關(guān)，因此存在移植失敗高風(fēng)險(xiǎn)的血紅蛋白病特別受到關(guān)注。實(shí)際上，最近對成人 單份CBT接受者的分析表明輸注的CD34+細(xì)胞劑量是骨髓樣植入最重要的預(yù)測物。
[0016] 當(dāng)與匹配和不匹配的不相關(guān)供體接受者相比時(shí)，非復(fù)發(fā)性死亡率（NRM)在雙份 CBT (dCBT)接受者中最高。Brunstein 等，Blood U6 :4693-9(2010) 〇 大部分 NRM 在移植 后的前100天內(nèi)發(fā)生，其中感染是最常見死因。重要的是，對dCBT接受者中的NRM風(fēng)險(xiǎn)因 素進(jìn)行的分析顯示，如果恢復(fù)> 26天（即，植入dCBT接受者的中值時(shí)間），則骨髓樣恢復(fù) 延遲（嗜中性細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)（ANC) >500/ml所需的時(shí)間）的患者具有較高的風(fēng)險(xiǎn)。然而，當(dāng) 對NRM風(fēng)險(xiǎn)因素的分析限制為僅包括那些在第26天前移植的dCBT接受者時(shí)，未發(fā)現(xiàn)各種 供體來源之間存在差異，這就突出了延遲植入對NRM風(fēng)險(xiǎn)增加的重要作用。
[0017] 此外，在干細(xì)胞移植后給定的任何一天>100的ANC此前已經(jīng)顯示是在移植后第 100天之前死亡率風(fēng)險(xiǎn)降低的重要閥值（Offner等，Blood型：4058-62(1996))。因此，在 CBT接受者中觀察到的骨髓樣恢復(fù)的顯著延遲仍然是CBT情況下獲得成功結(jié)果的主要障 礙。不僅增加可用于移植的CB祖細(xì)胞的絕對數(shù)量的能力，而且增加可可靠產(chǎn)生移植后骨髓 樣更快速恢復(fù)的細(xì)胞的能力，都應(yīng)能改進(jìn)進(jìn)行CBT的患者的總存活?？砷_發(fā)利用臍帶血干/ 祖細(xì)胞離體擴(kuò)增的策略以克服臍帶血移植物中可用的細(xì)胞劑量較低，目的是增強(qiáng)CBT的造 血恢復(fù)和總存活。
[0018] 為了克服在用臍帶血（CB)移植之后發(fā)生的嗜中性粒細(xì)胞恢復(fù)顯著延遲，已經(jīng)研 究了 Notch信號傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞的離體擴(kuò)增中的作用，以產(chǎn)生數(shù)量增加的 能夠在體內(nèi)快速再生的祖細(xì)胞。已經(jīng)開發(fā)了使用工程化的Notch配體（δ 1)的臨床上可行 的方法，該方法使得⑶34+細(xì)胞的絕對數(shù)量呈多對數(shù)增長（multi-log increase)并且產(chǎn)生 能夠在體內(nèi)快速再生的細(xì)胞療法。
[0019] 與一個(gè)即時(shí)性組的29名用兩種非操作性的CB單元進(jìn)行相同治療的患者所需的25 天的中值時(shí)間（P〈〇. 0001)相比，擴(kuò)增的、HLA-部分匹配細(xì)胞的輸注導(dǎo)致獲得500/ml的初 始嗜中性粒細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)（ANC)的中值時(shí)間顯著降低至僅僅11天。盡管治療的患者的數(shù) 量較少（即η = 14)，但就本方法的安全和臨床可行性而言，仍表現(xiàn)出對骨髓樣恢復(fù)時(shí)間具 有顯著作用。
[0020] 盡管在三十多年間許多實(shí)驗(yàn)室投入了大量的資源，但在血紅蛋白病的治療方案開 發(fā)方面幾乎未取得進(jìn)展，主要?dú)w因于缺乏經(jīng)鑒別的可藥性靶和需要基因療法載體能夠以相 當(dāng)高的水平持續(xù)表達(dá)而不引起插入誘變。盡管胎兒血紅蛋白（HbF)的表達(dá)增加改善了這兩 種血紅蛋白病，但大量的研究并未基于此觀察產(chǎn)生可行的新藥劑。幾個(gè)研究人員正在推行 使用整合慢病毒載體的造血干細(xì)胞（HSC)基因療法。然而，HSC基因療法需要高水平的持 續(xù)表達(dá)并且具有潛在的插入誘變和白血病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0021] 本領(lǐng)域迫切需要的是展現(xiàn)出對治療包括地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病的血紅蛋白病 有改進(jìn)功效，同時(shí)克服現(xiàn)有治療形式的安全顧慮的組合物和方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本公開尤其通過提供治療血紅蛋白病的組合物和方法，闡明了本領(lǐng)域的這些和其 它相關(guān)需求。本文公開的組合物和方法采用編碼一種或多種內(nèi)切核酸酶或內(nèi)切核酸酶融合 蛋白的一種或多種多核苷酸，所述一種或多種內(nèi)切核酸酶或內(nèi)切核酸酶融合蛋白包括一種 或多種歸巢內(nèi)切核酸酶和/或歸巢內(nèi)切核酸酶融合蛋白和/或一種或多種CRISPR內(nèi)切核 酸酶（即聯(lián)合一種或多種RNA引導(dǎo)鏈的Cas9內(nèi)切核酸酶）和/或CRISPR內(nèi)切核酸酶融合 蛋白（即聯(lián)合一種或多種RNA引導(dǎo)鏈的Cas9內(nèi)切核酸酶融合蛋白）：(a)以破壞Bcllla編 碼區(qū)或BclIla基因調(diào)節(jié)區(qū)；(b)以破壞HbF沉默DNA調(diào)節(jié)元件或通路，諸如BclIla調(diào)節(jié)的 HbF沉默區(qū)；（c)以突變一種或多種Y-球蛋白基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)Y-球蛋白基因表達(dá)增 加；（d)以突變一種或多種δ-球蛋白基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)δ-球蛋白基因表達(dá)增加；和/或 (e)以修正一種或多種β-球蛋白基因突變。
