用于敲低Syntaxin7的小分子干擾RNA、重組載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于敲低Syntaxin7的小分子干擾RNA、shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒和宿主細(xì)胞及其應(yīng)用，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白Syntaxin7的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長(zhǎng)度為19～27bp。本發(fā)明提供的重組慢病毒載體能在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到Syntaxin7-shRNA；本發(fā)明提供的Syntaxin7-shRNA經(jīng)過宿主細(xì)胞加工后可生成能沉默Syntaxin7表達(dá)的小分子干擾RNA；本發(fā)明提供的小分子干擾RNA能靶向突觸融合蛋白Syntaxin7的mRNA，并導(dǎo)致所述mRNA降解，并導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)，降低Syntaxin7的表達(dá)水平。
【專利說明】用于敲低Syntax in7的小分子干擾RNA、重組載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于敲低Syntaxin7的小分子干擾RNA、重組載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Syntaxin7屬于SNARE家族，SNARE在細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過程中起著極其重要的作用，細(xì)胞囊泡運(yùn)輸又是細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕緩街?，所以研究SNARE家族蛋白如何控制囊泡融合是對(duì)研究各項(xiàng)細(xì)胞、組織、器官及生物體生命活動(dòng)都有重要意義的，而研究Syntaxin7在信號(hào)通路中的作用有必要提供一種敲低Syntaxin7的表達(dá)水平的方法以及穩(wěn)定敲低Syntaxin7的表達(dá)水平的細(xì)胞系。
[0003]RNA干擾(RNA interference, RNAi)可誘發(fā)的基因沉默。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，是一種降低目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的有效途徑。
[0004]因此，有必要提供一種采用RNA干擾技術(shù)對(duì)Syntaxin7進(jìn)行基因沉默的方法以及一種穩(wěn)定敲低Syntaxin7的表達(dá)水平的細(xì)胞系。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于敲低Syntaxin7的小分子干擾RNA、shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒和宿主細(xì)胞及應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的小分子干擾RNA能直接特異性祀向Syntaxin7的mRNA并導(dǎo)致mRNA降解，產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)；本發(fā)明提供的shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒能通過促使宿主細(xì)胞中Syntaxin7的mRNA降解間接地沉默Syntaxin7的表達(dá)，降低Syntaxin7的表達(dá)水平。
[0007]本發(fā)明涉及的英文縮寫及其中文釋義如下:
[0008]Syntaxin7:突觸融合蛋白7,所述突觸融合蛋白7的Genebank登錄號(hào)為NM_003569.2；
[0009]mRNA:信使 RNA ；siRNA:小分子干擾 RNA ；shRNA:短發(fā)夾 RNA ；
[0010]Syntaxin7-shRNA:具有靶向突觸融合蛋白7的信使RNA的短發(fā)夾RNA ；
[0011]第一方面，本發(fā)明提供了一種小分子干擾RNA，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白Syntaxin7的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長(zhǎng)度為19~27bp。
[0012]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長(zhǎng)度為21~27bp。
[0013]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0014]第二方面，本發(fā)明提供了一種shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明第二方面提供了的一種shRNA，為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，所述shRNA具有小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列，其中，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白Syntaxin7的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長(zhǎng)度為19~27bp。
[0016]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長(zhǎng)度為21~27bp。
[0017]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0018]第三方面，本發(fā)明提供了一種shRNA的編碼DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明第三方 面提供了的一種shRNA的編碼DNA，所述shRNA具有小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列，其中，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白Syntaxin7的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長(zhǎng)度為19~27bp。
[0020]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長(zhǎng)度為21~27bp。
[0021]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0022]優(yōu)選地，所述編碼shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
[0023]具體地，在此優(yōu)選條件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)為:
[0024]CCAGAGGATCTCTTCTAACATCTCGAGATGTTAGAAGAGATCCTCTGG TTTTT ；
[0025]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)為:
[0026]AAAAACCAGAGGATCTCTTCTAACATCTCGAGATGTTAGAAGAGATCC TCTGG。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述SEQ ID N0:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位點(diǎn)。
[0028]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位點(diǎn)分別為 Age I 和 EcoR I。
[0029]在此優(yōu)選條件下，所述編碼shRNA的DNA具有如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列。
[0030]具體地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)為:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種小分子干擾RNA，其特征在于，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白Syntaxin7的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長(zhǎng)度為19~27bp。
2.如權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA，其特征在于，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1 或 SEQ ID N0:2 所示。
3.一種shRNA，為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，其特征在于，所述shRNA具有如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
4.一種編碼shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的編碼shRNA的DNA，其特征在于，所述編碼shRNA的DNA的含有SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的編碼shRNA的DNA，其特征在于，所述編碼shRNA的DNA還包括RNA聚合酶III啟動(dòng)子。
7.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體為在pLK0.1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)、pEN-hHlc質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)或pDSL-hpUGIP質(zhì)粒的重組位點(diǎn)插入如權(quán)利要求4~6任一所述的編碼shRNA的DNA得到的重組載體。
8.—種重組慢病毒，其特征在于，是如權(quán)利要求7的b)所述的重組載體與包膜載體psPAX2和包裝載體pMD2.G共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到的重組慢病毒。
9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA、如權(quán)利要求3所述的shRNA、如權(quán)利要求4所述的編碼shRNA的DNA、如權(quán)利要求7的b)所述的重組載體和如權(quán)利要求8的所述的重組慢病毒中的至少一種。
10.如權(quán)利要求1所述的小分子干擾RNA、如權(quán)利要求3所述的shRNA、如權(quán)利要求4所述的編碼shRNA的DNA、如權(quán)利要求7的b)所述的重組載體和如權(quán)利要求8的所述的重組慢病毒中的至少一種在制備抑制突觸融合蛋白Syntaxin7基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P43/00GK103695426SQ201310745250
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】楊詩涵, 張磊, 李紅昌 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院