三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法
【專利摘要】三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，采用一種可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羥基乙酸共聚物作為包封材料，采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法制得載三氧化二砷納米粒。通過化學(xué)鍵共價(jià)偶聯(lián)的方法在載三氧化二砷納米粒表面修飾兩親性聚乙二醇，賦予其“隱形”功能，通過表面同步修飾LA，賦予其免疫靶向性。最終獲得的三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑微粒尺寸均一，形貌可控，分散性好，包封率可達(dá)90%以上。在體外可穩(wěn)定釋放45天，具備緩釋功能，是一種新穎、高效的隱形免疫靶向As2O3制劑。
【專利說明】三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種包封抗癌藥物As2O3的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三氧化二砷(As2O3)是傳統(tǒng)中藥砒霜中的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)As2O3對急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)具有顯著的療效，可誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡。最近的研究表明As2O3對惡性實(shí)體瘤也具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，尤其是As2O3抗肝癌的作用受到國內(nèi)外腫瘤界的廣泛關(guān)注。但是使用As2O3作為抗肝癌藥物，仍然存在著一定的問題:(I)血漿中砷的半衰期很短，給藥后短時(shí)間內(nèi)就會(huì)被迅速清除；(2)藥物本身具有毒性，這也就限定了其直接使用時(shí)劑量必須要低，相應(yīng)的抗癌效果也隨之降低。
[0003]針對上述問題，國內(nèi)外的研究者提出了將砷化物制成緩釋制劑，以延長其在體內(nèi)的半衰期，其中以脂質(zhì)體的研究最為廣泛。然而脂質(zhì)體不穩(wěn)定，包封藥物后容易泄露，帶來一定的毒副作用。另外傳統(tǒng)的緩釋制劑無靶向性，給藥后分布于全身各個(gè)器官，很大程度上削弱了藥物的抗癌效果；同時(shí)藥劑在進(jìn)入人體后，難以逃避人體免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞對其的吞噬作用，使得最終達(dá)到病變部位發(fā)揮藥效的藥劑大打折扣。因此，提出一種可以高效、穩(wěn)定地包封As2O3的隱形免疫靶向抗腫瘤制劑，提高其抗癌效果，具有十分重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服抗癌藥物As2O3在使用過程中存在的不足，從而提出一種新穎、高效、隱形、靶向的As2O3抗腫瘤制劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明的步驟如下:
1)將As2O3溶于氫氧化鈉水溶液中，配成含As2O3濃度為l(Tl00mg/mL的砷溶液，作為水相；
2)將乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于三氯甲烷中，作為油相；
3)將水相在磁力攪拌下加入到油相中，然后冰浴乳化超聲，形成W/0初乳；
4)將W/0初乳與第一份泊洛沙姆的水溶液混合，冰浴乳化超聲形成W/0/W復(fù)乳；
5)將W/0/W復(fù)乳與第二份泊洛沙姆水溶液均勻混合后，蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得載三氧化二砷納米粒。
[0006]6)將上述載三氧化二砷納米粒分散于水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化后，與雙端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2X乳糖酸(LA)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)在室溫下磁力攪拌反應(yīng)，離心收集沉淀，即得三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑。
[0007]本發(fā)明采用一種可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為包封材料，采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法制得載三氧化二砷納米粒。通過化學(xué)鍵共價(jià)偶聯(lián)的方法在載三氧化二砷納米粒表面修飾兩親性聚乙二醇(PEG)，賦予其“隱形”功能，通過表面同步修飾LA，賦予其免疫靶向性。最終獲得的三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑微粒尺寸均一，形貌可控，分散性好，包封率可達(dá)90%以上。在體外可穩(wěn)定釋放45天，具備緩釋功能，是一種新穎、高效的隱形免疫靶向As2O3制劑，可望應(yīng)用于肝癌的治療。
[0008]另，步驟I)中，所述氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量百分比為4%，以增大As2O3的溶解度。
[0009]步驟2)中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的濃度為30~50mg/mL，以提高As2O3包封率。