[0023] 在第一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供包含/包括編碼一種或多種諸如歸巢內(nèi)切核酸 酶（HE)和/或CRISPR內(nèi)切核酸酶（即聯(lián)合一種或多種RNA引導(dǎo)鏈的Cas9內(nèi)切核酸酶） 的內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的組合物和方法，以實(shí)現(xiàn)對Bcllla編碼區(qū)或Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū) 內(nèi)的序列的靶向破壞，從而將諸如Y-球蛋白基因或ε-球蛋白基因的內(nèi)源基因的表達(dá)提 高至治療水平。在相關(guān)的方面，這些實(shí)施方案的組合物包含編碼一種或多種TALEN、一種或 多種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0024] 在第二個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供包含/包括多核苷酸的組合物和方法，所述多 核苷酸編碼諸如歸巢內(nèi)切核酸酶（HE)或CRISPR內(nèi)切核酸酶（即聯(lián)合一種或多種RNA引導(dǎo) 鏈的Cas9內(nèi)切核酸酶）的一種或多種內(nèi)切核酸酶以實(shí)現(xiàn)對β-球蛋白基因基因座內(nèi)的關(guān) 鍵調(diào)節(jié)序列的靶向破壞，從而將諸如Y-球蛋白基因或S-球蛋白基因的內(nèi)源基因的表達(dá) 提高至治療水平。在相關(guān)的方面中，這些實(shí)施方案的組合物包含編碼一種或多種TALEN、一 種或多種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0025] 在本實(shí)施方案的某些方面，提供靶向β_球蛋白基因基因座（于HG18中的 chrll:5212342-5215944)中的 3. 6kb 區(qū)（SEQ ID Ν0:1)的 HE 和 CRISPR 內(nèi)切核酸酶，所述 3. 6kb區(qū)含有調(diào)節(jié)蛋白Bcllla的結(jié)合位點(diǎn)。
[0026] 本文描述的歸巢內(nèi)切核酸酶和CRISPR內(nèi)切核酸酶與常規(guī)的基因靶向核酸酶相比 展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。因?yàn)闊o論基因型如何它們都廣泛有效，故本文描述的聯(lián)合一種或多種 RNA引導(dǎo)鏈的歸巢和Cas9內(nèi)切核酸酶并不具有患者特異性，它們在雜合的狀態(tài)下提供了臨 床益處并且避免載體序列插入。
[0027] 在第三個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供了組合物和方法，以用于經(jīng)由基因組編輯扼要 重述患者基因組中的一種或多種天然存在的突變，從而提供包括例如缺失或非缺失型遺傳 性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥（HPFH)的臨床益處。更具體地，本公開提供通過基因組編輯實(shí)現(xiàn)地 中海貧血和/或鐮狀細(xì)胞?。⊿CD)突變的直接修正的組合物和方法。
[0028] 在本實(shí)施方案的某些方面，將一種或多種歸巢內(nèi)切核酸酶與正?；蛞吧投嗪塑?酸序列（修正模板）聯(lián)用，以允許編輯和/或修復(fù)諸如β樣球蛋白基因的一種或多種基 因序列。這些歸巢內(nèi)切核酸酶允許通過包含一種或多種天然存在的突變的多核苷酸的瞬 時(shí)表達(dá)，修飾基因座（在本文中以人β-球蛋白基因基因座為例）中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)和/或編 碼序列。在相關(guān)的方面，這些實(shí)施方案的組合物包含編碼一種或多種TALEN、一種或多種 TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0029] 更具體地，本公開提供用于基因組編輯的包含/包括各自編碼HE和修正模板的一 種或多種多核苷酸的組合物和方法，其可用于在包括例如造血干細(xì)胞（HSC)、胚胎干（ES) 細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)的干細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生天然存在的突變?？蓪⒒蚪M編輯的HSC、 ES和iPSC (包括自體HSC和iPSC)移植給患者以治療諸如地中海貧血和/或鐮狀細(xì)胞病的 一種或多種血紅蛋白病。
[0030] 本文公開的組合物和方法允許在不需要外源基因持續(xù)表達(dá)或插入的情況下，通過 編碼HE (在有或沒有靶向模板的情況下）、Cas9內(nèi)切核酸酶和/或RNA引導(dǎo)鏈的多核苷酸 的瞬時(shí)表達(dá)，來有效修飾HSC、ES和iPSC，以在體內(nèi)成熟的紅系細(xì)胞和患者細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)血紅 蛋白病的改善。因?yàn)檫@些治療方法不需要轉(zhuǎn)基因的整合和/或持續(xù)表達(dá)，所以可消除與當(dāng) 前可用的基因治療技術(shù)有關(guān)的安全顧慮。
[0031] 在第四個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供用于遞送一種或多種歸巢內(nèi)切核酸酶和/或聯(lián) 合一種或多種RNA引導(dǎo)鏈的一種或多種Cas9內(nèi)切核酸酶的組合物和方法，所述酶的每一種 可在顯示出臨床益處的人靶區(qū)瞬時(shí)表達(dá)。本文描述的內(nèi)切核酸酶編碼序列可與TAL效應(yīng)器 核酸酶（TALEN)編碼序列聯(lián)合或融合表達(dá)。本文中列舉的是靶向影響胎兒血紅蛋白產(chǎn)生的 關(guān)鍵基因組區(qū)域的TAL效應(yīng)器-HE (TALE-HE)融合蛋白和編碼那些TALE-HE融合蛋白的多 核苷酸。
[0032] 在這些實(shí)施方案的某些方面，將編碼一種或多種的HE (在有或沒有靶向模板的情 況下）、一種或多種Cas9內(nèi)切核酸酶、一種或多種RNA引導(dǎo)鏈、一種或多種TALEN、一種或多 種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸有效連接到病毒載體內(nèi)的啟 動(dòng)子序列，以實(shí)現(xiàn)HE、Cas9、RNA引導(dǎo)鏈、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的遞送 和瞬時(shí)表達(dá)?？奢^好用于遞送HE、TALEN、TALE-HE融合蛋白和/或TREX2蛋白的適合的病 毒載體可選自cocal假型化慢病毒載體、泡沫病毒載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒（AAV)載 體。
[0033] 在第五個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供包含/包括離體擴(kuò)增修飾的造血干細(xì)胞（HSC) 的組合物和方法，其允許有效植入修正細(xì)胞并能夠?qū)⒄T導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)用于篩選和 臨床應(yīng)用。在這些實(shí)施方案的某些方面，提供用于有效擴(kuò)增自體HSC、自體基因修飾的HSC、 iPSC-來源的HSC和ES細(xì)胞的組合物和方法。可采用臍帶血擴(kuò)增法，所述方法在補(bǔ)充有造 血生長因子的不含血清的培養(yǎng)基中采用S 1并使用從正常供體獲得的動(dòng)員的外周血CD34+ 細(xì)胞。這些組合物和方法可與一種或多種額外的試劑聯(lián)用，以提高造血干/祖細(xì)胞的存活 率和促進(jìn)增殖。在其它方面，這些組合物和方法可采用內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)物以促進(jìn)長期再生 細(xì)胞（包括修正的iPSC-來源的HSC)的擴(kuò)增。
