專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療和控制血管生成介導(dǎo)的疾病的材料和方法
用于治療和控制血管生成介導(dǎo)的疾病的材料和方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年11月7日、申請(qǐng)?zhí)枮?00780049307.9 (對(duì)應(yīng)國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2007/023535)、發(fā)明名稱(chēng)為“用于治療和控制血管生成介導(dǎo)的疾病的材料和方法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
相關(guān)的申請(qǐng)數(shù)據(jù)這個(gè)非臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)基 于35 U.S.C.Section 119 (e)要求了以下專(zhuān)利申請(qǐng)的權(quán)益:2006年11月7日提及的臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)U.S.S.N.60/857，458 ;2006年12月19日提交的臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)U.S.S.N.60/875,626 ;2007年4月17日提交的臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)U.S.S.N.60/923, 836以及2007年8月30日提交的臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)U.S.S.N.60/967, 029 ;每一個(gè)前述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用合并在此。
背景技術(shù)：
血管生成是從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)生長(zhǎng)新的血管的過(guò)程，在由外傷和外科手術(shù)引起的天然痊愈過(guò)程中涉及血管生成，外科手術(shù)包括實(shí)體腫瘤性癌的切除術(shù)。不同于病理性的血管生成的異常新血管形成在多種急性和慢性疾病狀態(tài)的發(fā)生和存續(xù)中涉及，包括黃斑變性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎和其他關(guān)節(jié)炎性狀況以及全身的炎癥性疾病，如下文所描述的。舉例來(lái)說(shuō)，年齡相關(guān)的黃斑變性的滲出性或新血管形成、角膜新血管形成和眼睛的其他新血管疾病，例如增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟性視網(wǎng)膜病、Steven’s-Johnson綜合征、瘢痕性類(lèi)天皰瘡、角膜同種異體移植物排斥和源自感染或外傷的角膜損傷，特征在于響應(yīng)于低氧環(huán)境和不受調(diào)節(jié)的炎癥的新血管、不適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)的和滲漏的血管的異常生長(zhǎng)。不治療的話，這些疾病是所有年齡的人群中失明的主要原因。例如，在年齡相關(guān)的黃斑變性中，異常新血管形成產(chǎn)生了視網(wǎng)膜下出血、中心凹內(nèi)光受體之下的液體積累以及外視網(wǎng)膜中神經(jīng)細(xì)胞死亡。如果未治療，異常的新血管過(guò)程通常引起中心凹下瘢痕形成和失明。滑液的新血管形成被認(rèn)為是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和存續(xù)中重要的早期步驟。異常新血管形成對(duì)于炎癥性血管翳的發(fā)生是必需的，沒(méi)有它，白細(xì)胞進(jìn)入就不會(huì)發(fā)生。此外，新血管的形成允許對(duì)增生的炎性細(xì)胞團(tuán)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物和氧，因此促進(jìn)了滑膜炎的存續(xù)。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通常被認(rèn)為是慢性的、炎癥性的自體免疫失調(diào)，其引起免疫系統(tǒng)攻擊關(guān)節(jié)。這是一種令人喪失能力的且痛苦的炎癥狀況，其可以由于疼痛和關(guān)節(jié)破壞引起明顯損失活動(dòng)能力。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是全身性疾病，常常影響整個(gè)身體的關(guān)節(jié)外的組織，包括皮膚、血管、心臟、肺和肌肉。在疾病的發(fā)作后十年，約60%的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者不能工作。新血管形成看起來(lái)是銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎中第一位的事件。已經(jīng)觀察到?jīng)]有指甲疾病的銀屑病患者的甲廓的血管形態(tài)學(xué)的異常，以及銀屑病性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織中滑膜血管數(shù)量的增加。銀屑病性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)病性銀屑病，是一種炎癥性的關(guān)節(jié)炎。雖然銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎是相關(guān)的失調(diào)，銀屑病性關(guān)節(jié)炎是具有它自己的流行病學(xué)特征、臨床特征和成因特征的不同的狀況。它影響了患有慢性皮膚狀況銀屑病的約5-7%的人。除了引起關(guān)節(jié)炎癥之外，銀屑病性關(guān)節(jié)炎可能引起腱炎和指炎。此外，患有銀屑病性關(guān)節(jié)炎的超過(guò)80%的患者將有銀屑病性指甲病變，特征在于指甲的凹陷，或者更極端地，指甲本身的失去。銀屑病性關(guān)節(jié)炎可以在任何年齡發(fā)生。然而，平均起來(lái)它傾向于在銀屑病的首次病征之后約10年出現(xiàn)。對(duì)于大部分患者，這是在30和50歲之間，但它也可以影響兒童。銀屑病性關(guān)節(jié)炎的當(dāng)前的治療類(lèi)似于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。重要的血管生成相關(guān)疾病是癌癥。癌癥是美國(guó)第二的主要死亡原因，占據(jù)了所有死亡的超過(guò)五分之一。雖然已知多種方法來(lái)治療癌癥，包括實(shí)體腫瘤的外科切除，以及放射、消融和化學(xué)治療來(lái)殺死癌細(xì)胞，在切除的或治療的位點(diǎn)的癌細(xì)胞的局部復(fù)發(fā)和局部損害或疾病，在癌癥患者的治療中仍然是很大的挑戰(zhàn)。外科的切除術(shù)代表了治療沒(méi)有顯示轉(zhuǎn)移到身體其他位置的跡象的局部疾病的最大的可能性。不幸的是，外科切除術(shù)治療的多達(dá)40%的癌癥患者將發(fā)生疾病的復(fù)發(fā)。對(duì)于血管生成相關(guān)狀況和疾病以及新血管形成相關(guān)狀況和疾病的當(dāng)前的治療是有限的。治療選擇隨著年齡、健康狀態(tài)和狀況的嚴(yán)重度而變化。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于異常新血管形成和病理性血管生成的位點(diǎn)的治療的方法和材料，目的是受影響或受治療位點(diǎn)的局部的定向痊愈。