用于跨膜藥物遞送系統(tǒng)的鞘脂激活蛋白c以及相關(guān)蛋白和肽促融合性質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括利用促融合蛋白將藥物試劑和/或顯像劑遞送至皮膚的膜、粘膜的膜和其他細胞膜內(nèi)和/或通過所述膜，和穿過血腦屏障的方法。促融合蛋白與磷脂膜例如脂質(zhì)體締合。脂質(zhì)體可包括二油酰磷脂酰絲氨酸，帶負電荷的長鏈脂質(zhì)。可選地，脂質(zhì)體包含帶負電荷的長鏈脂質(zhì)、中性長鏈脂質(zhì)和中性短鏈脂質(zhì)。優(yōu)選的促融合蛋白包括鞘脂激活蛋白C和源自鞘脂激活蛋白C的其他蛋白質(zhì)、多肽和肽類似物。脂質(zhì)體中包含的活性劑可包括生物分子和/或有機分子。該技術(shù)可用于美容和醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中目的是將活性劑遞送至生物膜內(nèi)和/或生物膜下或者穿過血腦屏障和神經(jīng)元膜。
【專利說明】用于跨膜藥物遞送系統(tǒng)的鞘脂激活蛋白C以及相關(guān)蛋白和肽促融合性質(zhì)
[0001]本申請是申請日為2008年11月7日、申請?zhí)枮?00880132489.0的同名申請的分
案申請。
[0002]本發(fā)明在由國立衛(wèi)生研究院授予的基金N0.ROl DK57690-01下部分得到政府資助。政府可在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
[0003]交叉引用相關(guān)申請
[0004]本申請是2007年4月27日提交的PCT專利申請系列N0.PCT/US2007/010357和2006年4月28日提交的美國臨時專利申請系列N0.60/745, 969的部分延續(xù)并且要求其利益，為了所有目的將所述申請通過引用完整并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本申請涉及將顯像劑和/或治療劑靶向遞送至目的細胞或組織的組合物和方法，其中將所述試劑包含或否則整合在蛋白質(zhì)/脂質(zhì)納囊泡(nanovesicle)中。更具體地,本發(fā)明涉及將顯像劑和/或治療劑靶向遞送至目的細胞或組織的組合物和方法，其中將所述試劑包含在蛋白質(zhì)/脂質(zhì)納囊泡中或否則與之整合，所述蛋白質(zhì)/脂質(zhì)納囊泡包含能夠靶向細胞膜和遞送此類試劑的鞘脂激活蛋白C(sap0sin C)蛋白片段。
[0006]發(fā)明背景
[0007]藥物試劑或治療劑的治療功效依賴于足夠劑量的藥物試劑至作用部位的遞送。已開發(fā)了許多遞送模式，包括例如經(jīng)腸(口服)、胃腸外(肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下)和局部施用。在大多數(shù)情況下，選擇施用系統(tǒng)以進行可靠且方便的劑量遞送。
[0008]與藥物制劑的經(jīng)皮膚遞送所固有的問題相似，血腦屏障是CNS藥物遞送的障礙。事實上，血腦屏障被認為是腦藥物開發(fā)的“瓶頸”，并且可能是對神經(jīng)病療法的將來發(fā)展的唯一最重要的限制。(Pardridge, W.M.，The Blood-Brain Barrier:Bottleneck inBrain Drug Development, The Journal of the American Society for ExperimentalNeuroTherapeuticsj 第 2 卷，3-14，Jan，2005;Pardridge，W.M.Brain drug targeting: thefuture of brain drug development.Cambridge, UK: Cambridge UniversityPress, 2001) o BBB由腦毛細血管內(nèi)皮形成，其阻止將近100%的大分子(例如單克隆抗體、重組蛋白質(zhì)、反義或基因治療劑)和98%以上的所有小分子藥物至腦內(nèi)的運輸。雖然CNS活性藥物的平均分子量為357道爾頓，甚至更小，但100道爾頓分子`例如組胺，當(dāng)輸注入小鼠并且使其散布超過30分鐘時，不能通過BBB。事實上，對綜合藥物化學(xué)數(shù)據(jù)庫的評估顯示:在7000多種小分子藥物中，只有5%治療CNS，并且該5%只治療抑郁癥、精神分裂癥和失目民。
[0009]因此，大多數(shù)藥物不能穿過BBB。不幸地，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的許多障礙可受益于指向CNS的改良的藥物療法。雖然對已知穿過BBB的試劑進行了相對少的研究，但存在能夠預(yù)測至CNS內(nèi)的成功遞送的可能性的特征。此類特征是:1)400-500道爾頓閾值以下的分子量，和2)高脂溶性。目前，只有4類CNS障礙響應(yīng)此類分子，包括情感障礙、慢性疼痛和癲癇。偏頭痛可以被認為是CNS障礙，也可包括在該范疇內(nèi)。相反地，患有疾病例如阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、A.L.S.、多發(fā)性硬化、neuro-AIDS、腦癌、中風(fēng)、腦或脊髓創(chuàng)傷、自閉癥、溶酶體貯積病、脆性X綜合征、遺傳性共濟失調(diào)和失明的患者在藥物治療方面選擇余地極其有限。(L-D0PA治療在帕金森患者中已獲得一些成功，并且多發(fā)性硬化可用作用于外周免疫系統(tǒng)的細胞因子來治療)(通常參見，Partridge,同上)。
[0010]在許多上文所列的障礙中，穿過BBB的遞送是基因療法或酶替代療法的限速問題。許多此類障礙可用已發(fā)現(xiàn)的藥物、酶或基因治療。然而，這些藥物不能穿過BBB，并且由于該原因而未能被考慮用于治療用途。由于BBB的不通透性，必須使用將藥物遞送入CNS的其他方法。此類方法包括小分子、經(jīng)頡腦(trans-cranial brain)藥物遞送和BBB破壞的使用。然而，此類方法無一提供可在大量患者中實際實現(xiàn)的針對BBB問題的解決方案。(Pardridge, ff.M.,' The Blood-Brain Barrier〃)。
[0011]鞘脂激活蛋白(小的(約80個氨基酸)熱穩(wěn)定糖蛋白的家族)是鞘糖脂的分解代謝途徑中幾種溶酶體酶的體內(nèi)水解活性所必需的(參見Grab0Wski，G.A., Gatt, S.和 Horowitz, M.(1990) Cri t.Rev.Biochem.Mo 1.Biol.25, 385-414; Furst, ff.和 Sandhoff,K., (1992)Biochim.Biophys.Actal126, 1-16;Kishimoto, Y., Kiraiwa,M.和 0’ Brien, J S.(1992) J.Lipid.Res.33，1255-1267)。鞘脂激活蛋白家族的 4 個成員A、B、C和D從單個前體蛋白-鞘脂激活蛋白原(prosaposin)蛋白水解而來(參見 Fujibayashi, S.，Kao, F.T.，Hones, C，Morse, H.，Law, M.和 Wenger, D.A.(1985) AmJ.Hum.Genet.37, 741-748 ; 0’ Brien, J.S., Kretz , K.A., Dew ji, N., Wenger, D.A., Esch, F.和 Fluharty,AL.(1988)Science241,1098-1101;Rorman,E.G.和 Grabowski,GA.(1989)Genomics 5,486-492;Nakano, T., Sandhoff, K., Stumper, J., Christomanou,H 和 Suzuki, K.(1989) J.Biochem.(Tokyo) 105, 152-154; Reiner, 0., Dagan, 0.和Horowitz, M.(1989) J.Mol.Neurosc1.1,225-233)。已報導(dǎo)了鞘脂激活蛋白 A、B、C和D的完整氨基酸序列以及鞘脂激活蛋白原的基因組組織和cDNA序列(參見Fujibayashi, S., Kao, F.T., Jones, C，Morse, H，Law, M.和 Wenger, D.A.(1985)Am.J.Hum.Genet.37, 741-748 ; 0' Brien, J.S., Kretz, K A., Dewj i, N., Wenger, D.A, Esch, F.和Fluharty,A.L.(1988)Science241, 1098-1101;Rorman, E.G 和 Grabowski, G A.(1989)Genomics 5，486-492)。因起始密碼子的突變而導(dǎo)致的鞘脂激活蛋白原的完全缺乏引起與組合溶酶體水解酶缺乏相似的多種鞘糖脂底物的貯積(參見Schnabel，D.，Schroder, M., Furst, ff., Klien, A., Hurwitz, R., Zenk, T., Weber, J., Harzer, K, Paton, B.C.，Poulos, A.，Suzuki, K 和 Sandhoff, K (1992) J.Biol.Chem.267，3312-3315)。
[0012]鞘脂激活蛋白(Saposin)被定義為鞘脂激活蛋白(sphingolipid activatorproteins)或輔酶。在結(jié)構(gòu)上，鞘脂激活蛋白A、B、C和D具有約50-60%的相似性，包括6個嚴格保守的半胱氨酸殘基(參見Furst, W.和Sandhoff, K，(1992) Biochim.Biophys.Actall26, 1-16),所述半胱氨酸殘基形成其位置(placement)相同的3個結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫橋(參見 Vaccaro, A.M., Salvioli, R., Barca, A., Tatti, M., Ciaffoni, F., Maras, B., Siciliano, R., Zappacosta, F., Amoresano, A.和 Pucci, P.(1995) J.Biol.Chem.270，9953-9960)。全部鞘脂激活蛋白包含一個具有保守位置(在N端序列半部分)的糖基化位點，但糖基化不是其活性所必需的(參見 Q1.X.和 Grabowski, G.A.(1998)Biochemistry37, 11544-11554; Vaccaro, A.M., Ciaffoni, F., Tatti, M., Salvioli, R, Barca, A., Tognozzi, D.和Scerch, C.(1995) J.Biol.Chem.270，30576-30580)。此外，鞘脂激活蛋白 A 在 C 端半部分具
有第二糖基化位點。
[0013]當(dāng)在溶液中時，全部鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白樣蛋白和結(jié)構(gòu)域包含“鞘脂激活蛋白折疊(saposin fold)”。該折疊是特征在于3個保守二硫化物結(jié)構(gòu)和數(shù)個兩親性多肽的多α螺旋束基序。盡管在溶液中存在該共有的鞘脂激活蛋白折疊結(jié)構(gòu)，但鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白樣蛋白質(zhì)在增強特異性水解酶降解溶酶體鞘脂(SL)和鞘糖脂(GSL)方面具有不同的體內(nèi)生物學(xué)功能。由于此類作用，鞘脂激活蛋白在溶酶體鞘脂和鞘糖脂代謝的控制中占據(jù)中心位置(參見Kishimoto, Y.，Kiraiwa, Μ.，和O’Brien, J.S.(1992)J.Lipid.Res.33, 1255-1267 ; Fuj ibayashi, S., Kao，F(xiàn).Τ., Hones, C，Morse, H., Law, Μ.和 Wenger, D.A.(1985) Am.J.Hum.Genet.37, 741-748 ; 0' Brien, J.S., Kretz, K.A., Dewji, N., Wenger, D.A., Esch, F.和 Fluharty, A.L.(1988) Science241, 1098-1101)。
[0014]此類鞘脂激活蛋白的結(jié)構(gòu)特征對于不同的活化機制是極其重要的。由于所有此類蛋白具有高序列相似性，但對脂質(zhì)膜具有不同的作用機制，因此可推測鞘脂激活蛋白和鞘脂激活蛋白樣蛋白的特異性生物學(xué)功能是與生物膜環(huán)境的差異相互作用的結(jié)果。在體外，鞘脂激活蛋白A在μΜ濃度上增強酸性β-葡糖苷酶活性，但鞘脂激活蛋白C缺陷導(dǎo)致葡糖神經(jīng)酰胺貯積和〃戈謝病樣〃表型(參見Schnable，D.，Schroder, Μ.和Sandhoff，K.(1991)FEBS Lett.284, 57-59; Raf 1.M.A, deGala, G, Zhang, X.L.和 Wenger, D.A.(1993) Somat.CellMol.Genet.19，1-7)。鞘脂激活蛋白B的激活通過增溶鞘糖脂底物并且將其呈遞至溶酶體酶而發(fā)生(參見 Furst, W.和 Sandhoff, K., (1992) Biochim.Biophys.Actal 126，1-16)。