[0034] 在第六個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供用于提供支持性護(hù)理的組合物和方法，所述組 合物和方法包括消除移植后嗜中性白細(xì)胞減少癥并改善基因-修正的自體HSC移植之后的 結(jié)果的現(xiàn)成細(xì)胞療法。例如，可將離體擴(kuò)增、低溫保藏的臍帶血（CB)干/祖細(xì)胞以支持性 護(hù)理的形式向正在用自體CD34+基因修正細(xì)胞進(jìn)行清髓性HCT的患有地中海貧血和/或鐮 狀細(xì)胞病的患者施用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 根據(jù)下圖，將更好地理解本公開的某些方面：
[0036] 圖1顯示了在成人紅系細(xì)胞組織中的增加球蛋白樣基因表達(dá)的靶。展示了 調(diào)節(jié)胎兒表達(dá)形式（兩個(gè)Y基因）轉(zhuǎn)變?yōu)槌扇顺绦颍⊿和β )所涉及的因子。（采用自 Wilber 等，Blood 117(15) :3945-3953 (2011))。
[0037] 圖2描繪了三種示例性的罕見切割核酸酶技術(shù)。
[0038] 圖3是顯示在雙份CBT接受者中非復(fù)發(fā)性死亡率的風(fēng)險(xiǎn)最高的圖表。雙份 CBT (DUCB)、匹配的不相關(guān)供體（MUD)、不匹配的不相關(guān)供體（MMUD)和匹配的相關(guān)供體 (SIB)移植之后的非復(fù)發(fā)性死亡率。
[0039] 圖4顯示在清髓性雙份CBT情況下與δ 1--# -起進(jìn)行的CB祖細(xì)胞的培養(yǎng)導(dǎo)致 嗜中性粒細(xì)胞恢復(fù)更快速。圖中呈現(xiàn)了接受用兩個(gè)非操作單元（"常規(guī)的"）對比用一個(gè)離 體擴(kuò)增的單元和一個(gè)非操作單元（"擴(kuò)增的"）進(jìn)行的雙份單元CBT的患者達(dá)到ANC > 500/ μ 1所需的個(gè)體時(shí)間和中值時(shí)間（實(shí)線）。
[0040] 圖5是通過疾病跡象描繪每年進(jìn)行的臍帶血移植數(shù)量的柱形圖。
[0041] 圖6(SEQ ID Ν0:1)是3.6kb區(qū)的序列，HbF沉默區(qū)落入其中，跨越HG18中的 chrll:5212342-5215944。
[0042] 圖7 (SEQ ID NO: 2)是350堿基對區(qū)，所述區(qū)域來自HbF沉默區(qū)中的重復(fù)元件（于 HG18中的chrl 1:5, 213, 912-5, 214, 261)，跨越通過已知可破壞HbF沉默區(qū)內(nèi)的Bcllla占 據(jù)區(qū)的上游French HPHl拐點(diǎn)，并包含GATA-I結(jié)合基序，且由此設(shè)計(jì)本公開的示例性歸巢 內(nèi)切核酸酶（HE)。
[0043] 圖8 (SEQ ID NO: 13)是來自帽上游Ikb處，通過聚腺苷酸位點(diǎn)的人β-球蛋白基 因，其跨越了 HG18 中的 chrl 1:5203272-5205877(反義鏈）。
[0044] 圖9(SEQ ID N0:14)是人β-球蛋白的606bp區(qū)域，從啟動(dòng)子跨越到內(nèi)含子2(于 HG18中的chrll:5204380-5204985)。該相當(dāng)小的區(qū)域含有導(dǎo)致地中海貧血的大部分的突 變以及引起鐮狀細(xì)胞病的突變。該小區(qū)域容易進(jìn)行導(dǎo)致基因修正的同源重組。
[0045] 圖10(SEQIDN0:24)是人BclllacDNA(CCDS 1862·l)的cDNA序列。
[0046] 圖11是質(zhì)粒pET-21a(+)的限制性圖譜。
[0047] 圖 12 是質(zhì)粒 pEndo 的限制性圖譜（Doyon 等，J. Am. Chem. Soc. 128 (7)： 2477-2484(2006)〇
[0048] 圖13是產(chǎn)生BCLllA基因-靶向內(nèi)切核酸酶的定向進(jìn)化的示意圖。使構(gòu)建的文庫 進(jìn)行在針對靶點(diǎn)的IVC中的選擇，其一部分用BCLllA基因靶來替代。
[0049] 圖14 (SEQ ID NO: 28)是I-HjeMI (用于BCLllA基因-靶向核苷酶的親代酶）的 核苷酸序列，其作為用于在大腸桿菌中的表達(dá)所優(yōu)化的密碼子。
[0050] 圖15 (SEQ ID NO: 29)是I-HjeMUBCLllA基因-靶向核苷酶的親代酶）的核苷酸 序列，其作為用于在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)所優(yōu)化的密碼子。
[0051] 圖16 (SEQ ID NO: 30)是歸巢內(nèi)切核酸酶I-HjeMI的氨基酸序列。
[0052] 圖17 (SEQ ID NO: 31)是BCLllA基因靶向核苷酶（BclllAhje)的核苷酸序列，其 基于歸巢內(nèi)切核酸酶I-HjeMI (通過在IVC和細(xì)菌中的定向進(jìn)化獲得），其作為用于在大腸 桿菌中表達(dá)優(yōu)化其密碼子。
[0053] 圖18 (SEQ ID NO: 32)是基于歸巢內(nèi)切核酸酶I-HjeMU通過在IVC和細(xì)菌中的定 向進(jìn)化獲得）的BCLllA基因靶向核苷酶的核苷酸序列，以在哺乳動(dòng)物中表達(dá)優(yōu)化其密碼 子。
[0054] 圖19 (SEQ ID NO: 33)是基于歸巢內(nèi)切核酸酶I-HjeMU通過在IVC和細(xì)菌中的定 向進(jìn)化獲得）的BCLllA基因靶向核苷酶的氨基酸序列。
[0055] 圖20是顯示BCLllA基因-靶向內(nèi)切核酸酶和其親代LHE I-HjeMI的氨基酸殘 基分布差異的蛋白模型。在結(jié)合至其靶點(diǎn)（PDB ID:3UVF)的I-HjeMI的晶體結(jié)構(gòu)上確定 BCLllA基因-靶向內(nèi)切核酸酶經(jīng)置換的殘基。在變體內(nèi)切核酸酶中缺失D161。
[0056] 圖21是顯示在雙質(zhì)粒切割測定中的BCLllA基因-靶向內(nèi)切核酸酶活性的柱形 圖。
[0057] 圖22A(SEQ ID NO: 34)是I-OnuI歸巢內(nèi)切核酸酶（靶向HbF沉默區(qū)的歸巢內(nèi)切 核酸酶的親代酶）的核苷酸序列，以在大腸桿菌中表達(dá)優(yōu)化其密碼子。