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用了以下發(fā)現(xiàn)，S卩，當(dāng)向異常新血管形成的位點(diǎn)或病理性血管生成的位點(diǎn)局部地提供包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料時(shí)，可以阻止、降低或抑制異常或病理性血管形成、炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解和/或所述位點(diǎn)處的MMP表達(dá)和/或活化，來(lái)治療受影響或受治療的組織或基質(zhì)，和/或來(lái)阻止在受影響或受治療位點(diǎn)處病理性血管系統(tǒng)或其他組織的生長(zhǎng)或再生。如在此公開(kāi)的，包含細(xì)胞，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞、具有內(nèi)皮樣表型的細(xì)胞、上皮細(xì)胞、具有上皮樣表型的細(xì)胞、非內(nèi)皮細(xì)胞或其類(lèi)似物的可植入材料可以在被置于受影響或受治療結(jié)構(gòu)的表面或之內(nèi)時(shí)用于阻止、治愈、治療和控制異常新血管形成或病理性血管生成的位點(diǎn)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)允許臨床醫(yī)師干涉患病組織的治療，對(duì)于所述患病組織迄今為止僅有有限的治療選擇。本發(fā)明的一個(gè)方面是在 有需要的個(gè)體中治療病理性血管生成的位點(diǎn)的方法，所述方法包括使可植入材料與血管生成區(qū)域之處的或鄰近或附近的表面接觸，其中所述可植入材料包含生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，以及進(jìn)一步的，其中所述可植入材料的量是在所述個(gè)體中治療所述病理性血管生成的位點(diǎn)的有效量。根據(jù)其他的實(shí)施方式，所述生物相容性基質(zhì)是柔性的平面材料或可流動(dòng)組合物。所述細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞、上皮細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞或非內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)各種實(shí)施方式，所述可植入材料調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)之處的細(xì)胞外基質(zhì)降解，或者調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)之處的MMP的表達(dá)和/或活化。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述病理性血管生成的位點(diǎn)是腫瘤切除術(shù)的位點(diǎn)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明是適合于異常新血管形成的位點(diǎn)的治療或控制的組合物，所述組合物包含生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，其中所述組合物的量是治療或控制所述異常新血管形成的位點(diǎn)的有效量。根據(jù)其他的實(shí)施方式，所述生物相容性基質(zhì)是柔性的平面材料或可流動(dòng)組合物。所述可流動(dòng)組合物可以進(jìn)一步包括附著的肽，細(xì)胞能夠移接到所述附著肽上。所述細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞、上皮細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞或非內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)各種實(shí)施方式，所述組合物調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)之處的細(xì)胞外基質(zhì)降解，或者調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)之處的MMP的表達(dá)和/或活化。本發(fā)明的另一個(gè)方面是在有需要的個(gè)體中治療異常新血管形成的位點(diǎn)的方法，所述方法包括使可植入材料與異常新血管形成之處的或鄰近或附近的表面接觸，其中所述可植入材料包含生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，以及進(jìn)一步的，其中所述可植入材料的量是在所述個(gè)體中治療所述異常新血管形成的位點(diǎn)的有效量。根據(jù)其他的實(shí)施方式，所述生物相容性基質(zhì)是柔性的平面材料或可流動(dòng)組合物。所述細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞、上皮細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞或非內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)各種實(shí)施方式，所述可植入材料調(diào)節(jié)所述異常新血管形成的位點(diǎn)之處的細(xì)胞外基質(zhì)降解，或者調(diào)節(jié)所述異常新血管形成的位點(diǎn)之處的MMP的表達(dá)。

根據(jù)各種實(shí)施方式，所述異常新血管形成的位點(diǎn)是黃斑變性的位點(diǎn)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的位點(diǎn)、銀屑病的位點(diǎn)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎的位點(diǎn)、或其他全身性炎性疾病的位點(diǎn)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明是適合于異常新血管形成的位點(diǎn)的治療或控制的組合物，所述組合物包含生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，其中所述組合物的量是治療或控制所述異常新血管形成的位點(diǎn)的有效量。根據(jù)其他的實(shí)施方式，所述生物相容性基質(zhì)是柔性的平面材料或可流動(dòng)組合物。所述可流動(dòng)組合物可以進(jìn)一步包括附著的肽，細(xì)胞能夠移接到所述附著肽上。所述細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞、上皮細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞或非內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)各種實(shí)施方式，所述組合物調(diào)節(jié)所述異常新血管形成的位點(diǎn)之處的細(xì)胞外基質(zhì)降解，或者調(diào)節(jié)所述異常新血管形成的位點(diǎn)之處的MMP的表達(dá)和/或活化。


附圖1A和IB是根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式的代表性細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。附圖2A描繪了在有和沒(méi)有用本發(fā)明的可植入材料治療的Matrigel基質(zhì)中通過(guò)HUVEC的體外血管生成的照片。附圖2B是在施用條件培養(yǎng)基或可植入材料之后在Matrigel基質(zhì)中HUVEC的血管生成水平或血管密度的圖形表示。附圖3是在第3天和在I個(gè)月用可植入材料治療的受試者和施用對(duì)照材料的受試者的染色組織切片中MMP-2表達(dá)的圖形表示。附圖4是在第3天和在I個(gè)月用可植入材料治療的受試者和施用對(duì)照材料的受試者的染色組織切片中MMP-9表達(dá)的圖形表示。