[0015]鞘脂激活蛋白C通過在酸性pH下誘導(dǎo)酶構(gòu)象變化來促進酸性β-葡糖苷酶活性(參見 Berent, S.L.和 Radin, N.S.(1981) Biochim.Biophys.Acta664, 572-582; Greenberg, P., Merrill, A.H., Liotta, D.C.和 Grabowski, G A.(1990) Biochim.Biophys.Actal039, 12-20;Q1.X.和 Grabowski, G A.(1998)Biochemistry37,11544-11554)? 鞘脂激活蛋白C與酶的該相互作用在帶負電荷的磷脂表面上發(fā)生。體外和離體鞘脂激活蛋白A和D分別發(fā)揮增強半乳糖神經(jīng)酰胺和神經(jīng)酰胺/鞘磷脂(sphingomyel in)的降解的功能(參見 Harzer, K., Paton, B.C., Christomanou, H., Chatelut, M., Levade, T., Hiraiwa, Μ.和 O’Brien, J S.(1997) FEBS Lett.417, 270-274 ; Kl ien, A., Henseler, Μ., Klein, C, Suzuki, K., Harzer, K.和 Sandhoff, K.(1994) Biochem.Biophys.Res.Commun, 200, 1440-1448)。缺乏單獨的鞘脂激活蛋白B和C的患者分別顯示變異形式的異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(metachromatic leukodystrophy)和戈謝病(參見 Wenger, D.A, DeGala, G, Williams, C，Taylor, H.A., Stevenson, R.E., Pruitt, J.R., Miller, J., Garen, P.D.和 Balentine, J.D.(1989) Am.J.Med.Genet.33, 255-265)(參見 Christomanou, Η., Aignesberger, A.和 Linke, R.Ρ.(1986) Biol.Chem.Hoppe-SeyIer367, 879-890)。
[0016]本發(fā)明還涉及使用包含鞘脂激活蛋白C的脂質(zhì)體將顯像劑施用穿過細胞膜包括血腦屏障的方法。非侵入性成像技術(shù)可用于監(jiān)控脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的分布和功效，從而促進使用脂質(zhì)體的基因療法或治療性治療的評估和臨床應(yīng)用。顯像劑可使用磁共振、熒光或CT/PET作為檢測手段。然而，成功地使用顯像劑監(jiān)控脂質(zhì)體遞送的主要障礙是檢測的容易性、相關(guān)技術(shù)的可用性以及遞送的容易性和效率。
[0017]關(guān)于使用脂質(zhì)體遞送顯像劑，親脂性分子通常是適當(dāng)?shù)模m然本發(fā)明不限定于使用此類分子。不希望受理論限制，包含親脂性部分的親脂性染料可嵌入脂質(zhì)體膜或重建入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)核心內(nèi)。本領(lǐng)域內(nèi)已知的此類染料的實例是11引哚菁(indocarbocyanine)染料Dil。DiI是常規(guī)用于標記脂質(zhì)膜的熒光羰花青染料。其他相似的染料是如Honig，M.G?等人,DiI and DiO:versatile fluorescent dyes for neuronal labeling andpathway tracing.Trends Neurosc1.12:333-335，340-331，1989 中描述的 DiA 或 DiaO?？捎糜诒景l(fā)明的其他親脂性染料包括PKH2、NeuroVue Green、PKH26、NeuroVue Red和NeuroVue Maroon,如由 Fritzsch,等人Diffusion and Imaging proerties of Three NewLipophilic Tracers, NeuroVue Maroon, NeuroVue and Neurovue Green and their usefor Double and Triple Labeling of Neuronal Profile,手稿中所描述的。此類染料中的任意染料可單獨地或組合地用于本文中描述的本發(fā)明。
[0018]也用于本領(lǐng)域的并且適合于本發(fā)明的是具有兩個或更多個成像性質(zhì)的顯像劑。此類試劑使得研究者或臨床醫(yī)生能夠使用多種成像方法來檢測施用的顯像劑。此類試劑的實例是如由 Li, H.，等人，MR and Fluorescent Imaging of Low-Density LipoproteinReceptors, Acad Radiol.2004; 11:1251-1259 (通過引用并入本文)描述的所謂的 PTIR染料。此類染料包含允許通過磁共振成像(MRI)或共聚焦熒光顯微鏡檢測的熒光團和Gd(III)部分。親脂性側(cè)鏈促進染料至磷脂單分子層內(nèi)的嵌入。因此，此類染料適合用于脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)例如本文中描述的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
[0019]質(zhì)子MR成像提供了下述優(yōu)點:非侵入性、斷層照相(tomographic)和高分辨率。近年來，磁共振成像(MRI)已顯露為臨床環(huán)境中的強大工具，因為其為非侵入性的并且產(chǎn)生受試者的精確的體繪制(volume rendering)。通常參見,美國專利N0.6, 962, 686,Kayyem,等人,標題為 Cell-specific gene delivery vehicles。此類有利方面使得 MRI在醫(yī)學(xué)成像和作為用于生物學(xué)實驗的成像工具中成為選擇的技術(shù)。與基于染料或熒光染劑的使用的光學(xué)顯微鏡成像技術(shù)不同，MRI不產(chǎn)生有毒的光漂白副產(chǎn)物。此外，與光學(xué)顯微鏡檢查不同，MRI不受對約只有100微米的表面內(nèi)的細胞的光散射或其他光學(xué)像差的限制。具有MRI性質(zhì)的試劑例如上述的那些可用于本發(fā)明。
[0020]因此，存在對可促進藥物或顯像劑穿過或通過生物膜包括血腦屏障的遞送或運輸?shù)臒o毒試劑的顯著需要。本發(fā)明滿足這些需要。
[0021]發(fā)明概述
[0022]本發(fā)明涉及將試劑例如藥物或治療劑遞送穿過生物膜的組合物和方法，其中所述試劑包含在磷脂膜內(nèi)或嵌入其中，并且通過膜融合蛋白促進遞送。更具體地，本發(fā)明涉及用于增強試劑穿過皮膚和粘膜的膜或血腦屏障和/或在皮膚和粘膜的膜或血腦屏障中的運輸和遞送的組合物和方法，其中所述試劑包含在脂質(zhì)體中，并且使用與脂質(zhì)體締合的鞘脂激活蛋白C促進遞送。
[0023]如本文中所描述的，本發(fā)明包括用于遞送藥物試劑通過生物膜包括血腦屏障和細胞膜的組合物和方法，其中所述方法包括對膜施用組合物，所述組合物在藥學(xué)上可接受的載體中包含陰離子磷脂(具有或不具有中性磷脂)、包含在磷脂中的安全和有效量的藥物試劑以及源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽。[0024]在一個實施方案中，陰離子磷脂膜是囊泡。在另一個實施方案中，囊泡是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一種形式的納米容器，例如納米顆粒或脂質(zhì)體，通常用于封裝藥物。也可使用陽離子磷脂，只要所得的脂質(zhì)體的總電荷是負的。
[0025]在本發(fā)明的另一個實施方案中，蛋白質(zhì)-脂質(zhì)組合物的pH是酸性的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物的pH在約6.8至2之間。在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物的pH在約5.5至2之間。在另一個實施方案中，pH在約5.5至約3.5之間。[0026]在另一個實施方案中，以干燥形式例如粉劑提供蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組合物。在另一個實施方案中，用酸處理蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組合物的干燥形式。在一個實施方案中，所述酸是酸性緩沖液或有機酸。在另一個實施方案中，以足以質(zhì)子化至少一部分蛋白質(zhì)的水平加入酸，其中組合物具有約5.5至約2的pH。在另一個實施方案中，以足以大體上質(zhì)子化蛋白質(zhì)的水平加入酸，其中組合物具有約5.5至約2的pH。
[0027]在另外的實施方案中，然后大體上中和已用足以質(zhì)子化至少一部分蛋白質(zhì)的酸處理的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組合物的干粉的pH。在一個實施方案中，用中性pH緩沖液中和pH。在一個實施方案中，用足以控制所得的脂質(zhì)體的大小的中性PH緩沖液中和pH。在另一個實施方案中，用足以控制所得的脂質(zhì)體的大小(以提供具有約200納米的平均直徑的脂質(zhì)體)的中性PH緩沖液中和pH。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體具有50至350納米的平均直徑。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體具有150至250納米的平均直徑。在另一個實施方案中，向組合物中加入緩沖液以提供約5至約14，優(yōu)選約7至14，更優(yōu)選約7至約12，更優(yōu)選約7至約10和更優(yōu)選約8至約10的終組合物pH。
[0028]在本發(fā)明的一個實施方案中，使用短鏈脂質(zhì)。通常，促融合蛋白或多肽的濃度是足以將藥物試劑遞送入膜和/或遞送穿過膜的量。在另一個實施方案中，體外膜中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合蛋白或多肽的濃度至少5倍過量。在另一個實施方案中，體外膜中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合蛋白或多肽的濃度至少10倍過量。在另一個實施方案中，體外膜中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合蛋白或多肽的濃度至少15倍過量。在一個實施方案中，體外膜中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合蛋白或多肽的濃度至少20倍過量。在另一個實施方案中，體外膜中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合蛋白或多肽的濃度約10倍至約50倍過量或約20至約30倍過量。
[0029]在一個實施方案中，體內(nèi)或細胞膜系統(tǒng)中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合肽的濃度至少I倍過量。在一個實施方案中，體內(nèi)或細胞膜系統(tǒng)中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合肽的濃度至少2倍過量。在另一個實施方案中，體內(nèi)或細胞膜系統(tǒng)中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合肽的濃度至少3倍過量。在另一個實施方案中，體內(nèi)或細胞膜系統(tǒng)中磷脂的濃度按摩爾比計算相對于促融合肽的濃度約I至約10倍過量或約3至7倍過量。
[0030]不希望以任何方式受理論束縛，據(jù)認為膜融合蛋白與磷脂膜通過靜電及疏水性與疏水性相互作用而締合，并且脂質(zhì)組合物總電荷為負。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，被祀向的生物膜包括但不限于皮膚的膜(dermal membrane)、粘膜的膜、血腦屏障和細胞膜。
[0032]優(yōu)選的膜融合蛋白包括鞘脂激活蛋白C以及源自任一鞘脂激活蛋白C(SEQ.1D.N0.1至13)的其他蛋白質(zhì)、多肽類似物或多肽，以及其混合物。[0033]在一個實施方案中，膜融合蛋白包含選自鞘脂激活蛋白C(SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2)的序列的至少8、10、12、14、16、18、20、22、24或更多個連續(xù)氨基酸。在一個實施方案中，膜融合蛋白包含下式的肽:
[0034]h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu-Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h
[0035]其中h=疏水性氨基酸,包括Val、Leu、lie、Met、Pro、Phe和Ala;并且其中U=不帶電荷的極性氨基酸，包括Thr、Ser> Tyr、Gly、Gln和Asn,和其混合物。
[0036]在另一個實施方案中，膜融合蛋白包括選自源自任一鞘脂激活蛋白C(SEQ.1D.N0.1或SEQ.1D.N0.2)的其他蛋白質(zhì)、多肽類似物或多肽的一種或多種蛋白質(zhì)，可使用下式的多肽:
[0037]h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu-Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h,
[0038]其中h=疏水性氨基酸,包括Val、Leu、lie、Met、Pro、Phe和Ala;并且其中U=不帶電荷的極性氨基酸，包括Thr、Ser> Tyr、Gly、Gln和Asn,和其混合物。
[0039]在一個實施方案中，膜融合蛋白包含如下序列的至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、30 或更多個連續(xù)氨基酸:Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val LysGlu Val Thr Lys Leu He Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu He Leu Asp Ala Phe AspLys Met Cys Ser Lys Leu Pro。膜融合蛋白包含如下序列的至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、30 或更多個連續(xù)氨基酸:Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu ValThr Lys Leu He Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu He Leu Asp Ala Phe Asp Lys MetCys Ser Lys Leu Pro。
[0040]在另一個實施方案中，膜融`合蛋白包含序列:Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val CysGlu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu He Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu IleLeu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro。在另一個實施方案中，膜融合蛋白包含序列:Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu IleAsp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu He Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys LeuPro。在另一個實施方案中，膜融合蛋白為22聚體，包含序列:CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL。
[0041]在另一個實施方案中，膜融合蛋白包括鞘脂激活蛋白C。在另一個實施方案中，膜融合蛋白包括根據(jù)已知的方法(具體參見，J.M.Shaw, op.cit;Basu等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA73, 3178-3182 (1976) ; J.Steinbrechert, Biol.Chem.262，3703 (1987))修飾產(chǎn)生的氧化、乙?；?例如，甲?；鸵阴；?、乙酰乙酰化或乳糖化(Iactosylated)形式的鞘脂激活蛋白C。
[0042]在一個實施方案中，磷脂納囊泡是包含藥物試劑的陰離子脂質(zhì)體。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體由包含陰離子長鏈脂質(zhì)的任意脂質(zhì)混合物制成。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體由包含陰離子長鏈脂質(zhì)、中性長鏈脂質(zhì)和中性短鏈脂質(zhì)的混合物制成，其中所得的脂質(zhì)體的總電荷是負的。
[0043]在選擇用于制備本發(fā)明中使用的納囊泡的脂質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)眾多的脂質(zhì)適合于構(gòu)建它們。特別有用的是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合于脂質(zhì)體制備的任何材料或其組合。使用的脂質(zhì)可以是天然、合成或半合成來源的脂質(zhì)。[0044]在另一個實施方案中，納囊泡由一種或多種生物相容性脂質(zhì)制成。在另一個實施方案中，生物相容性脂質(zhì)選自脂肪酸、溶血脂質(zhì)(Iysolipid)、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘脂、糖脂(glycolipid)、糖脂(glucolipid)、硫苷脂(sulfatides)、鞘糖脂、磷脂酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸、油酸、具有聚合物的脂質(zhì)、具有橫化單糖的脂質(zhì)、具有橫化~糖的脂質(zhì)、具有橫化募糖的脂質(zhì)、具有橫化多糖的脂質(zhì)、膽固醇、生育酚、具有醚連接的脂肪酸的脂質(zhì)、具有酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)、聚合的脂質(zhì)、二乙酰磷酸酯、磷酸雙十六烷酯、硬脂酰胺、心磷脂、具有長度為6至8個碳的脂肪酸的磷脂、具有不對稱?；湹暮铣傻牧字⑸窠?jīng)酰胺、非離子脂質(zhì)、固醇脂肪族酸酯(sterolaliphatic acid esters)、糖酸的固醇酯、糖酸的酯、糖醇的酯、糖的酯、脂肪族酸的酯、阜苷、二月桂酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、二棕櫚酸甘油酯、甘油、甘油酯、長度為10至30個碳的醇、6-(5-膽留烯-3 β -基氧)-1-硫代-β -D-批喃半乳糖苷、二半乳糖甘油二酯、6- (5-膽留烯-3 β -基氧)己基-6-氨基-6_脫氧-1-硫代_ β -D-吡喃半乳糖苷、6_ (5-膽留烯_3 β -基氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代_ a -D-吡喃甘露糖苷、12- (((7’ - 二乙氨香?素_3_基)擬基)甲氨基)-十八燒酸、Ν-[12_(((7’- 二乙氨香?素-3-基)擬基)甲基氨基)十八?；鵠-2-氨基棕櫚酸、膽留醇基(4’_三甲基-銨基)丁酸酯、N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺、1，2- 二油?；?sn-甘油、1，2- 二棕櫚酰-sn-3-琥珀酰甘油、1，3- 二棕櫚酰-2-琥珀酰甘油、1-十六烷基-2-棕櫚酰甘油磷酸乙醇胺、棕櫚酰高半胱氨酸、陽離子脂質(zhì)、N-[l-(2，3-二油?；?丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨、1，2_ 二油?；?3-(三甲基銨基)丙烷、I, 2- 二油?；鮛3_(4’ - 二甲基-銨基)丁?；?sn-甘油、溶血磷脂、溶血憐脂酸(lysobisphosphatidic acid, LBPA)、半-溶血憐脂酸(sem1-LBPA)、心憐脂、具有陽離子聚合物的脂質(zhì)、膦酸烷基酯、次磷酸烷基酯(alkyl phosphinate)和亞磷酸烷基酯(alkyl phosphite)。 [0045]在一個實施方案中，磷脂酰膽堿選自二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、雙十五酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿；其中磷脂酰乙醇胺選自二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰乙醇胺；其中鞘脂是鞘磷月旨；其中糖脂選自神經(jīng)節(jié)苷脂GMl和神經(jīng)節(jié)苷脂GM2;其中在攜有聚合物的脂質(zhì)中，所述聚合物選自聚乙二醇、殼多糖、透明質(zhì)酸和聚乙烯吡咯烷酮；其中固醇脂肪族酸酯選自膽固醇硫酸酯、膽固醇丁酸酯、膽固醇異丁酸酯、膽固醇棕櫚酸酯、膽固醇硬脂酸酯、羊毛固醇乙酸酯、麥角固醇棕櫚酸酯和植物留醇正丁酸酯；其中糖酸的固醇酯選自膽固醇葡糖苷酸酯、羊毛固醇葡糖苷酸酯、7-脫氫膽固醇葡糖苷酸酯、麥角固醇葡糖苷酸酯、膽固醇葡糖酸酯、羊毛固醇葡糖酸酯和麥角固醇葡糖酸酯；其中糖酸的酯和糖醇的酯選自月桂酰葡糖苷酸酯、硬脂酰葡糖苷酸酯、肉豆蘧酰葡糖苷酸酯、月桂酰葡糖酸酯、肉豆蘧酰葡糖酸酯和硬脂酰葡糖酸酯；其中糖的酯和脂肪族酸的酯選自蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸、accharic acid和聚糖醛酸；其中皂苷選自薩爾薩皂苷元(sarsasapogenin)、異菝葜阜式元(smilagenin)、常春藤阜式元(hederagenin)、齊墩果酸(oleanolic acid)和洋地黃毒式配基(digitoxigenin);其中甘油酯選自三棕櫚酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、二肉豆蘧酸甘油酯、三肉豆蘧酸甘油酯；其中醇是長為10至30個碳的醇并且選自正-癸醇、月桂醇、肉豆蘧醇、鯨蠟醇和正-十八醇；其中在攜有陽離子聚合物的脂質(zhì)中，陽離子聚合物選自多聚賴氨酸和多聚精氨酸。[0046]在另一個實施方案中，脂質(zhì)選自二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸。
[0047]在另一個實施方案中，脂質(zhì)體內(nèi)包含的藥物制劑包括生物分子和/或有機分子。該技術(shù)可用于美容和醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中目的是將活性劑遞送穿過膜例如皮膚的膜、粘膜的膜、血腦屏障或細胞膜。
[0048]本發(fā)明還涉及通過將大分子例如基因、蛋白質(zhì)和其他生物分子或有機分子運輸穿過血腦屏障來治療疾病的方法，其中所述方法包括施用組合物，所述組合物包含陰離子脂質(zhì)體(具有或不具有短鏈脂質(zhì))、包含在脂質(zhì)體中的安全且有效量的大分子治療劑和鞘脂激活蛋白C。
[0049]在其他實施方案中，本發(fā)明描述了組合物，所述組合物包含與鞘脂激活蛋白促融合膜或脂質(zhì)體混合或復(fù)合的或綴合至其的小核酸分子例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、micro-RNA (mRNA)或短發(fā)夾 RNA (shRNA)。
[0050]本發(fā)明還涉及可治療如下疾病的方法:成神經(jīng)細胞瘤、大腦炎癥(cerebralinflammation)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(MLD)、Niemann_Pick、中風(fēng)、帕金森病、阿爾茨海默氏病、脫髓鞘障礙(demyelination disorder)、視網(wǎng)膜神經(jīng)病(retinal neuropathy)、亨廷頓病、A.L.S.、多發(fā)性硬化、neuro-AIDS、腦癌、腦或脊髓創(chuàng)傷、自閉癥、溶酶體貯積病、脆性X綜合征、遺傳性共濟失調(diào)和失明，其中所述方法包括產(chǎn)生脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的步驟，在所述脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)中，脂質(zhì)體包含酸性長鏈脂質(zhì)(加入或不加入中性長鏈脂質(zhì)和中性短鏈脂質(zhì))以及鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白原和源自鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白原的其他蛋白質(zhì)、多肽類似物或多肽。脂質(zhì)體可包含治療劑例如抗炎劑、抗細胞凋亡劑和神經(jīng)保護藥、或酶、蛋白質(zhì)、或相應(yīng)的基因、鑒定為在此類疾病中缺乏的基因的DNA或RNA序列。