[0058] 圖22B(SEQ ID NO: 15)是I-OnuI歸巢內(nèi)切核酸酶的氨基酸序列。
[0059] 圖23是顯示靶向HbF沉默區(qū)的I-OnuI歸巢內(nèi)切核酸酶的活性的瓊脂糖凝膠。
[0060] 圖24(SEQIDN0:35)是MegaTAL:5·5RVD+Y2I-AniI的核苷酸序列。
[0061] 圖25(SEQIDN0:36)是MegaTAL:5·5RVD+Y2I-AniI的氨基酸序列。
[0062] 圖26 (SEQ ID NO: 37)是Cas9內(nèi)切核酸酶的核苷酸序列（來自Mali等， Science (2013))。
[0063] 圖27 (SEQ ID NO: 38)是與Cas9內(nèi)切核酸酶一起使用的RNA引導(dǎo)鏈的核苷酸序列 (來自 Mali 等，Science (2013))。
[0064] 圖28 (SEQ ID NO: 62)是I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶的核苷酸序列（0RF，以在哺乳動(dòng) 物表達(dá)中優(yōu)化其密碼子）。
[0065] 圖29 (SEQ ID NO: 63)是I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶的氨基酸序列。
[0066] 圖30是顯示如實(shí)施例4檢測所述的內(nèi)源人BCLllA基因上的靶向誘變的瓊脂糖凝 膠。
[0067] 圖 31 是質(zhì)粒 pCcdB wt6 的限制性圖譜（Doyon 等，J. Am. Chem. Soc. 128 (7)： 2477-2484(2006))。
[0068] 圖 32(SEQ ID N0:64)是BCLllA基因靶向核苷酶-編碼質(zhì)粒（pExodusBCLllAhje) 的核苷酸序列。
[0069] 圖 33(SEQ ID N0:65)是 TREX2-編碼質(zhì)粒（pExodus CMV. Trex2)的核苷酸序列。
[0070] 圖34是質(zhì)粒pExodusBCLllAhje的限制性圖譜。
[0071] 圖35是質(zhì)粒pExodus CMV. Trex2的限制性圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0072] 本公開通常涉及通過瞬時(shí)或持續(xù)表達(dá)多核苷酸來治療諸如血紅蛋白病的遺傳病 的組合物和方法，所述多核苷酸編碼一種或多種內(nèi)切核酸酶或內(nèi)切核酸酶融合蛋白，包括 一種或多種歸巢內(nèi)切核酸酶和/或歸巢內(nèi)切核酸酶融合蛋白和/或聯(lián)合一種或多種RNA 引導(dǎo)鏈聯(lián)合的一種或多種Cas9內(nèi)切核酸酶和/或Cas9內(nèi)切核酸酶融合蛋白：（a)以破壞 BclIla編碼區(qū)；(b)以破壞HbF沉默DNA調(diào)節(jié)元件或通路，諸如BclIla-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)； (c)以突變一種或多種Y-球蛋白基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)Y-球蛋白基因表達(dá)的增加；（d)以突 變一種或多種S-球蛋白基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)δ-球蛋白基因表達(dá)的增加；和/或（e)以修 正一種或多種β-球蛋白基因突變。本文公開的組合物和方法可用于治療包括β-地中海 貧血和鐮狀細(xì)胞病的血紅蛋白病。本文描述的組合物和方法可任選地包含/包括編碼一種 或多種TALEN、一種或多種TALE-HE融合蛋白和/或一種或多種TREX2蛋白的多核苷酸。
[0073] 根據(jù)以下定義，將更好理解本公開：
[0074] 定義
[0075] 如本文所用，術(shù)語"血紅蛋白病"是指一類導(dǎo)致血紅蛋白分子的一條或多條球蛋白 鏈的結(jié)構(gòu)異常、功能異?；虮磉_(dá)改變的遺傳缺陷。血紅蛋白病是遺傳性單基因病。常見的 血紅蛋白病包括地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"地中海貧血"是指一種由于α樣與β樣球蛋白多肽鏈的比率 改變導(dǎo)致正常血紅蛋白四聚體蛋白產(chǎn)生不足和游離或未配對的α-鏈或鏈自然增長而 產(chǎn)生的血紅蛋白病。
[0077] 如本文所用，術(shù)語"鐮狀細(xì)胞病"是指一組常染色體隱性遺傳性血液病，其由球蛋 白基因突變所導(dǎo)致且特征為呈現(xiàn)出異常、僵硬鐮刀狀的紅細(xì)胞。它們由其中谷氨酸被纈氨 酸在肽的第6位氨基酸處置換的編碼β -球蛋白鏈變體的β S-基因和具有使得HbS結(jié)晶 從而產(chǎn)生臨床表型的突變的第二β-基因的存在所定義。術(shù)語"鐮狀細(xì)胞貧血"是指對于引 起HbS的突變是雜合的患者中的一種特定形式的鐮狀細(xì)胞病。其它常見形式的鐮狀細(xì)胞病 包括HbS/ β -地中海貧血、HbS/HbC和HbS/HbD。表1公開了編碼野生型和鐮狀細(xì)胞β -球 蛋白鏈的初始氨基酸的核苷酸序列。
[0078] 表 1
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于治療血紅蛋白病的組合物，包含選自歸巢內(nèi)切核酸酶（HE)和CRISPR內(nèi)切 核酸酶中的一種或多種內(nèi)切核酸酶，其中每種所述內(nèi)切核酸酶結(jié)合至選自Bcllla編碼區(qū)、 Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)、成人β-球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)、Bcllla-調(diào)節(jié)的 HbF沉默區(qū)、γ-球蛋白基因啟動(dòng)子、δ-球蛋白基因啟動(dòng)子和β-球蛋白基因突變位點(diǎn)中 的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是結(jié)合至所述Bcllla編碼區(qū)或 所述Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)的HE。