[0010]步驟3)中，所述水相和油相的混合體積比為1:10，超聲功率為180W，超聲時(shí)間為60s,以形成均勻的W/0初乳液。[0011]步驟4)中，第一份泊洛沙姆水溶液的質(zhì)量百分比濃度為3%，超聲功率為360W，超聲時(shí)間為90s，以形成分散均勻的W/0/W復(fù)乳液。
[0012]步驟5)中，第二份泊洛沙姆水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.3%，將W/0/W復(fù)乳與第二份泊洛沙姆水溶液混合時(shí)以機(jī)械攪拌，速度為1200rpm，以進(jìn)一步分散穩(wěn)定W/0/W復(fù)乳。
[0013]步驟6)中，載三氧化二砷納米粒、NH2-PEG-NH2和LA的投料摩爾比為1:1.3:1，以保證NH2-PEG-NH2有足夠的氨基共價(jià)偶聯(lián)載三氧化二砷納米粒和LA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為As2O3隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法示意圖。
[0015]圖2為As203/PLGA-PEG-LA納米微球的3萬倍SEM圖。
[0016]圖3為As203/PLGA-PEG-LA納米微球的10萬倍SEM圖。
[0017]圖4為載As2O3納米微球的FT-1R圖。
[0018]圖5為As203/PLA納米微球的DLS圖。
[0019]圖6 為 As203/PLGA-PEG 納米微球的 DLS 圖。
[0020]圖7 為 As203/PLGA-PEG-LA 納米微球的 DLS 圖。
[0021 ]圖8為藥物As2O3的AFS標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0022]圖9為載As2O3納米粒的體外控制釋放曲線圖。
[0023]圖10為釋放45天的載As2O3納米粒的體外懸浮穩(wěn)定性的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下通過實(shí)施案例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)實(shí)際需要選擇性地在微球表面單獨(dú)地修飾上PEG、LA或是同時(shí)修飾上PEG和LA，從而可以得到緩釋、隱形、免疫靶向、隱形免疫靶向等多種不同功能的微球。
[0025]本發(fā)明使用的高分子材料為PLGA，也可以為PLA、PLA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物等。
[0026]實(shí)施例1:
1、制備負(fù)載三氧化二砷的聚乳酸納米微球(As203/PLA NPs)，如圖1所示:
(1)稱取10mg As2O3溶于ImL質(zhì)量百分比為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成10mg/mL的As2O3溶液，作為水相；
(2)將100mg聚乳酸(PLA)溶于2mL三氯甲烷中，作為油相；
(3)取200PL上述水相在磁力攪拌下緩慢加入到2mL油相中，然后在冰浴下，于180W乳化超聲60s，形成m初乳；(4)將此初乳加入到4mL質(zhì)量百分比為3%的泊洛沙姆水溶液中，冰浴下，360W乳化超聲90s，形成W/0/W復(fù)乳；
(5)將W/0/W復(fù)乳加入到50mL質(zhì)量百分比為0.3%的泊洛沙姆水溶液中，1200rpm下室溫?cái)嚢?h,然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min除去有機(jī)溶劑，12000r/min下離心20min,去離子水洗3次，收集沉淀，冷凍干燥，即可得到As203/PLA納米微球。
[0027]2、得到的As203/PLA納米微球球形規(guī)整，分布均勻(見圖2和圖3);平均粒徑為300.1xm, PDI為0.235 (如圖5所示)；包封率為88.72%，在體外可穩(wěn)定釋放45天，釋放率達(dá)55.06% (如圖9所示)。
[0028]實(shí)施例2:
1、制備負(fù)載三氧化二砷的聚乳酸-羥基乙酸共聚物隱形納米微球(As203/PLGA_PEGNPs)，如圖1所示:
(1)稱取10mg As2O3溶于ImL質(zhì)量百分比為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成10mg/mL的As2O3溶液，作為水相；
(2)將60mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于2mL三氯甲烷中，作為油相；
(3)取200PL上述水相在磁力攪拌下緩慢加入到2mL油相中，然后在冰浴下，于180W乳化超聲60s，形成W/0初乳；
(4)將此初乳加入到4mL質(zhì)量百分比為3%的泊洛沙姆水溶液中，冰浴下，360W乳化超聲90s，形成W/0/W復(fù)乳； (5)將此復(fù)乳加入到50mL質(zhì)量百分比為0.3%的泊洛沙姆水溶液中，1200rpm下室溫?cái)嚢?h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min除去有機(jī)溶劑，12000r/min下離心20min，用去離子水洗3次，收集沉淀，冷凍干燥，即可得到As203/PLGA納米微球。
[0029](6)將50mg (0.0025mM)冷凍干燥過的As203/PLGA納米微球分散于50mL蒸餾水中，加入 0.0125mM 的 NHS 活化 lh，然后加入 0.0033mM 的 NH2-PEG-NH2 和 0.0125mM 的 EDC，室溫下，磁力攪拌72h,離心收集沉淀即可得到As203/PLGA_PEG納米微球。