[0051]在一個實施方案中，提供了組合物和方法，其包含與促融合陰離子磷脂膜或脂質(zhì)體、源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽以及藥學(xué)上可接受的載體組合的多核苷酸或其前體。
[0052]在一個實施方案中，提供了包含與促融合陰離子磷脂膜或脂質(zhì)體、源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽以及藥學(xué)上可接受的載體組合的短干擾核酸(siNA)或其前體的組合物和方法。在本發(fā)明的新型組合物內(nèi)，可將siNA與促融合陰離子磷脂膜或脂質(zhì)體(具有源自鞘脂激活蛋白原的促融合蛋白或多肽)組合或復(fù)合或綴合至其，以形成增強siNA的細胞內(nèi)遞送的組合物。
[0053]本發(fā)明還包括用于治療戈謝病的組合物和方法，其中所述方法包括施用組合物，所述組合物包含全都包含在藥學(xué)上可接受的載體中的陰離子脂質(zhì)體、包含在脂質(zhì)體內(nèi)的安全且有效量的酸性β -葡糖苷酶以及鞘脂激活蛋白C，其中組合物的pH為約7、6.8,6.5、6、5.9,5.8,5.7,5.6,5.5,5.4,5.3,5.2,5.1,5.0或更低并且鞘脂激活蛋白C通過靜電和疏水相互作用與脂質(zhì)體的表面締合。通常，脂質(zhì)體的濃度相對于鞘脂激活蛋白C的濃度約I至10倍過量。在一個實施方案中，組合物的pH低于約6.8。在另一個實施方案中，組合物的pH低于約6.0。在另一個實施方案中，組合物的pH低于約5.5。在另一個實施方案中，組合物的pH低于約5.0。
[0054]本發(fā)明還涉及用于治療派爾集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches)、腸系膜淋巴結(jié)、支氣管淋巴結(jié)的組合物和方法，其中所述方法包括組合物的施用，所述組合物包含陰離子長鏈脂質(zhì)、長鏈中性脂質(zhì)和/或中性短鏈脂質(zhì)、安全且有效量的脂質(zhì)、DNA或蛋白質(zhì)抗原、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白原以及源自鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白原的其他蛋白質(zhì)、多肽類似物或多肽。
[0055]本發(fā)明還涉及對組織和細胞成像的組合物和方法，其中所述組合物包含含有鞘脂激活蛋白C的脂質(zhì)體和可檢測的顯像劑，所述可檢測的顯像劑選自MRI可檢測的試劑、熒光試劑、CT/PET可檢測的試劑、具有多個檢測性質(zhì)的試劑或其組合?？蓪⒃噭┣度胫|(zhì)膜或封裝入脂質(zhì)體內(nèi)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，鞘脂激活蛋白C脂質(zhì)體復(fù)合物可摻入1、2或3種具有不同成像性質(zhì)的不同的試劑，以便可將多種不同的檢測方法用于鞘脂激活蛋白C脂質(zhì)體的單次施用。 [0056]其他輔助試劑包括熒光團(例如熒光素、丹磺?；?、量子點等)和紅外染料(infrared dye)或金屬，其可用于光學(xué)或光成像(例如，共聚焦顯微術(shù)和熒光成像)。
[0057]在另一個實施方案中，組合物還包含放射性核素、螯合劑、生物素、熒光團、抗體、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、納米顆粒、量子點、抗癌劑的納米滴(nanodroplet)、抗癌劑或化學(xué)治療劑、脂質(zhì)體藥物、細胞因子或連接至其的小分子毒素。
[0058]在另一個實施方案中，顯像部分選自放射性核素、生物素、突光團、抗體、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、納米顆粒、量子點、可檢測的抗癌劑的納米滴、脂質(zhì)體藥物和細胞因子。
[0059]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉將放射性核素、螯合劑和螯合劑-接頭綴合物連接至本發(fā)明的配體的組合物和方法。具體地，放射性核素、螯合劑和螯合劑-接頭綴合物至本發(fā)明的配體的連接可使用例如商購可得的雙功能連接基團(通常異雙功能連接基團)來方便地實現(xiàn)，所述雙功能連接基團可連接至存在于化合物上的非干擾位置上的官能團，然后可進一步連接至例如放射性核素、化學(xué)治療劑、抗癌劑、納米顆粒、量子點、抗癌劑的納米滴或小分子毒素。利用這種方式，本發(fā)明的化合物可用于將適當(dāng)?shù)脑噭┻\送至靶位點，通常腫瘤或具有癌細胞的器官或組織。在另一個實施方案中，通過將生物素化的配體與鏈霉抗生物素蛋白 Qdot605 (Quantum Dot Corp.; Hayward, Calif) 一起溫育來制備配體 Qdot 復(fù)合物。
[0060]在本發(fā)明的一個實施方案中，包含可追蹤的顯像劑的脂質(zhì)體可用于靶向腫瘤例如成神經(jīng)細胞瘤，從而允許測定腫瘤大小、生長、位置或轉(zhuǎn)移。
[0061]本發(fā)明的上述概述不意欲描述本發(fā)明的每一個實施方案或每一個實現(xiàn)。通過參考下列詳細描述和權(quán)利要求以及附圖，本發(fā)明的有利方面和成就以及更全面的理解將變得顯然和易于理解。
[0062]在整個說明書中，除非另外指出，否則所有溫度以攝氏度給出，并且所有百分比是重量百分比。本文中提及的全部出版物為了描述和公開可與當(dāng)前公開的發(fā)明結(jié)合使用的組合物和方法(所述組合物和方法描述于出版物中)的目的，通過引用合并入本文。本文中論述的出版物僅是為了揭示在本申請的申請日之前的【背景技術(shù)】，這些【背景技術(shù)】不應(yīng)解釋為承認在先發(fā)明揭示了本發(fā)明。
[0063]附圖概述
[0064]權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明可通過參考下列附圖得到更好的理解。附圖不必按按比例繪制，而是將重點放在清楚地舉例說明本發(fā)明的原理。
[0065]圖1:鞘脂激活蛋白C誘導(dǎo)的融合的Clip-on模型:脂質(zhì)體結(jié)合的鞘脂激活蛋白C通過疏水相互作用彼此夾住(clip)，并誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合。
[0066]圖2:鞘脂激活蛋白C與脂質(zhì)體囊泡的締合:脂質(zhì)體結(jié)合的鞘脂激活蛋白C中發(fā)現(xiàn)的鞘脂激活蛋白折疊的構(gòu)象改變。鞘脂激活蛋白C的膜拓撲相互作用表明，氨基和羧基端上的兩親性螺旋包埋在脂雙分子層中并且鞘脂激活蛋白C的中間區(qū)域暴露于水相。鞘脂激活蛋白C的中間區(qū)域暴露于水相。
[0067]圖3:鞘脂激活蛋白C的神經(jīng)軸突生長性(neuritogenic)、酸性β葡糖苷酶激活和脂質(zhì)結(jié)合性質(zhì)的功能組織的示意圖。除了標示預(yù)測的轉(zhuǎn)角和二硫鍵的框外，圖不意味著代表已知的物理結(jié)構(gòu)。殘基22至32對于神經(jīng)營養(yǎng)性作用是極其重要的。橫跨殘基42至61的區(qū)域?qū)τ谇手せ畹鞍證的酸性β -葡糖苷酶激活效應(yīng)是至關(guān)重要的，全部3個二硫鍵的存在對于該功能也是非常重要的。此外，高級結(jié)構(gòu)是具有鞘脂激活蛋白C的完全活性所必需的。脂質(zhì)/脂質(zhì)膜相互作用區(qū)域位于NH2-和COOH-端區(qū)域。
[0068]圖4:由Ca2+ (a)或鞘脂激活蛋白C (b)在pH4.7或7.4誘導(dǎo)的BPS (腦磷脂酰絲氨酸)脂質(zhì)體的大小變化。中等自相關(guān)函數(shù)(Fair autocorrelation function), dust=0.0%,基線誤差〈1%，室溫。
[0069]圖5.NBD-DOPS和鞘脂激活蛋白C至小鼠腦的小腦的轉(zhuǎn)運。通過FBV/N成年小鼠的尾靜脈施用NBD-DOPS-鞘脂激活蛋白C蛋白脂質(zhì)體(A、C、D)和PBS (B、E、F)。在注射后48小時制備冷凍小腦切片。使用顯微鏡(Zeiss Axioskop, 100X)顯現(xiàn)用于檢測(A)和(B)中的DOPS的NBD綠色 熒光。在共聚焦顯微鏡(LSM510，Zeiss)下使用于檢測浦肯野細胞(Purkinje cell)中的鞘脂激活蛋白C (D和F)的NBD綠色熒光(C^PE)和抗His抗體(羅丹明綴合的二抗，紅色突光)成像。條棒(Bar): 20 μ m (C-F)。術(shù)語:p=浦肯野細胞；g=顆粒細胞。
[0070]圖6.?85中的？111?-271 (201^)/鞘脂激活蛋白(:-00?5蛋白脂質(zhì)體(圖6A)和PBS中的PTIR-316 (20 μ M)/SapC-DOPS蛋白脂質(zhì)體(圖6Β)的熒光光譜。
[0071]圖7.包含PTIR-271和PTIR-316的鞘脂激活蛋白-C-DOPS至人成神經(jīng)細胞瘤細胞(CHLA-20)內(nèi)的攝取。圖7Α顯示當(dāng)由SapC-DOPS脂質(zhì)體遞送時PTIR-271的攝取。圖7Β顯示當(dāng)由SapC-DOPS脂質(zhì)體遞送時PTIR-316的攝取。對照脂質(zhì)體(用無PTIR-271或PTIR-316的SapC-DOPS脂質(zhì)體處理)示于圖7C和7D中。紅色圖像代表染料的攝取。使用Zeiss Axiovert-ApoTome 顯微鏡(63Χ 和 40Χ 油鏡)進行可視化:λ ΕΧ/ λ ΕΜ ;分束器(Beamsplitter):660 ;細胞形態(tài)學(xué)的 B/W 相襯(phase contrast)。Axiovision 軟件用于成像。
[0072]圖8.使用 Sap-C-DOPS 脂質(zhì)體將 GFP22siRNA 遞送至 EGFP4T1 細胞內(nèi)。GFP22siRNA為特異性抑制綠色熒光蛋白基因表達的22個核苷酸的雙鏈RNA。(NJ Caplen等人，PNAS,2001,98 =9742-9747)。溫育時間為72小時。20x，800毫秒的暴光；Photoshop:輸入水平27，L 19，164 ;輸出水平255。大小3X2.29英寸。圖8A和8C代表含有GFP22siRNA的脂質(zhì)體；圖8B和8D代表其中使用不影響GFP表達的非沉默siRNA(由22個核苷酸的雙鏈RNA片段組成)的陰性對照。全部RNA購自QIAGEN。
[0073]圖9.GFP22siRNA至成神經(jīng)細胞瘤(CHLA-20)癌細胞內(nèi)的遞送的顯微照片，其顯示(a)羅丹明_GFP22siRNA ; (b)相襯和(c)合并的(merged)照片。
[0074]在示例性實施方案的下列描述中，參考附圖，所述附圖形成本申請的一部分，并且其中通過舉例說明可實踐本發(fā)明的各種實施方案來顯示。應(yīng)理解，可使用其他實施方案，并且可進行結(jié)構(gòu)和功能改變而不背離本發(fā)明的范圍。
[0075]發(fā)明詳述
[0076]在描述本組合物和方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限定于特定的方法、裝置和制劑，因為這些，當(dāng)然，可以進行變化。也應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案，而不是意欲限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只受所附權(quán)利要求的限定。
[0077]必須指出，如本文中和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文明確地指出，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“這個”、“這種”包括復(fù)數(shù)所指物。除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的那些相似或等同的任何方法、裝置和材料可用于實踐或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0078]定義
[0079]術(shù)語“施用的”和“施用”通常是指對患者施用生物相容性材料，包括，例如，脂質(zhì)和/或囊泡組合物和清洗劑(flush agent)。因此，“施用的”和“施用”是指，例如向血管內(nèi)注射脂質(zhì)和/或囊泡組合物和/或清洗劑。術(shù)語“施用的”和“施用”還可指遞送脂質(zhì)和/或囊泡組合物和/或清洗劑至目的區(qū)域。