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、I-CpaMI 歸巢內(nèi)切核酸酶和I-〇nuI歸巢內(nèi)切核酸酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中 所述氨基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 N159、D162、D163、1166、I168、S168、D170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至 Bell la編碼區(qū)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是CRISPR內(nèi)切核酸酶，其中所 述CRISPR包含RNA引導(dǎo)鏈和Cas9內(nèi)切核酸酶，其中所述RNA引導(dǎo)鏈介導(dǎo)所述Cas9內(nèi)切核 酸酶與胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的結(jié)合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述RNA引導(dǎo)鏈包含選自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述Cas9內(nèi)切核酸酶由編碼功能性Cas9內(nèi)切 核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其變體編碼。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是能夠特異性結(jié)合至胎兒血 紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的HE。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述HE是I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含編碼 Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的變體編碼的氨基酸序列，所述 I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:34核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置換選 自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置換 選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其還包含TAL效應(yīng)器核酸酶（TALEN)、TAL-HE或 TREX2蛋白。
18. -種用于治療血紅蛋白病的組合物，所述組合物包含編碼選自歸巢內(nèi)切核酸酶 (HE)和Cas9內(nèi)切核酸酶中的一種或多種內(nèi)切核酸酶的一種或多種多核苷酸，其中每種所 述內(nèi)切核酸酶結(jié)合至選自Bcllla編碼區(qū)、Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)、成人β-球蛋白基因座、胎 兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)、Bcllla-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)、γ -球蛋白基因啟動(dòng)子、δ -球蛋白 基因啟動(dòng)子和β-球蛋白基因突變點(diǎn)中的核苷酸序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是結(jié)合至所述Bcllla編碼區(qū) 或所述Bel 11a基因調(diào)節(jié)區(qū)的HE。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中 所述氨基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 N159、D162、D163、1166、I168、S168、D170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至 Bell la編碼區(qū)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是CRISPR內(nèi)切核酸酶，其中 所述CRISPR包含RNA引導(dǎo)鏈和Cas9內(nèi)切核酸酶，其中所述RNA引導(dǎo)鏈介導(dǎo)所述Cas9內(nèi)切 核酸酶與胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的結(jié)合。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述RNA引導(dǎo)鏈包括選自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述Cas9內(nèi)切核酸酶由編碼功能性Cas9內(nèi) 切核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其變體編碼。
28. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是能夠特異性結(jié)合至胎兒血 紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的HE。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述HE是Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由編碼 I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的變體編碼的氨基酸序列，所述 I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置換 選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置換 選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
34. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，還包含編碼TAL效應(yīng)器核酸酶（TALEN)、TALE-HE 融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