具體實(shí)施例方式如在此說(shuō)明的，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，S卩，基于細(xì)胞的療法可以用于治療、治愈、改善、控制和/或降低在包括腫瘤切除的位點(diǎn)的狀況下病理性血管生成的影響?；诩?xì)胞的療法還可以用于治療、治愈、改善、控制和/或降低在包括黃斑變性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎以及其他關(guān)節(jié)炎、以及全身性炎癥狀況的狀況中在受影響位點(diǎn)處和周?chē)M織和間質(zhì)上的異常新血管形成的影響。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)血管生成是指在正常的痊愈過(guò)程中發(fā)生的、在損傷或疾病的位點(diǎn)處形成或生長(zhǎng)新血管的過(guò)程。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)病理性血管生成是指在損傷或疾病的位點(diǎn)處形成異常和/或不需要的血管的過(guò)程。因此，優(yōu)選地在疾病發(fā)作、外科操作或介入之前或之時(shí)，或作為中斷性介入施用所述可植入材料來(lái)阻止和/或治療病理性血管生成。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)異常新血管形成是指在某些急性和慢性疾病和失調(diào)的發(fā)作時(shí)發(fā)生的、病理性的或異常的血管出現(xiàn)和生長(zhǎng)的結(jié)果。這與病理性血管生成不同。本發(fā)明對(duì)于減少或阻止血管的異常向內(nèi)生長(zhǎng)的持久建立是有用的。期待的是本發(fā)明的組合物產(chǎn)生局部化的環(huán)境，所述環(huán)境不支持異常密度的血管。例如，雖然血管可以生長(zhǎng)到特定位點(diǎn)中，但是本發(fā)明限制或調(diào)節(jié)最后永久地存在于特定位點(diǎn)處的那些血管。因此，優(yōu)選地在疾病或失調(diào)的發(fā)生或發(fā)作、外科操作或介入之后施用可植入材料來(lái)治療異常新血管形成。然而，本發(fā)明可以作為中斷性介入有效地使用，和/或用于防止?fàn)顩r惡化。以下呈現(xiàn)的教導(dǎo)提供了制造和使用本發(fā)明的材料和方法的足夠指導(dǎo)，進(jìn)一步提供了鑒定用于測(cè)試、測(cè)量和控制本發(fā)明的材料和方法的性能的指標(biāo)和受試者的足夠指導(dǎo)。
黃斑變性異常新血管形成在許多眼睛疾病，包括年齡相關(guān)的黃斑變性、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病和早熟性視網(wǎng)膜病中發(fā)生。不治療的話，這些疾病是嬰兒(早熟性視網(wǎng)膜病)、工作年齡的成年人(增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病)和老年人(年齡相關(guān)的黃斑變性)中失明的主要原因。新血管形成，特別是伴隨著眼睛的不同疾病的那些，常常響應(yīng)于低氧環(huán)境而被誘導(dǎo)。然而，這些疾病中的異常的新血管被不適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)并且是滲漏的，因而異常的新血管促進(jìn)了疾病的基礎(chǔ)性病理而不是糾正或補(bǔ)償疾病過(guò)程。在滲出性的或“濕的”形式的年齡相關(guān)黃斑變性中，異常新血管產(chǎn)生了視網(wǎng)膜下出血，中心凹內(nèi)光受體下液體積累以及外視網(wǎng)膜中神經(jīng)細(xì)胞死亡。如果未治療，異常的新血管過(guò)程通常導(dǎo)致中心凹下瘢痕形成。在患有早熟性視網(wǎng)膜病的早產(chǎn)兒中，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)是不良發(fā)育的，異常的滲漏的新血管生長(zhǎng)到視網(wǎng)膜的無(wú)血管的區(qū)域中。在嚴(yán)重的和未治療的病例中，異常新血管生長(zhǎng)到玻璃體，引起視網(wǎng)膜剝離和失明。在糖尿病中，過(guò)多葡萄糖對(duì)視網(wǎng)膜組織的直接效應(yīng)和可能涉及缺血和缺氧的對(duì)視網(wǎng)膜組織的間接效應(yīng)，被認(rèn)為是誘導(dǎo)異常新血管形成的原因。因而，對(duì)于這些眼睛病理的每一種，合理的治療策略是利用本發(fā)明的可植入材料調(diào)節(jié)病理性血管生成和異常新血管的形成。本發(fā)明的可植入材料可以施用給眼睛和/或周?chē)M織和間質(zhì)，來(lái)治療、改善、控制和/或降低與以下疾病相關(guān)的臨床后遺癥，并且可以控制或降低所述位點(diǎn)處的異常新血管形成:與年齡相關(guān)的黃斑變性、增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟性視網(wǎng)膜病、角膜新血管形成，包括Steven’ s-Johnson綜合征、瘢痕性類(lèi)天皰瘡、角膜同種異體移植物排斥和源自感染或外傷的角膜損傷。
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是特征在于炎癥性的侵蝕性滑膜炎的慢性的全身疾病?；ぶ械脑缙谧兓臉?biāo)志為異常 新血管形成、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和相關(guān)的滑膜細(xì)胞增生，其產(chǎn)生了炎癥性血管組織的血管翳。這種血管翳覆蓋并腐蝕關(guān)節(jié)軟骨，最終引起關(guān)節(jié)破壞。異常新血管形成被認(rèn)為是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中血管翳發(fā)生的基礎(chǔ)性部分，證據(jù)是病灶的內(nèi)皮增殖和滑膜中的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的可植入材料可以施用到類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或周?chē)M織和基質(zhì)的位點(diǎn)來(lái)治療、改善、控制和/或降低與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的臨床后遺癥，并抑制或降低所述位點(diǎn)處的異常新血管形成。
銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎銀屑病性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)病性銀屑病，是一種炎癥性的關(guān)節(jié)炎。雖然銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎是特征為新血管形成的相關(guān)的失調(diào)，銀屑病性關(guān)節(jié)炎是具有它自己的流行病學(xué)特征、臨床特征和成因特征的不同的狀況。它影響了患有慢性皮膚狀況銀屑病的約5-7%的人。除了引起關(guān)節(jié)炎癥之外，銀屑病性關(guān)節(jié)炎可能引起腱炎和指炎。此外，患有銀屑病性關(guān)節(jié)炎的超過(guò)80%的患者將有銀屑病性指甲病變，特征在于指甲的凹陷，或者更極端地，指甲本身的失去。已經(jīng)觀察到?jīng)]有指甲疾病的銀屑病患者的甲廓的血管形態(tài)學(xué)的異常，以及銀屑病性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織中滑膜血管數(shù)量的增加。本發(fā)明的可植入材料可以施用到銀屑病或銀屑病性關(guān)節(jié)炎和/或周?chē)M織和間質(zhì)的位點(diǎn)來(lái)治療、改善、控制和/或降低與銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的臨床后遺癥，并抑制或降低所述位點(diǎn)處的異常新血管形成。