[0080]如本文中所使用的，術(shù)語“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列或任何這些序列的片段，和指天然存在的或合成的分子。當(dāng)“氨基酸序列”在本文中用于指天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，“氨基酸序列”和類似的術(shù)語并不表示將氨基酸序列限定于與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完全天然的氨基酸序列。
[0081]術(shù)語"兩親性脂質(zhì)"意指具有親水性“頭部”基團和疏水性“尾部”基團并且具有形成膜的能力的分子。
`[0082]如本文中所使用的，術(shù)語〃陰離子磷脂膜〃和〃陰離子脂質(zhì)體〃是指包含脂質(zhì)成分并且在生理pH下具有總體負電荷的磷脂膜或脂質(zhì)體。
[0083]"陰離子磷脂"意指具有負電荷的磷脂，包括磷酸酯、硫酸酯和基于甘油的脂質(zhì)。
[0084]“生物活性劑”是指這樣的物質(zhì)，所述物質(zhì)可用于性質(zhì)上為診斷或治療的應(yīng)用，例如用于用來診斷疾病在患者中的存在或不存在的方法和/或用來治療患者的疾病的方法。如本文中所使用的，“生物活性劑”還指能夠在體外和/或體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。生物活性劑可以是中性的或帶正電荷或帶負電荷的。合適的生物活性劑的實例包括診斷劑、藥物制劑、藥物、合成的有機分子、蛋白質(zhì)、肽、維生素、類固醇和遺傳物質(zhì)，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。
[0085]術(shù)語〃包含在……中(內(nèi))"是指藥物試劑被包封在磷脂膜中，以便保護藥物試劑免受外部環(huán)境損害。該術(shù)語可與“封裝”互換使用。
[0086]“缺失”，如該術(shù)語在本文中所使用的，是指導(dǎo)致一個或多個氨基酸殘基或核苷酸的不存在的氨基酸或核苷酸序列的變化。
[0087]術(shù)語“衍生物”，如本文中所使用的，是指多肽序列或多核苷酸序列的化學(xué)修飾。多核苷酸序列的化學(xué)修飾可包括，例如，用烷基、酰基或氨基取代氫。衍生的多核苷酸編碼保持天然分子的至少一個生物學(xué)功能的多肽。衍生的多肽是例如通過糖基化或任何其他方法修飾的多肽，所述衍生的多肽保留其所源自的多肽的至少一個生物學(xué)功能。
[0088]術(shù)語“促融合蛋白或多肽”，如本文中所使用的，是指當(dāng)加入至兩個分開的雙分子層膜時可使它們?nèi)诤铣蓡蝹€膜的蛋白質(zhì)或肽。促融合蛋白迫使細胞或模型膜緊密接觸并且使它們?nèi)诤稀?br> [0089]如本文中所使用的，術(shù)語“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列中分別導(dǎo)致一個或多個氨基酸殘基或核苷酸至天然存在的分子中發(fā)現(xiàn)的序列的添加的變化。[0090]術(shù)語“脂質(zhì)”和“磷脂”可互換使用并且是指包含脂質(zhì)、磷脂或其衍生物的結(jié)構(gòu)，包括已知的脂質(zhì)在水性懸浮液中采用的多種不同結(jié)構(gòu)排列。此類結(jié)構(gòu)包括但不限于脂雙分子層囊泡、微團、脂質(zhì)體、乳液、囊泡、脂質(zhì)帶(lipid ribbon)或脂質(zhì)片(lipid sheet)。在優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)是陰離子脂質(zhì)體。脂質(zhì)可單獨使用或以本領(lǐng)域技術(shù)人員用于提供特定應(yīng)用所期望的特征的任何組合使用。此外，脂質(zhì)構(gòu)建和脂質(zhì)體形成的技術(shù)方面在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的并且本領(lǐng)域內(nèi)常用的任何方法可用于本發(fā)明。
[0091]“脂質(zhì)組合物”是指通常在水性介質(zhì)中包含脂質(zhì)化合物的組合物。示例性脂質(zhì)組合物包括懸浮液、乳液和囊泡組合物?！爸|(zhì)制劑”是指還包含生物活性劑的脂質(zhì)組合物。
[0092]“脂質(zhì)體”是指兩親性化合物(包括脂質(zhì)化合物)的通常球形的群集體(cluster)或聚集體，其通常以一層或多層同心層例如雙分子層的形式存在。它們在本文中還可稱為脂囊泡(lipid vesicle)。
[0093]術(shù)語“長鏈脂質(zhì)”是指碳鏈長度為大約13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24
的脂質(zhì)。在一個實施方案中，鏈長度選自18、19或20的鏈長度?？捎糜诒景l(fā)明的脂質(zhì)的實例可在網(wǎng)址WWW.avantilipids.com上獲得?？捎糜诒景l(fā)明的長鏈脂質(zhì)的代表性實例包括但不限于下列脂質(zhì):
[0094]14:0PS1, 2- 二肉豆蘧酰-sn_甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS) ;16:0PS1,2- 二棕櫚酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DPPS) ;17:0PS1，2-雙十七酰-sn-甘油 _3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；18:0PS1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DSPS) ; 18: 1PS1, 2- 二油酰-sn-甘油_3-[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(DOPS) ; 18:2PS 1，2- 二亞油酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；20:4PS1，2- 二花生四烯酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；22:6PS1，2-雙二十二碳六烯酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；16:0-18:1PSl-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)(POPS) ; 16:0-18:2PS1-棕櫚酰-2-亞油酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；16:0-22:6PS1-棕櫚酰-2- 二十二碳六烯酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；18:0-18:1PSl-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；18:0-18:2PS1-硬脂酰-2-亞油酰_sn_甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；18:0-20:4PS1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；18:0-22:6PS1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；16:0PC1, 2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC) ; 17:0PC1, 2-雙十七酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；18:OPCl，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC) ; 16:1PC(順)1，2-二掠櫚油酸 _sn_ 甘油-3-憐酸膽喊；16:1 反 PCI, 2-Dipalmitelaidoyl-sn-甘油-3-憐酸膽喊；18:1PCA 6 (順)1，2-Dipetroselinoyl-sn-甘油-3-憐酸膽堿；18:2PC(順)1，2- 二亞油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；18:3PC(順)1，2- 二亞麻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；20:1PC (順)1，2-Dieicosenoyl-sn-甘油-3-磷酸膽堿;22:1PC(Ji ) I, 2-Dierucoyl-sn-甘油-3-磷酸膽堿;22:0PC1, 2- 二山崳酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；24:1PC (順)1，2- 二神經(jīng)酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿;16:0-18: OPCl-棕櫚酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；16:0-18:1PCl-棕櫚酰_2_油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿;16:0-18: 2PC1-棕櫚酰-2-亞油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿;18:0-18:1PCl-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；18:0-18: 2PC1-硬脂酰_2_亞油酰_sn_甘油-3-磷酸膽堿；18:1-18: OPCl-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；18:1-16: OPCl-油酰-2-棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；18:0-20:4PC1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；16:0-18:1PGl-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油_3_[磷酸-rac_(l-甘油)](鈉鹽)(POPG) ; 18:1PG1, 2- 二油酰-sn-甘油 _3_[磷酸-rac-(l-甘油)](鈉鹽)(DOPG) ; 18:1PA1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸鹽(一鈉鹽)(DOPA) ; 18:1PI1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(銨鹽)；16:0 (D31)-18:1PIl-棕櫚酰(D31)_2_油酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(銨鹽)；18:1PE 1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE) ; 18:2PE1, 2- 二亞油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
[0095]如本文中所使用的，術(shù)語“核酸”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段?！昂怂帷笔侵钢辽賰蓚€堿基-糖-磷酸組合的串。(多核苷酸與寡核苷酸區(qū)別在于其包含120個以上的單體單位)。核苷酸是核酸聚合物的單體單位。該術(shù)語包括脫氧核糖核酸(DNA)和以寡核苷酸信使RNA形式存在的核糖核酸(RNA)、反義核酸、質(zhì)粒DNA、質(zhì)粒DNA的部分或來源于病毒的遺傳物質(zhì)。反義核酸是干擾DNA和/或RNA功能的多核苷酸。術(shù)語核酸是指至少兩個堿基-糖-磷酸組合的串。天然核酸具有磷酸主鏈，人工核酸可包含其他類型的主鏈，但包含相同的堿基。核苷酸是核酸聚合物的單體單位。該術(shù)語包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。RNA可以以tRNA(轉(zhuǎn)運RNA)、siRNA(短干擾核糖核酸)、snRNA (核內(nèi)小RNA)、rRNA (核糖體RNA)、mRNA (信使RNA)、反義RNA和核酶的形式存在。DNA可以以質(zhì)粒DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或這些種類的衍生物的形式存在。此外，此類形式的DNA和RNA可以是單鏈的、雙鏈的、三鏈的或四鏈的。該術(shù)語還包括PNA(肽核酸)、siNA(短干擾核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸酯主鏈的其他變體。
[0096]如本文中所使用的，術(shù)語“基于核苷酸的藥物試劑”或“基于核苷酸的藥物”是指包含核苷酸、寡核苷酸或核酸的藥物試劑或藥物。
[0097]〃患者〃或〃受試者〃是指動物,包括哺乳動物,優(yōu)選人。