35. -種編碼選自歸巢內(nèi)切核酸酶（HE)和CRISPR內(nèi)切核酸酶中的內(nèi)切核酸酶的多核 苷酸，其中所述內(nèi)切核酸酶結(jié)合至選自Bcllla編碼區(qū)、Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)、成人β-球蛋白 基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)、Bcllla-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)、γ-球蛋白基因啟動(dòng)子、 S-球蛋白基因啟動(dòng)子和β-球蛋白基因突變位點(diǎn)中的核苷酸序列。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的多核苷酸，其中所述內(nèi)切核酸酶是結(jié)合至所述Bcllla編碼 區(qū)或所述Bel 11a基因調(diào)節(jié)區(qū)的HE。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的多核苷酸，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的多核苷酸，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換， 其中所述氨基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、 N64、E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、 1^158、附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。25.根據(jù) 權(quán)利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或 SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至 Bell la編碼區(qū)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的多核苷酸，其中所述內(nèi)切核酸酶是能夠特異性結(jié)合至胎兒 血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的HE。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的多核苷酸，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
43. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的多核苷酸，其中所述HE是I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的多核苷酸，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由編 碼I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的變體編碼的氨基酸序列，所述 I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的多核苷酸，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中每種所述氨基 酸置換選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的多核苷酸，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置 換選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
47. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的多核苷酸，還包括編碼TAL效應(yīng)器核酸酶（TALEN)、 TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
48. -種編碼RNA引導(dǎo)鏈的多核苷酸，所述RNA引導(dǎo)鏈介導(dǎo)Cas9內(nèi)切核酸酶與 Bcllla編碼區(qū)、Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)、成人β-球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)、 Bcllla-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)、γ-球蛋白基因啟動(dòng)子、δ-球蛋白基因啟動(dòng)子和β-球蛋白 基因突變位點(diǎn)的結(jié)合。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的多核苷酸，其中所述RNA引導(dǎo)鏈介導(dǎo)Cas9內(nèi)切核酸酶與胎 兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的特異性結(jié)合。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的多核苷酸，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的多核苷酸，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50或權(quán)利要求51所述的多核苷酸，其中所述RNA引導(dǎo)鏈包含選自 SEQ ID N0:48,SEQ ID N0:49,SEQ ID N0:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52,SEQ ID N0:53 和SEQ ID NO :54中的核苷酸序列。
53. -種包含載體和編碼選自歸巢內(nèi)切核酸酶（HE)和CRISPR內(nèi)切核酸酶中的內(nèi)切核 酸酶的多核苷酸的載體體系，其中所述內(nèi)切核酸酶結(jié)合至選自Bcllla編碼區(qū)、Bcllla基因 調(diào)節(jié)區(qū)、成人β-球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)、Bcllla-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)、 球蛋白基因啟動(dòng)子、球蛋白基因啟動(dòng)子和β-球蛋白基因突變位點(diǎn)中的核苷酸序 列。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的載體體系，其中所述載體選自AA V6、經(jīng)修飾的腺病毒載 體、整合缺陷型慢病毒載體（IDLV)和整合缺陷型泡沫病毒載體（IDFV)。
55. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的載體體系，其中所述內(nèi)切核酸酶是結(jié)合至所述Bcllla編碼 區(qū)或所述Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)的HE。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的載體體系，其中所述HE選自I-HjeM歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的載體體系，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的載體體系，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換， 其中所述氨基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、 N64、E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、 1^158、附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206。25.根據(jù) 權(quán)利要求24所述的多核苷酸，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由所述SEQ ID N0:31 或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的載體體系，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由所述 SEQ ID N0:31或SEQ ID N0:32的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的載體體系，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至 Bell la編碼區(qū)。
61. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的載體體系，其中所述內(nèi)切核酸酶是能夠特異性結(jié)合至胎兒 血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)的HE。
62. 根據(jù)權(quán)利要求61所述的載體體系，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、 I-CpaMI歸巢內(nèi)切核酸酶和I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
63. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的載體體系，其中所述HE是I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的載體體系，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由編 碼I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶的SEQ ID NO:34的核苷酸序列的變體編碼的氨基酸序列，所述 I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的載體體系，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置 換選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
66. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的載體體系，其中所述I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置 換選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
67. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的載體體系，還包含編碼TAL效應(yīng)器核酸酶（TALEN)、 TALE-HE融合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
68. -種包含載體和編碼RNA引導(dǎo)鏈的多核苷酸的載體體系，所述RNA引導(dǎo)鏈介導(dǎo) Cas9內(nèi)切核酸酶與選自Bcllla編碼區(qū)、Bcllla基因調(diào)節(jié)區(qū)、成人β-球蛋白基因座、胎兒 血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)、Bcllla-調(diào)節(jié)的HbF沉默區(qū)、γ -球蛋白基因啟動(dòng)子、δ -球蛋白基 因啟動(dòng)子和β-球蛋白基因突變位點(diǎn)中的核苷酸序列的結(jié)合。
69. 根據(jù)權(quán)利要求68所述的載體體系，其中在成人β-球蛋白基因座中的所述核苷酸 序列是胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的載體體系，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。
71. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的載體體系，其中所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
72. 根據(jù)權(quán)利要求70或權(quán)利要求71所述的載體體系，其中所述RNA引導(dǎo)鏈包含選自 SEQ ID N0:48,SEQ ID N0:49,SEQ ID N0:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52,SEQ ID N0:53 和SEQ ID NO :54中的核苷酸序列。
73. -種包含編碼選自歸巢內(nèi)切核酸酶（HE)和CRISPR內(nèi)切核酸酶中的一種或多種內(nèi) 切核酸酶的多核苷酸的細(xì)胞，其中每種所述內(nèi)切核酸酶結(jié)合至選自Bcllla編碼區(qū)、Bcllla 基因調(diào)節(jié)區(qū)、成人β -球蛋白基因座、胎兒血紅蛋白HbF沉默區(qū)、Bcllla-調(diào)節(jié)的HbF沉默 區(qū)、球蛋白基因啟動(dòng)子、球蛋白基因啟動(dòng)子和β-球蛋白基因突變位點(diǎn)中的核苷酸 序列。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
75. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自造血干細(xì)胞（HSC)、誘導(dǎo)多能干 細(xì)胞（iPSC)、胚胎干（ES)細(xì)胞和紅系祖細(xì)胞中的干細(xì)胞。
76. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自造血干細(xì)胞（HSC)、誘導(dǎo)多能干 細(xì)胞（iPSC)和紅系祖細(xì)胞中的干細(xì)胞。
77. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，其中所述內(nèi)切核酸酶是能夠特異性結(jié)合至所述 Bcllla編碼區(qū)的HE。