全身性炎癥狀況除了類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和銀屑病性關(guān)節(jié)炎之外，全身的炎癥性或自體免疫狀況還包括，例如，全身性硬化(硬皮癥)、 全身性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎、Sjogren ’ s綜合征、混合結(jié)締組織病和全身性血管炎。在這些全身性炎癥性疾病中，白細(xì)胞通過(guò)血管系統(tǒng)遷移到疾病組織中。這些炎癥性疾病中存在的提高的異常新血管形成進(jìn)一步維持了白細(xì)胞進(jìn)入組織的外滲，這進(jìn)一步發(fā)展了所述炎性疾病。病理性血管生成以及特征在于異常新血管形成的疾病，包括全身的炎癥性或自體免疫狀況的疾病的后果，取決于新血管中介體和抑制物之間的平衡或不平衡。例如，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，存在著超過(guò)新血管抑制物的過(guò)量的新血管刺激物。為了重設(shè)這種平衡，異常新血管形成需要被抑制，例如，通過(guò)施用本發(fā)明的可植入材料。本發(fā)明的可植入材料可以施用到異常新血管形成和/或周?chē)M織和間質(zhì)的位點(diǎn)來(lái)治療、改善、控制和/或降低與病理性血管生成、全身的炎癥性或自體免疫疾病相關(guān)的臨床后遺癥，并抑制或降低所述位點(diǎn)處或附近的異常新血管形成。
腫瘤切除術(shù)腫瘤切除術(shù)是從患者中外科去除實(shí)體腫瘤。取決于腫瘤的大小和它的位置,根據(jù)各種實(shí)施方式，腫瘤切除術(shù)可以在開(kāi)放視野的外科操作中，或在最低限度侵入性的外科操作，例如腹腔鏡外科操作中進(jìn)行。根據(jù)其他的實(shí)施方式，腫瘤治療過(guò)程包括放射治療、加熱或光消融療法，或化學(xué)治療來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，期待的是切除位點(diǎn)包括經(jīng)歷用于治療或去除腫瘤或腫瘤細(xì)胞的局部療法的任何和所有位點(diǎn)。因而，切除位點(diǎn)包括但不限于經(jīng)歷外科切除、放射治療、消融療法和/或化學(xué)治療的位點(diǎn)。對(duì)于外科切除術(shù)來(lái)說(shuō)，在腫瘤的切除之后，先前圍繞腫瘤的組織產(chǎn)生了口袋或切除位點(diǎn)。對(duì)于放射、消融或化學(xué)治療來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞可以短暫地保留在切除位點(diǎn)。然而，放射、消融和化學(xué)治療除了殺傷局部的腫瘤細(xì)胞之外，還損傷周?chē)慕M織和間質(zhì)。因此，切除位點(diǎn)傾向于多種臨床的后遺癥，包括但不限于，炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解、病理性血管生成，以及在某些腫瘤類(lèi)型中，在切除的邊緣的腫瘤細(xì)胞再生和/或腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
進(jìn)一步的，腫瘤，以及切除位點(diǎn)，常常是高度血管化的。切除位點(diǎn)的外傷可以引起病理性血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解和其他與切除位點(diǎn)的破壞相關(guān)的臨床后遺癥。本發(fā)明的可植入材料可以施用到切除位點(diǎn)和/或周?chē)M織和間質(zhì)來(lái)治療、改善、控制和/或降低與腫瘤切除位點(diǎn)的外傷相關(guān)的臨床后遺癥，并抑制或降低所述位點(diǎn)處的病理性血管生成。切除位點(diǎn)處的病理性血管生成是腫瘤細(xì)胞的再生和/或轉(zhuǎn)移所必需的。因此，病理性血管生成的抑制將會(huì)抑制和/或限制腫瘤再生或轉(zhuǎn)移。另外，腫瘤小環(huán)境，包括間質(zhì)，是控制腫瘤的再生和轉(zhuǎn)移的重要因素。間質(zhì)包含多種細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，以及細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外分子。通常，由于它們接近腫瘤細(xì)胞和/或它們相互間的作用，在與腫瘤細(xì)胞接觸期間或之后，間質(zhì)的細(xì)胞獲得了異常的表型或改變了功能。本發(fā)明的可植入材料可以施用給腫瘤間質(zhì)和/或周?chē)M織來(lái)治療、改善、控制和/或降低與間質(zhì)的破壞和/或異常表型相關(guān)的臨床后遺癥。在外科或臨床治療的位點(diǎn)處或附近放置本發(fā)明的可植入材料，在降低與所述介入相關(guān)的輕度和急性炎癥方面以及降低、延遲或抑制與病理性血管生成狀況相關(guān)的炎癥方面是有效的。此外 ，可植入材料還降低受影響或受治療結(jié)構(gòu)的MMP表達(dá)和/或活化、細(xì)胞外基質(zhì)降解和病理性血管生成。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)受:損之后細(xì)胞從周?chē)M織遷移到損傷位點(diǎn)內(nèi)所必需的。活化的肌成纖維細(xì)胞具有基質(zhì)降解活性，其受到MMP和它們的內(nèi)源抑制物，基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制物(TMP)之間的凈平衡的調(diào)節(jié)。TMP能夠結(jié)合活化的MMP和它們的無(wú)活性的前體前-MMP (pro-MMP)o參見(jiàn)Nagase，H.，et al." MatrixMetalloproteinases" T Biol Chem 274 (31):21491-21494 (1999)。MMP 的增量調(diào)節(jié)和TIMP的減量調(diào)節(jié)與組織損傷之后消極的組織重塑(tissue remodeling)相合。例如,MMP的外膜表達(dá)在AV移植模型中在血管損傷之后提高，并且促進(jìn)成纖維細(xì)胞向新生內(nèi)膜的遷移。參見(jiàn)Whatling,C.et al., " Matrix Management:Assigning Different Roles for MMP-2and MMP-9 in Vascular Remodeling" Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.24:10-11(2004)以及 Galis, Z.S.et al., " Matrix Metalloproteinases in Vascular Remodeling andAtherogenesis:The Good, the Bad, and the Ugly" Circ.Res..90:251-262 (2002)。本發(fā)明的可植入材料可以施用給受影響或受治療的位點(diǎn)、間質(zhì)和/或周?chē)M織，來(lái)抑制MMP和/或恢復(fù)MMP和它們的抑制物TIMP的蛋白水解平衡，來(lái)抑制所述受影響或受治療位點(diǎn)處的異常血管生長(zhǎng)和/或再生。異常血管生長(zhǎng)的抑制減少了初生腫瘤或癌癥干細(xì)胞可獲得的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)，阻止了腫瘤的生長(zhǎng)、任何剩余的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和/或癌癥干細(xì)胞的成熟、分化和/或增殖。