[0098]如本文中所使用的，“藥物試劑或藥物”是指當(dāng)對患者適當(dāng)施用時能夠誘導(dǎo)期望的治療效果的任何化學(xué)或生物學(xué)材料、化合物或組合物。一些藥物以無活性形式銷售，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成具有藥物活性的代謝產(chǎn)物。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“藥物試劑”和“藥物”包括無活性的藥物和活性代謝產(chǎn)物。
[0099]術(shù)語“藥學(xué)或治療有效劑量或量”是指足以誘導(dǎo)期望的生物學(xué)結(jié)果的劑量水平。該結(jié)果可以是藥物試劑的遞送、疾病的體征、癥狀或病因的減輕或生物系統(tǒng)的任何其他期望的改變，活性劑的精確量取決于患者的身體狀況、正在治療的疾病的進展等。
[0100]如本文中所使用的，術(shù)語"鞘脂激活蛋白"是指鞘脂激活蛋白原衍生的蛋白質(zhì)和多肽的家族，包括但不限于天然存在的鞘脂激活蛋白A、B、C和D以及顯示促融合活性的合成的鞘脂激活蛋白衍生的蛋白質(zhì)和肽及肽類似物。鞘脂激活蛋白C和從其衍生的多肽可用于本發(fā)明的一個實施方案。[0101]術(shù)語“短鏈脂質(zhì)”是指碳鏈長度為4、5、6、7、8、9、10、11或12的脂質(zhì)。在一個實施方案中，碳鏈長度是6、7、8、9或10。在一個實施方案中，碳鏈長度是6、7或8。帶負電荷的短鏈脂質(zhì)的實例可在網(wǎng)站W(wǎng)WW.avantilipids.com上獲得?？捎糜诒景l(fā)明的短鏈脂質(zhì)的實例包括但不限于下列:06:0PS(DHPS) 1，2- 二己酰-sn_甘油_3_[磷酸-L-絲氨酸](鈉鹽)；08:(^51，2-二辛酰-811-甘油-3-[磷酸-1^-絲氨酸](鈉鹽)；03:(^(:1，2-二丙酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；04:0PC1，2-二丁酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；05:0PC1，2-二戊酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；06 = OPC(DHPC) 1，2- 二己酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；07:0PC1，2-二庚酰-sn-甘油_3_磷酸膽堿；08:0PC1，2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿;09:0PC1, 2- 二壬酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿;06:0PG1, 2- 二己酰-sn-甘油_3_[磷酸-rac-(l-甘油)](鈉鹽)；08:0PG1，2-二辛酰-sn-甘油 _3_[磷酸-rac_(l-甘油)](鈉鹽)；06:0卩六1，2-二己酰-811-甘油-3-磷酸鹽(一鈉鹽)；08:0卩六1，2-二辛酰-811-甘油-3-磷酸鹽(一鈉鹽)；06:0PE1，2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺;08: 0PE1，2-二辛酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
[0102]如本文中所使用的，術(shù)語“短干擾核酸”、“siNA”、“短干擾RNA”、“siRNA”、“短干擾核酸分子”、“短干擾寡核苷酸分子”或“化學(xué)修飾的短干擾核酸分子”是指能夠例如通過以序列特異性的方式介導(dǎo)RNA干擾“RNAi”或基因沉默來抑制或下調(diào)基因表達或病毒復(fù)制的任何核酸分子。在示例性實施方案中，siNA是包含自我互補的有義和反義區(qū)域的雙鏈多核苷酸分子，其中反義區(qū)域包含與要下調(diào)表達的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補的核苷酸序列，有義區(qū)域包含相應(yīng)于(即，在序列上大體上相同于)所述靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。“siNA”是指其為短長度雙鏈核酸(或任選其更長的前體)并且在靶細胞中沒有不可接受的毒性的小干擾核酸，例如siRNA。本發(fā)明內(nèi)有用的siNA的長度在某些實施方案中最優(yōu)化為大約21至2 3bp長的長度。然而，有用的siNA包括siRNA的長度不存在特定的限制。例如，最初可以以前體形式將siNA呈遞至細胞，所述前體形式顯著不同于當(dāng)遞送至靶細胞時或之后存在并發(fā)揮基因沉默活性的siNA的最終或加工形式。siNA的前體形式可以例如包括前體序列元件，所述前體序列元件在遞送時或遞送后被加工、降解、改變或切割，從而產(chǎn)生在細胞內(nèi)具有介導(dǎo)基因沉默的活性的siNA。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明內(nèi)的有用的siNA將具有例如大約100-200個堿基對，50-100個堿基對或少于大約50個堿基對的前體長度，其將在靶細胞中產(chǎn)生具有活性的經(jīng)加工的siNA。在其他實施方案中，有用的siNA或siNA前體長度為大約10至49bp、15至35bp或大約21至30bp。
[0103]“囊泡”是指球狀實體，其特征通常在于存在形成一個或多個內(nèi)空間的一層或多層壁或膜。可以例如從脂質(zhì)(包括本文中描述的各種脂質(zhì))、蛋白質(zhì)性質(zhì)的材料、聚合材料(包括天然、合成和半合成的聚合物)或表面活性劑配制囊泡。優(yōu)選的囊泡是包含從脂質(zhì)配制的壁或膜的囊泡。在這些優(yōu)選囊泡中，脂質(zhì)可以以單分子層或雙分子層的形式存在，并且單分子層或雙分子層脂質(zhì)可用于形成一層或多層單分子層或雙分子層。在超過一層單分子層或雙分子層的情況下，單分子層或雙分子層可以是同心的。脂質(zhì)可用于形成單層囊泡(包含一層單分子層或雙分子層)、寡層囊泡(包含大約2或大約3層單分子層或雙分子層)或多層囊泡(包含超過大約3層單分子層或雙分子層)。類似地，從蛋白質(zhì)或聚合物制備的囊泡可包含一層或多層同心壁或膜。從蛋白質(zhì)或聚合物制備的囊泡的壁或膜可以大體上是均質(zhì)的(均勻的)或它們可以是多孔的或半多孔的(sem1-porous)。本文中描述的囊泡包括通常稱為例如脂質(zhì)體、微團、泡囊(bubble)、微泡囊、微球體、由脂質(zhì)、聚合物、蛋白和/或表面活性劑包被的泡囊、微泡囊和/或微球體、微球、氣凝膠(aerogel)、包合物(clathrate)結(jié)合的囊泡等的此類實體。囊泡的內(nèi)空間可填充有液體(包括，例如，水性液體)、氣體、氣態(tài)前體和/或固體或溶質(zhì)材料，包括，例如，靶向性配體和/或生物活性劑(如所期望的)。
[0104]促融合蛋白或多肽
[0105]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含一種或多種溶酶體促融合蛋白或多肽的磷脂膜。在另一個實施方案中，一種或多種溶酶體促融合蛋白或多肽包含在陰離子脂質(zhì)體中。在另一個實施方案中，陰離子脂質(zhì)體還包含藥物試劑。
[0106]用于本發(fā)明的合適的溶酶體促融合蛋白和多肽包括但不限于鞘脂激活蛋白家族的蛋白，例如鞘脂激活蛋白C。還包括的是鞘脂激活蛋白C的同源物，其中所述同源物因編碼鞘脂激活蛋白C以及具有與鞘脂激活蛋白C相似的生物學(xué)活性的多肽和肽類似物的遺傳密碼的簡并性而具有至少80%的序列同源性。
[0107]肽或肽類似物的實例包括:
[0108]Ser-Asp-Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-1le-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-1le-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-Cys-Ser-Lys-Leu-Pro (SEQ.1D.N0.1)；
[0109]Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-1le-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-1le-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-Cys-Ser-Lys-Leu-Pro (SEQ.1D.N0.2)，
[0110]和其衍生物、類似物、同源物、片段和混合物。
[0111]還包括的是下式的多肽:
[0112]h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu-Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h,
[0113]其中h =疏水性氨基酸，包括Val、Leu、lie、Met、Pro、Phe和Ala ；以及u =不帶電荷的極性氨基酸，包括Thr、Ser> Tyr> Gly、Gln和Asn。
[0114]用于本發(fā)明的合適的溶酶體促融合蛋白和多肽包括但不限于鞘脂激活蛋白家族的蛋白質(zhì)，優(yōu)選鞘脂激活蛋白C。還包括的是鞘脂激活蛋白C的同源物，其中所述同源物因編碼鞘脂激活蛋白C以及具有與鞘脂激活蛋白C相似的生物學(xué)活性的多肽和肽類似物的遺傳密碼的簡并性而具有至少80%的序列同源性。
[0115]如本文中所使用的，術(shù)語“肽類似物”是指這樣的肽，其在氨基酸序列上與天然的肽相異僅在于保守氨基酸置換，例如Leu對Val的置換或Arg對Lys的置換等，或在于位于不破壞肽的生物學(xué)活性(在該情況下，肽的促融合性質(zhì))的位置上的一個或多個非保守氨基酸置換、缺失或插入。如本文中所使用的，肽類似物還可包括一個或多個氨基酸類似物(模擬氨基酸的結(jié)構(gòu)的分子)和/或在除了肽或肽類似物以外的分子中發(fā)現(xiàn)的天然氨基酸，作為其序列的部分或全部。
[0116]〃類似物〃意指本發(fā)明的肽的氨基酸序列中的置換或改變，所述置換或改變不會不利地影響肽的促融合性質(zhì)。因此，類似物可包含這樣的肽，所述肽具有與本文中提供為SEQ ID N0:1和2的肽大體上同一的氨基酸序列并且其中一個或多個氨基酸殘基已用化學(xué)上相似的氨基酸保守置換。保守置換的實例包括非極性(疏水性)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸對另一個氨基酸的置換。同樣地，本發(fā)明涉及極性(親水性)殘基例如精氨酸與賴氨酸之間、谷氨酰胺與天冬酰胺之間以及甘氨酸與絲氨酸之間的置換。此外，還涉及堿性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸對另一個氨基酸的置換或酸性殘基例如天冬氨酸或谷氨酸對另一個氨基酸的置換。
[0117]磷脂膜和脂質(zhì)體的形成
[0118]本發(fā)明利用陰離子磷脂膜來實現(xiàn)鞘脂激活蛋白介導(dǎo)的膜融合，從而將特定的藥物制劑或顯像劑遞送穿過皮膚的或粘膜的膜或穿過血腦屏障或其他細胞膜。此類陰離子磷脂膜通常用于制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是由同心脂質(zhì)雙分子層組成的微小囊泡并且，如本文中所使用的，是指由排列在球狀雙分子層中的兩親性脂質(zhì)組成的小囊泡。結(jié)構(gòu)上，脂質(zhì)體的大小和形狀可在長管至球體的范圍內(nèi)變動，尺寸在數(shù)百埃至毫米的范圍內(nèi)變動。無論總體形狀如何，雙分子層通常組織為密閉的同心薄層，水性層將各薄層與其相鄰層分開。囊泡大小通常在直徑大約20至大約30，OOOnm的范圍內(nèi)。
[0119]薄層之間的液膜通常為約3至10nm。用于制備不同脂質(zhì)體形式的多種方法已描述于期刊和專利文獻中。關(guān)于脂質(zhì)體形成的專門綜述和信息，可參見由Pagano和Weinstein撰寫的綜述(參見 Ann.Rev.Biophysic.Bioeng., 7, 435-68(1978)和 Ann.Rev.Biophysic.Bioeng.，9，467-508(1980))。
[0120]在一個實施方案中，陰離子磷脂膜是囊泡。在另一個實施方案中，囊泡是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是納米容器(nanocontainer)例如納米顆?；蛑|(zhì)體的形式，通常用于藥物的封裝。脂質(zhì)體優(yōu)選具有約200納米的平均直徑。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體具有50至350納米的平均直徑。在另一個實施方案中，脂質(zhì)體具有150至250納米的平均直徑。