78. 根據(jù)權(quán)利要求77所述的細(xì)胞，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、I-CpaMI 歸巢內(nèi)切核酸酶和I-〇nuI歸巢內(nèi)切核酸酶。
79. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的細(xì)胞，其中所述HE是I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的細(xì)胞，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中 所述氨基酸置換選自 Y20、S22、T24、K26、G27、K28、T31、E33、G35、E37、S59、R61、R63、N64、 E65、166、M68、S70、R70、R72、R74、S109、N110、A121、S123、N124、N135、S137、S154、L158、 附59、0162、0163、1166、1168、5168、0170、1193、1^195、1?202、1(204和了206.25。
81. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的細(xì)胞，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的細(xì)胞，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶包含SEQ ID N0:33的氨基酸序列或其變體，其中所述I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至 Bell la編碼區(qū)。
83. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，其中所述CRJSPR內(nèi)切核酸酶包含Cas9內(nèi)切核酸酶 和RNA引導(dǎo)鏈，其中所述RNA引導(dǎo)鏈介導(dǎo)所述Cas9內(nèi)切核酸酶與胎兒血紅蛋白（HbF)沉默 區(qū)的結(jié)合。
84. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的細(xì)胞，其中所述RNA引導(dǎo)鏈包含選自SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53 和 SEQ ID N0:54 中 的核苷酸序列。
85. 根據(jù)權(quán)利要求84所述的細(xì)胞，其中所述Cas9內(nèi)切核酸酶由編碼功能性Cas9內(nèi)切 核酸酶的SEQ ID NO:37的核苷酸序列或其變體所編碼。
86. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，其中所述內(nèi)切核酸酶是結(jié)合至胎兒血紅蛋白（HbF) 沉默區(qū)的HE。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的細(xì)胞，其中所述HE選自I-HjeMI歸巢內(nèi)切核酸酶、I-CpaMI 歸巢內(nèi)切核酸酶和I-〇nuI歸巢內(nèi)切核酸酶。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的細(xì)胞，其中所述HE是Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶。
89. 根據(jù)權(quán)利要求88所述的細(xì)胞，其中所述Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由編碼 Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶的SEQ ID N0:34的核苷酸序列的變體編碼的氨基酸序列，所述 I-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶能夠特異性結(jié)合至所述胎兒血紅蛋白（HbF)沉默區(qū)。
90. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的細(xì)胞，其中所述Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO: 34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置換 選自 L26、R28、R30、N32、S40、E42、G44、Q46、A70、S72、S78、K80 和 T82。
91. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的細(xì)胞，其中所述Ι-Onul歸巢內(nèi)切核酸酶包含由SEQ ID NO: 34的核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸置換，其中所述氨基酸置換 選自 F182、N184、1186、S190、K191、Q197、V199、S201、K225、K227、D236、V238 和 T240。
92. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的細(xì)胞，還包含編碼TAL效應(yīng)器核酸酶（TALEN)、TALE-HE融 合蛋白和/或TREX2核苷酶的多核苷酸。
93. -種基因組編輯的干細(xì)胞，其中所述基因組編輯的干細(xì)胞通過引入歸巢內(nèi)切核酸 酶和修正模板產(chǎn)生。
94. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的基因組編輯的干細(xì)胞，其中所述修正模板包含允許在球蛋 白基因基因座中修飾關(guān)鍵調(diào)控序列或編碼序列的核苷酸序列。
95. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的基因組編輯的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞選自造血干細(xì)胞 (HSC)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)、胚胎干（ES)細(xì)胞和紅系祖細(xì)胞。
96. 根據(jù)權(quán)利要求93所述的基因組編輯的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞選自造血干細(xì)胞 (HSC)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)和紅系祖細(xì)胞。
【文檔編號】A61K38/00GK104284669SQ201380017193
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月24日
【發(fā)明者】邁克爾·A·本德爾, 馬克·T·格勞迪尼, 巴里·L·斯托達(dá)德, 亮武內(nèi) 申請人:弗雷德哈欽森癌癥研究中心