與施用對(duì)照材料相比，本發(fā)明的含有細(xì)胞的可植入材料的施用降低了受影響和被治療結(jié)構(gòu)中的MMP表達(dá)和病理性血管生成。病理性血管生成是支持腫瘤切除術(shù)之后不注意地保留的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)所必需的。本發(fā)明的可植入材料可以施用到切除位點(diǎn)、間質(zhì)和/或周?chē)M織來(lái)抑制所述切除位點(diǎn)處的病理性血管生成，從而抑制營(yíng)養(yǎng)物向初生腫瘤或癌癥干細(xì)胞的供應(yīng)，并阻止腫瘤的生長(zhǎng)、任何剩余腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、以及癌癥干細(xì)胞的成熟、分化和/或增殖。匯合的(confluent)內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種生物制劑,其組合地調(diào)節(jié)MMP表達(dá)、血管生成和新血管形成。被播種并容許在生物相容性基質(zhì)材料內(nèi)培養(yǎng)增殖到匯合的內(nèi)皮細(xì)胞可以被植入需要治療的受試者中，產(chǎn)生內(nèi)皮抑制性化合物的全部物質(zhì)。含有匯合的內(nèi)皮細(xì)胞的本發(fā)明的可植入材料可以將多種生物學(xué)反應(yīng)靶向到損傷。相比之下，單一化學(xué)試劑的施用僅響應(yīng)于單一事件?？芍踩氩牧蟽?nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞分泌硫酸乙酰肝素蛋白多糖、TGF-β和 ΜΡ-2，而實(shí)際上所有的 ΜΡ與MMP形成緊密的1:1抑制性復(fù)合物，同樣已知它們本身抑制血管生成?？芍踩牖|(zhì)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞還分泌氧化氮(NO)。其他研究已經(jīng)表明，在eNOS轉(zhuǎn)染的大鼠平滑肌細(xì)胞中，NO也降低MMP活性并提高 ΜΡ分泌。降低的MMP活性和提高的TIMP分泌與血管生成的抑制相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞能夠遞送所有的內(nèi)皮衍生的化合物，包括硫酸乙酰肝素、TGF- β >TIMP-2和NO，一起來(lái)降低MMP表達(dá)和/或活化、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管生成和新血管形成，并隨后治療、治愈和/或控制病理性血管生成或異常新血管形成的位點(diǎn)。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于細(xì)胞的療法，用于臨床上控制受到病理性血管生成、異常新血管形成影響的位點(diǎn)，以及狀況和/或治療方法來(lái)消除或降低所述狀況，包括控制炎癥、MMP表達(dá)和/或活化以及細(xì)胞外基質(zhì)降解。本發(fā)明的示范性的實(shí)施方式包含適用于在此描述的治療范例的生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“抑制”當(dāng)應(yīng)用于MMP活性時(shí)，意圖是定義在MMP酶的生物學(xué)活性水平方面的改變。因而，調(diào)節(jié)涵蓋了使得MMP活性降低的生理改變。抑制可以直接地或間接地出現(xiàn)，可以通過(guò)任何機(jī)制、在任何生理學(xué)水平被介導(dǎo)，包括例如，在基因表達(dá)的水平(包括，例如轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或翻譯后修飾)、在編碼調(diào)節(jié)元件的基因的表達(dá)的水平，所述調(diào)節(jié)元件直接或間接地作用于MMP活性的水平，或在酶活性的水平(例如，通過(guò)變構(gòu)機(jī)理、競(jìng)爭(zhēng)性抑制、活性位點(diǎn)失活、反饋抑制途徑的干擾，等等)。因而，MMP抑制可以意味著在轉(zhuǎn)錄水平上編碼一種或多種M MP的基因的受抑制的表達(dá)或低表達(dá)，和/或在翻譯水平上降低的表達(dá)。因而術(shù)語(yǔ)“抑制”和“抑制的”相對(duì)于MMP活性來(lái)解釋。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“介導(dǎo)”在任何生理過(guò)程(例如，組織重塑)、疾病、狀態(tài)、狀況、療法或治療的上下文中與MMP或 ΜΡ相關(guān)地使用時(shí)，是指有限度地運(yùn)作，從而所述各種過(guò)程、疾病、狀態(tài)、狀況、療法或治療是其中MMP或 ΜΡ起到生物學(xué)作用的那一些。MMP或 ΜΡ起到的生物學(xué)作用可以是直接的或間接的，可以是疾病、狀態(tài)或狀況的癥狀(或它的病因或發(fā)展)的顯現(xiàn)所必需的和/或足夠的。本發(fā)明的可植入材料包含在生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)移植的細(xì)胞。移接是指經(jīng)由細(xì)胞與細(xì)胞和/或細(xì)胞與基質(zhì)相互作用牢固地連接，從而細(xì)胞經(jīng)得起在此公開(kāi)的準(zhǔn)備性操作的苛刻條件。如在此其他地方說(shuō)明的，可植入材料的操作性實(shí)施方式包括具有優(yōu)選表型的近匯合、匯合或后匯合的細(xì)胞群體。要理解的是，可植入材料的實(shí)施方式可能在準(zhǔn)備性操作期間脫落細(xì)胞，和/或某些細(xì)胞不是與其他細(xì)胞一樣牢固地連接的。全部需要的是，可植入材料包含滿足在此闡述的功能或表型指標(biāo)的細(xì)胞。本發(fā)明的可植入材料是在組織工程化的原則上發(fā)展的，代表了解決上述臨床需求的新方法。本發(fā)明的可植入材料的獨(dú)特之處在于在所述生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)移接的活細(xì)胞能夠在生理學(xué)反饋控制之下以生理學(xué)比例供給受影響位點(diǎn)多種基于細(xì)胞的產(chǎn)物。如在此的其它地方描述的，適用于可植入材料的細(xì)胞是內(nèi)皮的、內(nèi)皮樣的、上皮的、上皮樣的、非內(nèi)皮的細(xì)胞，或任何上述細(xì)胞類(lèi)型的功能性類(lèi)似物。通過(guò)這些細(xì)胞的多種化合物的局部遞送以及生理上動(dòng)態(tài)的給藥，提供了對(duì)一些過(guò)程的更有效的調(diào)節(jié)，所述過(guò)程對(duì)于維持和治愈受影響位點(diǎn)、降低向所述位點(diǎn)的血管供應(yīng)，從而降低病理性細(xì)胞的再生、病理性血管生成或病理征候的再現(xiàn)負(fù)責(zé)。本發(fā)明的可植入材料當(dāng)與受影響位點(diǎn)、間質(zhì)或周?chē)M織接觸時(shí)，用來(lái)重建穩(wěn)態(tài)。也就是說(shuō)，本發(fā)明的可植入材料可以提供一種環(huán)境，其模擬了支持性的生理機(jī)能，并有助于促進(jìn)和維持理想的血管密度水平。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō),接觸是指直接或間接地與在此其他地方定義的內(nèi)表面或外表面相互作用。對(duì)于某些優(yōu)選的實(shí)施方式來(lái)說(shuō)，實(shí)際的物理接觸不是有效性所需的。在其他實(shí)施方式中，實(shí)際的物理接觸是優(yōu)選的。實(shí)踐本發(fā)明唯一所需的是，以有效治療受影響位點(diǎn)或基質(zhì)的數(shù)量，在受影響或受治療的位點(diǎn)或間質(zhì)之處、鄰近或附近沉積可植入材料。