[0121]脂質(zhì)體至靶組織例如增殖細胞團、瘤組織、炎性組織、發(fā)炎組織和受感染的組織的特異性遞送可通過選擇適合于將治療劑遞送至所述靶組織的脂質(zhì)體大小來實現(xiàn)。例如，具有180nm的平均直徑的脂質(zhì)體可能不在實體瘤中積累；具有140nm的平均直徑的脂質(zhì)體在相同實體瘤的外周積累，并且具有IlOnm的平均直徑的脂質(zhì)體在該實體瘤的外周和中心部分積累。
[0122]關(guān)于涉及囊泡組合物的實施方案，可就具體的期望的最終用途(包括例如診斷和/或治療用途)調(diào)整囊泡的大小。囊泡的大小在直徑上可優(yōu)選為約30納米(nm)至約300微米(μ m),以及在該范圍內(nèi)的所有組合和亞組合(subcombination)。更優(yōu)選,囊泡具有約IOOnm至約10 μ m的直徑,且約200nm至約7 μ m的平均直徑是更優(yōu)選的。關(guān)于具體的用途例如血管內(nèi)用途，包括血管系統(tǒng)的磁共振成像，囊泡可以優(yōu)選地直徑不大于約30 μ m，并且更小的囊泡是優(yōu)選的，例如，直徑不大于約12μπι的囊泡。在某些優(yōu)選實施方案中，囊泡的直徑可以為約7 μ m或更小，具有約5 μ m或更小的平均直徑的囊泡是更優(yōu)選的，具有約3 μ m或更小的平均直徑的囊泡是更優(yōu)選的。
[0123]必要時，可通過多種方法(包括例如搖動、微乳化、渦旋、擠出、過濾、超聲處理、勻化(homogenization)、反復(fù)凍融循環(huán)、在壓力下通過確定大小的孔的擠出和相似的方法)調(diào)整脂質(zhì)體的大小。
[0124]除了上述脂質(zhì)、蛋白質(zhì)性質(zhì)和/或多聚化合物外或取而代之，本文中描述的組合物可包括一種或多種穩(wěn)定材料(stabilizing material)。此類穩(wěn)定材料的實例是例如生物相容性聚合物。穩(wěn)定材料可用 于幫助囊泡的形成和/或確保氣體或氣態(tài)前體的充分封裝。即使對于相對不容的、非擴散性氣體例如全氟丙烷或硫六氟化物，當(dāng)將一種或多種穩(wěn)定材料用于充有氣體和氣態(tài)前體的囊泡的形成時，可獲得改良的囊泡組合物。此類化合物可在囊泡的大小、形狀和/或其他屬性方面幫助改善囊泡的穩(wěn)定性和完整性。
[0125]術(shù)語“穩(wěn)定的”或“經(jīng)穩(wěn)定的”，如本文中所使用的，表示囊泡可基本上抵抗降解，包括例如，囊泡結(jié)構(gòu)或封裝的氣體或氣態(tài)前體的喪失，持續(xù)有用的一段時間。通常，用于本發(fā)明的囊泡具有期望的貯存期限，通常在正常環(huán)境條件下保持其原始結(jié)構(gòu)體積的至少約90%至少大約2至3周的時間。在優(yōu)選形式中，囊泡的期望的穩(wěn)定時間是至少大約I個月，更優(yōu)選至少大約2個月，更優(yōu)選至少大約6個月，更優(yōu)選大約18個月和更優(yōu)選達到大約3年。本文中描述的囊泡，包括填充有氣體和氣態(tài)前體的囊泡，甚至在不利的條件例如高于或低于在正常環(huán)境條件下經(jīng)歷的溫度和壓力下也可以是穩(wěn)定的。
[0126]本文中描述的囊泡的穩(wěn)定性可以至少部分地歸因于制造囊泡的材料，包括例如上述脂質(zhì)、聚合物和/或蛋白質(zhì)，并且通常不必使用另外的穩(wěn)定材料，雖然任選地可這樣做和可優(yōu)選地這樣做。在下文中更詳盡地描述此類另外的穩(wěn)定材料和其特征。
[0127]構(gòu)建囊泡的材料優(yōu)選地是生物相容性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或聚合物材料，并且在此類材料中，生物相容性脂質(zhì)是優(yōu)選的。此外，由于配制的容易性(包括，能夠在即將施用之前制備囊泡)，可方便地現(xiàn)場制備此類囊泡。
[0128]用作制備填充有氣體和氣態(tài)前體的囊泡的穩(wěn)定材料的生物相容性聚合物可以是天然、半合成(經(jīng)修飾的天然)或合成來源的聚合物。如本文中所使用的，術(shù)語聚合物是指包含兩個或更多個重復(fù)單體單位，優(yōu)選10或更多個重復(fù)單體單位的化合物。如本文中所使用的，短語半合成的聚合物(或經(jīng)修飾的天然聚合物)是指，已以某些方式化學(xué)修飾的天然聚合物。適合用于本發(fā)明的示例性天然聚合物包括天然存在的多糖。此類多糖包括例如阿拉伯聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如，例如菊粉)、左聚糖、墨角藻聚糖、卡拉膠、galatocarolose、果膠酸、果膠,包括直鏈淀粉、普魯蘭多糖、糖原、支鏈淀粉、纖維素、右旋糖苷、`糊精、右旋糖、聚右旋糖、石耳素、殼多糖、瓊脂糖、角質(zhì)素、軟骨素(chondroitan)、皮膚素、透明質(zhì)酸、海藻酸、黃原膠、淀粉和各種其他天然同聚物或雜聚物，例如包含下列醛糖、酮糖、酸或胺的一種或多種的同聚物或雜聚物:赤蘚糖、蘇糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、lucose、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、赤蘚酮糖(erytirulose)、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺和神經(jīng)氨酸，和其天然存在的衍生物。因此，合適的聚合物包括例如蛋白質(zhì)，例如白蛋白。示例性半合成聚合物包括羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素和甲氧基纖維素。適合用于本發(fā)明的示例性合成的聚合物包括聚乙烯(例如，聚乙二醇、聚氧乙烯和聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthlate))、聚丙烯(例如,聚丙二醇)、聚氨酯(例如，聚乙烯醇(PVA)、聚氯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮)、聚酰胺包括尼龍、聚苯乙烯、聚乳酸、氟化碳氫化合物、氟化碳(例如，聚四氟乙烯)，和聚甲基丙烯酸甲酯，和其衍生物。當(dāng)本公開內(nèi)容與本領(lǐng)域內(nèi)已知信息例如美國專利5，205，290(其公開內(nèi)容以其全文通過引用合并入本文)中描述的和提及的信息結(jié)合時，一旦使用本公開內(nèi)容，用于制備囊泡的、使用聚合物作為穩(wěn)定化合物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是很顯然的。
[0129]通常，可基于它們的總體大小和薄層結(jié)構(gòu)的性質(zhì)將用于本發(fā)明的脂質(zhì)體分成3類(參見 1977 年 12 月的紐約學(xué)術(shù)科學(xué)會議，"Liposomes and Their Use in Biology andMedicine")。4個分類包括多層囊泡(MLV)、小型單層囊泡(SUV)、大型單層囊泡(LUV)和巨大單層囊泡(GUV)。SUV和LUV，按定義，只具有一個雙分子層，而MLV包含許多同心雙分子層。具有低多分散性的球狀單層囊泡(ULV)可在帶電荷的磷脂混合物中自發(fā)形成。此類低多分散性ULV的形成通常需要溫度的急劇升高或突然稀釋的過程。在一些情況下，自發(fā)低多分散性ULV經(jīng)檢查在一段時間內(nèi)和當(dāng)稀釋時是高度穩(wěn)定的，這表明其具有成為用于藥物遞送或基因療法的封裝載體的巨大潛力。參見Nieh,等人Low-PolydispersityPhospholipid Unilamellar Ellipsoidal Vesicles and Their Interaction withHelical Domains of Saposin C,手稿。
[0130]取決于它們的大小、組成和電荷，脂質(zhì)體展示廣泛多樣的特征。例如，具有小百分比的不飽和脂質(zhì)的脂質(zhì)體傾向于略微更可透過，然而摻入膽固醇或其他固醇的脂質(zhì)體傾向于更堅硬和較不可透過。取決于親水性基團，脂質(zhì)體在電荷上可以是正的、負的或中性的。例如，基于膽堿的脂質(zhì)賦予總體中性的電荷，基于磷酸和硫酸的脂質(zhì)貢獻負電荷，基于甘油的脂質(zhì)通常帶負電荷，并且固醇在溶液中通常是中性的但具有帶電荷的基團。用于本發(fā)明的脂質(zhì)是陰離子和中性脂質(zhì)。
[0131]與脂質(zhì)體組合物的制備相關(guān)的許多方法是可獲得的。因此，可使用許多常規(guī)脂質(zhì)體制備技術(shù)的任一種制備脂質(zhì)體，所述技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。此類技術(shù)包括例如溶劑透析、弗壓碎器(French press)、擠出法(利用或不利用凍融)、反相蒸發(fā)法、簡單凍融法、超聲處理、螯合透析(chelate dialysis)、勻化、溶劑輸注、微乳化、自發(fā)形成、溶劑蒸發(fā)、溶劑透析、弗氏壓碎器(French pressure cell)技術(shù)、受控去垢劑透析(controlled detergent dialysis)等,各自涉及以不同的方式制備囊泡。參見例如，Madden 等人，Chemistryand Physics of Lipids, 199053，37-46,其公開內(nèi)容通過引用完整并入本文。適當(dāng)?shù)膬鋈诩夹g(shù)描 述于例如1989年11月8日提交的國際申請系列N0.PCT/US89/05040,其公開內(nèi)容通過引用完整并入本文。關(guān)于脂質(zhì)體的制備，涉及凍融技術(shù)的方法是優(yōu)選的。可在溶液例如鹽水溶液、磷酸鹽緩沖水溶液或無菌水中進行脂質(zhì)體的制備。還可通過涉及搖動或渦旋的不同方法制備脂質(zhì)體。這可以例如通過使用機械搖動裝置例如 Wig-L-Bug(Crescent Dental, Lyons, 111.)、由 Degussa AG, Frankfurt, Germany 出售的 Mixomat,由 Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH&C0., Seefeld, OberayGermany 出售的 Capmix、由 Vivadent, Lechtenstein 出售的 Silamat Plus 或由 QuayleDental, Sussex, England出售的Vibros來實現(xiàn)。還可使用常規(guī)微乳化設(shè)備例如Microfluidizer(Microfluidics, Woburn, Mass.)。
[0132]還可使用噴霧干燥法制備囊泡。通過利用該方法，可在水性環(huán)境中預(yù)混合脂質(zhì)，然后將其噴霧干燥以產(chǎn)生填充有氣體的囊泡?？稍谄谕臍怏w的頂部空間下貯存在囊泡。
[0133]經(jīng)改造適用于制備囊泡組合物的許多脂質(zhì)體制備技術(shù)論述于例如美國專利N0.4，728，578;英國專利申請GB2193095A;美國專利 4，728，575;美國專利 N0.4，737，323;國際申請系列 N0.PCT/US85/01161 ;Mayer 等人,Biochimica et Biophysica Acta,第 858 卷，pp.161-168(1986);Hope 等人,Biochimica et Biophysica Acta,第 812卷,pp.55-65 (1985);美國專利 N0.4, 533, 254; Mayhew 等人,Methods in Enzymology,第 149 卷,pp.64-77(1987);Mayhew 等人,Biochimica et Biophysica Acta,第 755卷,pp.169-74 (1984) ; Cheng 等人,Investigative Radiology,第 22 卷，pp.47-55 (1987);國際申請系列 N0.PCT/US89/05040;美國專利 N0.4, 162, 282;美國專利 N0.4, 310, 505;美國專利 N0.4，921，706 ;和 Liposome Technology, Gregoriadis, G, ed.,第 I卷，pp.29-31，51-67 和 79-108 (CRC Press Inc., Boca Raton, Fla.1984)，其各自的公開內(nèi)容通過引用完整并入本文。
[0134]可選地，可在組合物的制劑中包含一種或多種抗菌試劑和/或防腐劑，例如苯甲酸鈉、季銨鹽、疊氮化納、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、山梨酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole)、丁輕甲苯、氯丁醇、脫氫醋酸、乙二胺、硫代甘油、苯甲酸鉀、焦亞硫酸鉀、山梨酸鉀、亞硫酸氫鈉、二氧化硫和有機汞鹽。當(dāng)穩(wěn)定的囊泡用于在侵入環(huán)境下例如血管內(nèi)或腹膜內(nèi)成像時，這樣的滅菌(其還可通過其他常規(guī)方法例如通過輻射來完成)將是必需的?；诒竟_內(nèi)容，滅菌的合適的方法對于技術(shù)人員來說將是顯然的。