[0030]2、得到的As203/PLGA-PEG納米微球球形規(guī)整，分布均勻(如圖2和圖3所示)。在圖4的PLGA-PEG紅外光譜圖上，1610cm_l處出現(xiàn)了酰胺鍵的特征峰，表明PEG上的氨基與PLGA表面的羧基實(shí)現(xiàn)了共價(jià)偶聯(lián)，表面修飾成功。所得的As203/PLGA-PEG NPs平均粒徑為162.6nm, PDI為0.194 (如圖6所示)，分散性良好。包封率為92.03%，在體外可穩(wěn)定釋放45天，釋放率達(dá)65.42% (如圖9所示)。體外懸浮穩(wěn)定性較好，4°C冰箱中保存45天無明顯變化(如圖10所示)。
[0031]實(shí)施例3:
1、制備負(fù)載三氧化二砷的聚乳酸-羥基乙酸共聚物隱形免疫靶向微球(As2O3/PLGA-PEG-LA NPs)，如圖1 所示:
(1)稱取30mg As2O3溶于ImL質(zhì)量百分比為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成30mg/mL的As2O3溶液，作為水相；
(2)將120mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于4mL三氯甲烷中，作為油相；
(3)取400μ?上述水相在磁力攪拌下緩慢加入到4mL油相中，然后在冰浴下，于180W乳化超聲60s，形成W/0初乳；
(4)將此初乳加入到SmL質(zhì)量百分比為3%的泊洛沙姆水溶液中，冰浴下，360W乳化超聲90s，形成W/0/W復(fù)乳；
(5)將此復(fù)乳全部加入到IOOmL質(zhì)量百分比為0.3%的泊洛沙姆水溶液中，1200rpm下室溫?cái)嚢?h,然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min除去有機(jī)溶劑，12000r/min下離心20min,用去離子水洗3次，收集沉淀，冷凍干燥，即可得到As203/PLGA納米微球。
[0032](6 )將IOOmg冷凍干燥過的As203/PLGA納米微球重新分散于50mL蒸餾水中，加入 0.0250mM 的 NHS 活化 lh，然后分別加入 NH2-PEG-NH2 0.0065mM、LA 0.0050mM、EDC
0.0250mM,室溫下，磁力攪拌72h，離心收集沉淀即可得到As203/PLGA-PEG_LA納米微球。
[0033]2、所得的As203/PLGA-PEG-LA納米微球球形規(guī)整，分布均勻(如圖2和圖3所示)。
[0034]在圖4的PLGA-PEG-LA紅外光譜圖上，1610cm_l處出現(xiàn)了酰胺鍵的特征峰，表明PEG和LA已通過共價(jià)偶聯(lián)接枝到了 PLGA的表面，表面修飾成功。所得的As203/PLGA-PEG_LA納米微球的平均粒徑為229.3nm, PDI為0.175 (如圖7所示)，分散性良好。藥物包封率達(dá)91.68%，在體外可穩(wěn)定釋放45天，釋放率達(dá)60.59% (如圖9所示)。體外懸浮穩(wěn)定性較好，4°C冰箱中保存45天無明顯變化(如圖10所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將As2O3溶于氫氧化鈉水溶液中，配成含As2O3濃度為l(Tl00mg/mL的砷溶液，作為水相； 2)將乳酸-羥基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中，作為油相； 3)將水相在磁力攪拌下加入到油相中，然后冰浴乳化超聲，形成W/0初乳； 4)將W/0初乳與第一份泊洛沙姆的水溶液混合，冰浴乳化超聲形成W/0/W復(fù)乳； 5)將W/0/W復(fù)乳與第二份泊洛沙姆水溶液均勻混合后，蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得載三氧化二砷納米粒； 6)將上述載三氧化二砷納米粒分散于水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺活化后，與雙端氨基聚乙二醇、乳糖酸和1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽在室溫下磁力攪拌反應(yīng)，離心收集沉淀，即得三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟I)中，所述氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量百分比為4%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟2)中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物的濃度為30~50mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟3)中，所述水相和油相的混合體積比為1: 10，超聲功率為180W，超聲時(shí)間為60s。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟4)中，泊洛沙姆水溶液的質(zhì)量百分比濃度為3%，超聲功率為360W，超聲時(shí)間為90s。``
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述制`備方法，其特征在于步驟5)中，泊洛沙姆水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.3%，機(jī)械攪拌混合，速度為1200rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟6)中，所述載三氧化二砷納米粒、雙端氨基聚乙二醇和乳糖酸的投料摩爾比為1:1.3:1。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK103520728SQ201310507359
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】宋曉麗, 尤娟, 王娟, 朱愛萍, 郭榮 申請人:揚(yáng)州大學(xué)