例如，內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放各種試劑，其組合地可以抑制或減緩病理性血管生成、異常新血管形成以及與外科手術(shù)或病理性血管生成和異常新血管形成的其他治療之后的急性并發(fā)癥相關(guān)的有害生理學(xué)事件。如在此例示的， 重現(xiàn)正常的生理機(jī)能和給藥的所使用的組合物和方法，對(duì)于增強(qiáng)受影響或受治療的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是有用的。一般地，治療包括將本發(fā)明的可植入材料置于受影響或受治療位點(diǎn)之處、鄰近或附近，例如，眼睛內(nèi)、關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)內(nèi)、銀屑病病變的表面上、或在切除操作期間產(chǎn)生的切除位點(diǎn)的內(nèi)部空間內(nèi)與間質(zhì)接觸。當(dāng)沉積或者以其他方式與受影響或受治療位點(diǎn)接觸時(shí)，可植入材料的細(xì)胞可以向所述位點(diǎn)提供生長(zhǎng)調(diào)節(jié)化合物，例如，向位點(diǎn)內(nèi)的基礎(chǔ)性基質(zhì)細(xì)胞提供。期待的是，當(dāng)置于鄰近的位點(diǎn)時(shí)，可植入材料的細(xì)胞提供了多種調(diào)節(jié)化合物的持續(xù)供應(yīng)，其可以穿透周?chē)M織并到達(dá)所述位點(diǎn)。使用本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式治療能夠促進(jìn)正常的或近正常的痊愈和正常的生理機(jī)能。相反地，在沒(méi)有本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式的治療時(shí)，正常的生理學(xué)的痊愈是受損害的，例如，MMP的表達(dá)和活化的提高可以引起有害的臨床結(jié)果，例如，炎癥、病理性血管生成、異常新血管形成、腫瘤再生和/或轉(zhuǎn)移。因而，如在此預(yù)期的，使用本發(fā)明的可植入材料治療將改善治療位點(diǎn)處天然組織的痊愈。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述可植入材料被施加于眼睛附近的外表面上或眼睛內(nèi)部的玻璃體內(nèi)來(lái)支持和促進(jìn)受影響位點(diǎn)處角膜斑翳的痊愈。黃斑變性和治療黃斑變性的外科手術(shù)可以破壞角膜斑翳和眼睛之處或周?chē)募?xì)胞和組織，并誘導(dǎo)細(xì)胞的反應(yīng)，包括但不限于，炎癥、異常新血管形成和/或由黃斑變性和治療黃斑變性的外科手術(shù)引起的其他臨床后遺癥。在治療之時(shí)向黃斑變性位點(diǎn)、間質(zhì)或周?chē)M織施用可植入材料可以降低臨床后遺癥的發(fā)生率和促進(jìn)受治療位點(diǎn)的痊愈。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述可植入材料被施加于關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的內(nèi)部腔體或該關(guān)節(jié)附近的外表面，來(lái)支持和促進(jìn)受影響位點(diǎn)處附著到骨骼的受影響的韌帶、肌腱或包膜的痊愈。類(lèi)風(fēng)濕性和銀屑病性關(guān)節(jié)炎和/或治療關(guān)節(jié)炎結(jié)構(gòu)的介入可能破壞圍繞關(guān)節(jié)炎位點(diǎn)的細(xì)胞和組織，并誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，包括但不限于，炎癥、異常新血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)降解和/或由關(guān)節(jié)炎或外科手術(shù)引起的其他臨床后遺癥。在治療之時(shí)向關(guān)節(jié)炎位點(diǎn)、間質(zhì)或周?chē)M織施用可植入材料可以降低臨床后遺癥的發(fā)生率和促進(jìn)受治療位點(diǎn)的痊愈。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方式，所述可植入材料可以應(yīng)用于銀屑病病變的位點(diǎn)處或附近的皮膚表面來(lái)促進(jìn)所述受影響位點(diǎn)處的受影響皮膚的痊愈。根據(jù)該實(shí)施方式，優(yōu)選地在所述可植入材料上施加繃帶或其他阻擋物來(lái)在治療的過(guò)程期間維持材料的有效性。銀屑病可以破壞銀屑病病變之處或附近的表皮細(xì)胞和皮膚組織層，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，包括但不限于，炎癥、異常新血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)降解和/或其他臨床后遺癥。在治療之時(shí)向銀屑病病變位點(diǎn)、間質(zhì)或周?chē)M織施用可植入材料可以降低臨床后遺癥的發(fā)生率和促進(jìn)受治療位點(diǎn)的痊愈。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，在切除腫瘤之后將所述可植入材料施用給受影響或受治療的位點(diǎn)來(lái)支撐所述切除空腔，并促進(jìn)圍繞切除位點(diǎn)以及在切除邊緣處的組織的痊愈。切除腫瘤的外科手術(shù)能夠破壞環(huán)繞腫瘤切除位點(diǎn)的細(xì)胞和組織，并誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，包括但不限于，炎癥、病理性血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解和/或由外科切除術(shù)引起的其他臨床后遺癥。在切除術(shù)之時(shí)、在切除術(shù)之后立即地、或在切除術(shù)之后稍后的時(shí)間，向切除位點(diǎn)、基質(zhì)或周?chē)M織施用可植入材料可以降低臨床后遺癥的發(fā)生率并促進(jìn)切除位點(diǎn)的痊愈。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述可植入材料可以促進(jìn)和/或恢復(fù)血管組織的受控增殖和/或遷移。黃斑變性、類(lèi)風(fēng)濕性和銀屑病性關(guān)節(jié)炎、銀屑病以及腫瘤補(bǔ)充和/或促進(jìn)受影響位點(diǎn)處的病理性血管生成或異常新血管形成來(lái)支持不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)。因而，腫瘤位點(diǎn)和由此的切除位點(diǎn)是高度血管化的組織。血管化的腫瘤的切除必然地引起對(duì)支持所切下的腫瘤的血管系統(tǒng)的外傷和/或損害。血管的外傷包括但不限于，被破壞的血管結(jié)構(gòu)的炎癥、血栓形成、狹窄和/或纖維化。在接觸或鄰近于所述被破壞的血管結(jié)構(gòu)的切除位點(diǎn)處施用可植入材料，可以降低與血管外傷相關(guān)的臨床后遺癥的發(fā)生率并抑制病理性血管生成。根據(jù)本發(fā)明 的進(jìn)一步的實(shí)施方式，可以在去除腫瘤之前將所述可植入材料應(yīng)用于切除位點(diǎn)來(lái)將正常的周?chē)M織與腫瘤組織分離，和/或來(lái)阻止在外科的切除期間移去的腫瘤細(xì)胞的不經(jīng)意污染引起的疾病向周?chē)M織和間質(zhì)或鄰近器官的擴(kuò)散。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在切除腫瘤之前施用所述可植入材料，例如，來(lái)準(zhǔn)備用于切除操作的外科位點(diǎn)，和/或來(lái)保護(hù)周?chē)M織免于切除術(shù)操作期間可能的腫瘤細(xì)胞移位。