[0135]與脂質(zhì)和/或囊泡組合物的制備一樣，可獲得眾多技術(shù)來制備脂質(zhì)制劑。例如，可從脂質(zhì)化合物、蛋白質(zhì)和生物活性劑的混合物制備脂質(zhì)和/或囊泡制劑。在該情況下，如上所述制備脂質(zhì)組合物，其中組合物還包括生物活性劑。因此，例如，可在生物活性劑存在的情況下制備微團。
[0136]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的，可將任何脂質(zhì)和/或囊泡組合物和/或脂質(zhì)和/或囊泡制劑凍干以便貯存，以及例如利用水性介質(zhì)(例如無菌水、磷酸鹽緩沖溶液或鹽水溶液)借助劇烈攪拌來重建。為了防止由于凍干而產(chǎn)生的脂質(zhì)和/或囊泡的凝集或融合，可有用地包含防止此類融合或凝 集發(fā)生的添加劑。可以使用的添加劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鈉、葡萄糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和聚(乙二醇)(PEG)例如PEG400。此類和其他添加劑描述于文獻，例如美國藥典，USP XXII，NF XVII，The United States Pharmacopeia, TheNational Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc.,12601TwinbrookParkway, Rockville, Md.20852中，其公開內(nèi)容通過引用完整并入本文。凍干的制劑通常具有更長的貯存期限的優(yōu)點。
[0137]通常，本發(fā)明的脂質(zhì)混合物包含陰離子長鏈脂質(zhì)。在一個實施方案中，用于合成包含鞘脂激活蛋白C的脂質(zhì)體的脂質(zhì)混合物包含:I)陰離子長鏈脂質(zhì)、2)中性長鏈脂質(zhì)和3)短鏈脂質(zhì)。短鏈脂質(zhì)可以是中性的或陰離子的。在另一個實施方案中，脂質(zhì)混合物只包含陰離子長鏈脂質(zhì)和中性或陰離子短鏈脂質(zhì)。下表舉例說明了可用于合成包含鞘脂激活蛋白C的脂質(zhì)體以便實現(xiàn)本發(fā)明的目的的磷脂的組合的實例?？墒褂帽疚闹忻枋龅姆椒ㄏ蛳铝兄|(zhì)的組合中加入鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白C的多肽。下列表1舉例說明可用于實踐本發(fā)明的磷脂的組合。例子不是窮盡性的，而只是意欲舉例說明本發(fā)明的可能的實施方案。
[0138]表1
[0139]表1.可與鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白C的多肽組合使用以形成根據(jù)本發(fā)明的包含促融合蛋白的脂質(zhì)體的長鏈和短鏈磷脂的組合。
[0140]
【權(quán)利要求】
1.用于將試劑遞送至生物膜的靶向生物膜的納囊泡，所述納囊泡包含: a.選自長鏈磷脂、短鏈脂質(zhì)和其混合物的一種或多種磷脂； b.安全且有效量的顯像劑或治療劑； c.源自鞘脂激活蛋白C的歸巢肽；和 d.藥學(xué)上接受的載體， 其中所述納囊泡能夠與被靶向的生物膜融合。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述歸巢肽具有這樣的序列，所述序列包含選自下列的式的約9個至約20個連續(xù)氨基酸:
EKEILDAFDKMCSKLPK
EKEILDAFDKMCSKLP
FDKMCSKLPK
FDKMCSKLP
EVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLP
KSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSG
SPELVCSMLHLCSG。
3.權(quán)利要求1的組合物·，其中所述歸巢肽具有下式的約9個至約20個連續(xù)氨基酸的序列:
AsnLysThrGluLysGluIleLeuAspAlaPheAspLysMetCysSerLysLeuProLyso
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述歸巢肽具有下式的約9個至約20個連續(xù)氨基酸的序列:
XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaPheAspLysMetCysSerLysLeuProXaa 其中位置I上的Xaa是Glu或不存在；其中位置2上的Xaa是Lys或不存在；其中位置3上的Xaa是Glu或不存在；其中位置4上的Xaa是Ile或不存在；其中位置5上的Xaa是Leu或不存在；其中位置6上的Xaa是Asp或不存在；其中位置7上的Xaa是Ala或不存在；以及其中位置17上的Xaa是Lys或不存在。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述歸巢肽具有選自下列的式的序列: glu-lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 17 phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 10
glu-lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 16
lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 15
glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 14
ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 13
leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 12
asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 11
ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 10
phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro 9
lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 16
glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 15
ile-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 14leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 13
asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 12
ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 11
phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 10
glu-lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 17
glu-lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 17
lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 16
glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 15
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leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-Xaa 13
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Xaa-lys-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 17
Xaa-Xaa-glu-1le-leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-leu-pro-lys 16
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Xaa-lys-glu-1le~leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 17
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Xaa-Xaa-Xaa-1le~leu-asp-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 15
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Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-ala-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 12
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 11
phe-asp-lys-met-cys-ser-lys-1eu-pro-Xaa 10 其中Xaa是選自val，leu, ile，met，pro, phe和ala的疏水性氨基酸；選自thr，ser,tyr, gly, gin和ash的不帶電荷的極性氨基酸；或不存在。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述磷脂是磷脂酰膽堿。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述磷脂酰膽堿選自二油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿、雙十五酰磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述磷脂選自二油酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和己酰磷脂酰膽堿。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述試劑是治療劑或顯像劑。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述試劑是顯像劑。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述顯像劑選自放射性核素、生物素、熒光團、抗體、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、納米顆粒、量子點、可檢測的抗癌劑的納米滴、脂質(zhì)體藥物和細胞因子。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述顯像劑綴合至歸巢肽。
13.用于將試劑靶向細胞或組織的膜的方法，其中所述方法包括給所述膜施用權(quán)利要求I的組合物，其中肽的濃度是足以將所述試劑遞送通過膜的量。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是顯像劑。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述顯像劑是選自磁共振、熒光或CT/PET可檢測標記的一種或多種試劑。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述顯像劑具有兩個或更多個成像性質(zhì)。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述顯像劑是包含熒光團和Gd(III)部分的PTIR染料，其能通過磁共振成像(MRI)或共聚焦熒光顯微術(shù)進行檢測。
18.權(quán)利要求13的方法，其中將所述顯像劑遞送穿過血腦屏障的膜，其中所述納囊泡的濃度是足以遞送安全且有效量的藥物試劑通過所述膜的量，并且其中所述磷脂形成總體電荷為負的脂 質(zhì)體。
【文檔編號】A61K49/18GK103585105SQ201310337957
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2008年11月7日
【發(fā)明者】祁曉陽 申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心