一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制黑色素瘤細(xì)胞b16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種膽石通利片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的膽石通利片的制備方法，由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、梔子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成，采用超微粉碎、超臨界萃取、微波萃取和大孔樹(shù)脂吸附制備而成，使得橙皮苷含量有很大提高。本發(fā)明還提供了膽石通利片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制黑色素瘤細(xì)胞BI 6細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膽石通利膠囊標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10324 (ZD-0324) -2002，記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肝膽分冊(cè)。由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成,具有清熱利膽，化瘀排石的功效。用于肝膽濕熱所致的急、慢性膽囊炎，膽結(jié)石等。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有膽石通利膠囊在提取制備方面采用超微粉碎、CO2超臨界萃取、微波技術(shù)和大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)提取的報(bào)道，而中藥直接打粉取、水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種膽石通利片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種膽石通利片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種膽石通利片的制備方法，由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃岑45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大`黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白帆超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.η?η,萃取時(shí)間180-220min,得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘洛與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W,萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥,壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
[0010]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0011]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.mirio[0012]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
[0013]上述的膽石通利片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0014]上述的膽石通利片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0015]上述的膽石通利片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0016]現(xiàn)有技術(shù)中，膽石通利膠囊口服，一次5粒，一日3次。膽石通利膠囊服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的膽石通利片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證明。
[0017]試驗(yàn)一、不同方法制備的膽石通利片中橙皮苷含量的比較
[0018]1、儀器及試藥本發(fā)明膽石通利片:按實(shí)施例1方法制備，使用IOSOg原料藥，經(jīng)提取制成500片，每片重0.3g。原膽石通利膠囊，按照WS-10324 (ZD-0324) -2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備，作為對(duì)照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。 [0019]2、方法
[0020]照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄V D)測(cè)定。
[0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇一水(40: 60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm;理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
[0022]對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含38μ g的溶液，即得。
[0023]本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的膽石通利片，研細(xì)，取0.06g,，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱(chēng)定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱(chēng)定重量，并用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0024]對(duì)照品供試品溶液的制備取本對(duì)照的膽石通利膠囊，混勻，研細(xì)，取0.15g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱(chēng)定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱(chēng)定重量，并用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0025]測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0026]3、結(jié)果
[0027]結(jié)果表明，本發(fā)明膽石通利片中橙皮苷的含量為6-10mg/片；而原膽石通利膠囊中橙皮苷的含量為1.45mg/粒，每片橙皮苷含量相當(dāng)于原膠囊劑含量的4-6倍，在服用量減少的情況下，橙皮苷含量有很大提高。
[0028]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的膽石通利片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10324 (ZD-0324) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的膽石通利膠囊。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0030]實(shí)施例1
[0031]取金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0032]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為9.86mg/片。
[0033]實(shí)施例2
[0034]取金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0035]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為6.42mg/片。
[0036]實(shí)施例3
[0037]取金錢(qián)草225g、茵陳225g`、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時(shí)間220min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0038]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為8.26mg/片。
[0039]實(shí)施例4:膽石通利片抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0040]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0041]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
[0042]小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0043]1.2實(shí)驗(yàn)藥物[0044]研究藥物:本發(fā)明膽石通利片:按實(shí)施例1方法制備。
[0045]藥液儲(chǔ)液:稱(chēng)取IOOmg膽石通利片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μ m濾器過(guò)濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0046]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0047]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ；NaHCO3(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810-033Lot.N0.1088387) ;Trypsin(AMRESCO 公司);EDTA(AMRESC0 公司);PenicillinG Sodium Salt (AMRESCO 公司 I) ；Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無(wú)水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp批號(hào):0793) =PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
[0048]1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0049]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DMIL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào):SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)型號(hào):ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào):SLGP033RB) ;lcm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0050]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0051]1)B16細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37 °C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)`整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個(gè)/ml。
[0052]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0053]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入膽石通利片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0054]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0055]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0056]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0057]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0058]3.統(tǒng)計(jì)處理
[0059]采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean + S.D.表不。
[0060]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0061]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)B16細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0062]表1膽石通利片對(duì)B16細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種膽石通利片的制備方法，由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_501:，0)2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180_220min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
9.權(quán)利要求1所述的膽石通利片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103800817SQ201310670117
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫波 申請(qǐng)人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司