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述可植入材料可以在腫瘤的切除之后施用，例如，來(lái)減少來(lái)自切除的腫瘤附近的移位的腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)，和降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能性。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式,所述可植入材料被施加于多種切除的腫瘤位點(diǎn),包括但不限于，膀胱、骨骼、腦、乳腺、宮頸、結(jié)腸、食道、膽囊、腎臟、喉、肝臟、肺、口腔、卵巢、胰腺、前列腺、胃、睪丸或甲狀腺的腫瘤。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，相信的是，使用本發(fā)明的可植入材料的治療提供了有益的自我平衡性環(huán)境，從而，當(dāng)所述可植入材料被置于受影響或受治療結(jié)構(gòu)的鄰近或附近時(shí)，無(wú)論是在介入之時(shí)或是在后來(lái)，在全身性炎癥性和病理性血管生成性狀況和相關(guān)的介入中常見(jiàn)的癥狀和并發(fā)癥，例如，炎癥、凝結(jié)和/或附屬靜脈的生長(zhǎng)被降低?？梢栽谠S多不同階段的任何時(shí)候向被治療的結(jié)構(gòu)提供本發(fā)明的可植入材料。所述可植入材料可以在開(kāi)始的外科手術(shù)介入期間或之后提供，來(lái)一般性地加快痊愈，以及將受治療位點(diǎn)維持在臨床上的穩(wěn)定狀態(tài)。期待的是，所述可植入材料可以不僅在開(kāi)始治療的時(shí)間使用，而且在隨后的時(shí)點(diǎn)使用(例如，用于在外科操作之后維持受治療的位點(diǎn))。隨后的施用可以手術(shù)地或非侵入性地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的材料和方法可以與任何上文描述的狀況、或許多其他的治療或控制介入一起使用。此外，本發(fā)明的材料和方法可以與需要手術(shù)的任何介入一起使用來(lái)改善外科成功率并促進(jìn)痊愈。本發(fā)明的材料和方法可以與這些或其他手術(shù)一起使用來(lái)提高有效性并促進(jìn)痊愈。可植入材料一般間題:本發(fā)明的可棺入材料包含在牛物相容件基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)移植的細(xì)胞。移接是指經(jīng)由細(xì)胞與細(xì)胞和/或細(xì)胞與基質(zhì)相互作用牢固地連接，從而細(xì)胞經(jīng)得起在此公開(kāi)的準(zhǔn)備性操作的苛刻條件。如在此其他地方說(shuō)明的，可植入材料的操作性實(shí)施方式包括具有優(yōu)選表型的近匯合、匯合或后匯合的細(xì)胞群體。要理解的是，可植入材料的實(shí)施方式可能在準(zhǔn)備性操作期間脫落細(xì)胞，和/或某些細(xì)胞不是與其他細(xì)胞一樣牢固地連接的。唯一需要的是，可植入材料包含滿足在此闡述的功能或表型指標(biāo)的細(xì)胞。本發(fā)明的可植入材料是在組織工程化的原則上開(kāi)發(fā)的，代表了解決上述臨床需求的新方法。本發(fā)明的可植入材料的獨(dú)特之處在于在所述生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)移接的活細(xì)胞能夠在生理學(xué)反饋控制之下以生理學(xué)比例供給被切除位點(diǎn)多種基于細(xì)胞的產(chǎn)物。如在此的其它地方描述的，適用于可植入材料的細(xì)胞包括內(nèi)皮的、內(nèi)皮樣的、上皮的、上皮樣的、非內(nèi)皮的細(xì)胞，或任何上述細(xì)胞類(lèi)型的功能性類(lèi)似物。在生理上動(dòng)態(tài)的給藥中這些細(xì)胞進(jìn)行的多種化合物的局部遞送，提供了對(duì)以下過(guò)程的更有效的調(diào)節(jié)，所述過(guò)程是減少與全身性炎癥狀況、病理性血管生成相關(guān)的癥狀、以及維持功能上切除的結(jié)構(gòu)、以及減少與切除相關(guān)的臨床后遺癥的原因。在此期待的是，表面可以是眼睛、關(guān)節(jié)、皮膚或切除的結(jié)構(gòu)的外表面，眼睛、關(guān)節(jié)、皮膚或切除的結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，切除邊緣之處，或圍繞這樣的結(jié)構(gòu)的組織之內(nèi)。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，表面是受影響或受治療的結(jié)構(gòu)之處或附近的任何部分。本發(fā)明的可植入材料當(dāng)沉積或以其他方式與受影響或受治療位點(diǎn)或周?chē)M織接觸時(shí)，用來(lái)重建穩(wěn)態(tài)。也就是說(shuō)，本發(fā)明的可植入材料可以提供一種環(huán)境，其模擬了支持性的生理機(jī)能并有助于處理或控制治療的位點(diǎn)。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，接觸是指直接或間接地與在此其他地方定義的受影響結(jié)構(gòu)的外表面或內(nèi)表面相互作用。對(duì)于某些優(yōu)選的實(shí)施方式來(lái)說(shuō)，實(shí)際的物理接觸不是有效性所需的。在其他實(shí)施方式中，實(shí)際的物理接觸是優(yōu)選的。實(shí)踐本發(fā)明唯一所需的是，以有效治療所述位點(diǎn)的數(shù)量， 在受影響位點(diǎn)之處、鄰近或附近實(shí)現(xiàn)可植入材料的外部或內(nèi)部沉積。內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放各種各樣的試劑，這些試劑組合地可以抑制或緩解與急性和慢性的并發(fā)癥相關(guān)的有害生理學(xué)事件，所述事件是由于例如全身性炎癥狀況、病理性血管生成狀況、異常新血管形成狀況或腫瘤切除術(shù)而導(dǎo)致的。如在此例示的，重現(xiàn)正常的生理機(jī)能和給藥的組合物和使用方法，對(duì)于治療和控制這些狀況是有用的。一般地，治療包括將本發(fā)明的可植入材料置于受影響位點(diǎn)之處、鄰近或附近，例如，放置在早先被所切除的腫瘤占據(jù)的間隙中，或與間質(zhì)直接接觸。當(dāng)沉積于受影響位點(diǎn)處或以其他方式與受影響位點(diǎn)接觸時(shí)，可植入材料的細(xì)胞可以向所述受影響位點(diǎn)提供調(diào)節(jié)化合物。期待的是，當(dāng)接觸受影響位點(diǎn)時(shí)，包含具有移植細(xì)胞的生物相容性基質(zhì)或顆粒的本發(fā)明的可植入材料提供了來(lái)自細(xì)胞的多種調(diào)節(jié)化合物的連續(xù)供應(yīng)。細(xì)胞來(lái)源:如在此描述的，本發(fā)明的可植入材料包括細(xì)胞。細(xì)胞可以是異源的、異種的或自體的。在某些實(shí)施方式中，活細(xì)胞的來(lái)源可以來(lái)自適合的供體。在某些其他實(shí)施方式中，細(xì)胞的來(lái)源可以來(lái)自尸體或來(lái)自細(xì)胞庫(kù)。在一個(gè)當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種內(nèi)皮細(xì)胞從血管組織獲得，優(yōu)選的但不限于動(dòng)脈組織。如以下例示的，適合使用的一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。適合使用的另一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。以及，適合使用的另一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。適合使用的又一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是隱靜脈的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。適合本發(fā)明使用的其他種類(lèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和回腸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。在另一種當(dāng)前的優(yōu)選實(shí)施方式中，適合的內(nèi)皮細(xì)胞可以從非血管組織獲得。非血管組織可以來(lái)自任何解剖結(jié)構(gòu)、組織或器官。非血管組織可以來(lái)自進(jìn)行治療的任何組織類(lèi)型。非血管的解剖結(jié)構(gòu)包括腎臟系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及腦和脊髓的室系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞可以來(lái)自內(nèi)皮祖細(xì)胞或干細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞一般可以來(lái)自祖細(xì)胞或干細(xì)胞。在其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是同種異體的、異種的或自體的非內(nèi)皮細(xì)胞，并且可以來(lái)自血管或非血管的組織或器官。細(xì)胞可以在它們的組織來(lái)源和/或它們的免疫原性的基礎(chǔ)上來(lái)選擇。示范性的非內(nèi)皮細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、分泌和纖毛細(xì)胞。本發(fā)明還預(yù)期遺傳改變的、修飾的或工程化的任何上述細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，兩種或多種細(xì)胞被共培養(yǎng)來(lái)制備當(dāng)前的組合物。例如，第一細(xì)胞可以導(dǎo)入到生物相容的可植入材料中并培養(yǎng)直到匯合。第一細(xì)胞類(lèi)型可以包括，例如，分泌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合、任何其他期望的細(xì)胞類(lèi)型或適合于創(chuàng)建有助于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的期望細(xì)胞類(lèi)型的組合。一旦第一細(xì)胞類(lèi)型達(dá)到匯合，第二細(xì)胞類(lèi)型被播種到生物相容性基質(zhì)之中、之上或之內(nèi)的第一匯合細(xì)胞類(lèi)型的頂部，并培養(yǎng)直到第一細(xì)胞類(lèi)型和第二細(xì)胞類(lèi)型達(dá)到匯合。第二細(xì)胞類(lèi)型可以包括，例如，內(nèi)皮細(xì)胞或任何其他期望的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞類(lèi)型的組合。預(yù)期的是，第一和第二細(xì)胞類(lèi)型可以逐步地或作為單一混合物來(lái)引入。還預(yù)期的是，細(xì)胞密度可以被修改來(lái)改變平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例。為了防止平滑肌細(xì)胞或其他傾向于過(guò)度增殖的細(xì)胞類(lèi)型的過(guò)度增殖，可以修改培養(yǎng)過(guò)程。例如，在第一細(xì)胞類(lèi)型的 匯合之后，可以在引入第二細(xì)胞類(lèi)型之前用適合于第二細(xì)胞類(lèi)型的附著因子包被培養(yǎng)物。示范性的附著因子包括用明膠包被培養(yǎng)物來(lái)改善內(nèi)皮細(xì)胞的附著。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，肝素可以在培養(yǎng)第二細(xì)胞類(lèi)型期間添加到培養(yǎng)基中來(lái)降低第一細(xì)胞類(lèi)型的增殖并優(yōu)化期望的第一細(xì)胞類(lèi)型與第二細(xì)胞類(lèi)型比例。例如，在平滑肌細(xì)胞的初步生長(zhǎng)之后，可以施用肝素來(lái)控制平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)以實(shí)現(xiàn)更大的內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的比例。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)首先用平滑肌細(xì)胞播種生物相容的可植入材料來(lái)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)，從而創(chuàng)建共培養(yǎng)物，所述結(jié)構(gòu)例如是但不限于，模擬治療位點(diǎn)的大小和/或形狀的結(jié)構(gòu)。一旦平滑肌細(xì)胞達(dá)到匯合，將內(nèi)皮細(xì)胞播種到可植入材料上培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞頂部來(lái)創(chuàng)建模擬的結(jié)構(gòu)。唯一需要的是，當(dāng)前組合物的細(xì)胞是展現(xiàn)了一種或多種優(yōu)選的表型或功能性質(zhì)的細(xì)胞。如在此較早描述的，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與優(yōu)選的基質(zhì)(在此其他地方描述)結(jié)合時(shí)，具有易于鑒定的表型的細(xì)胞可以促進(jìn)、修復(fù)和/或以其他方式調(diào)節(jié)通常與受影響結(jié)構(gòu)的治療相關(guān)的細(xì)胞生理機(jī)能和/或細(xì)胞或組織穩(wěn)態(tài)。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的細(xì)胞的一種這樣優(yōu)選的、易于鑒定的典型表型是抑制或以其他方式干擾平滑肌細(xì)胞增殖和/或遷移的能力，如以下描述的體外分析所測(cè)定的。這在此稱(chēng)為抑制性表型。由當(dāng)前組合物的細(xì)胞展現(xiàn)的一種另外的易鑒定的表型是，它們是抗血栓性的或能夠抑制血小板粘附和聚集?？寡ɑ钚钥梢允褂萌缦滤龅捏w外硫酸乙酰肝素分析和/或體外血小板凝聚分析來(lái)測(cè)定。當(dāng)前組合物的細(xì)胞所展現(xiàn)的另一種易鑒定的表型是，恢復(fù)蛋白水解平衡、MMP-TIMP平衡的能力，相對(duì)于TMP的表達(dá)降低MMP的表達(dá)的能力，或相對(duì)于MMP的表達(dá)提高TMP的表達(dá)的能力。蛋白水解平衡活性可以使用如下所述的體外TMP分析和/或體外MMP分析來(lái)測(cè)定。當(dāng)前組合物的細(xì)胞所展現(xiàn)的另一種易鑒定的表型是抑制管形成的能力。管形成活性可以利用如下所述的體外Matrigel分析來(lái)測(cè)定。在本發(fā)明的典型操作性實(shí)施方式中，細(xì)胞不必展現(xiàn)超過(guò)一種上述表型。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞可以展現(xiàn)超過(guò)一種上述表型。雖然上述表型各自代表了功能性的內(nèi)皮細(xì)胞，例如但不限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是展現(xiàn)了這種表型的非內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)被考慮為內(nèi)皮樣的，并因而適用于本發(fā)明。內(nèi)皮樣的細(xì)胞在此也稱(chēng)為內(nèi)皮細(xì)胞的功能類(lèi)似物；或內(nèi)皮細(xì)胞的功能模擬物。因而，僅僅舉例來(lái)說(shuō)，適用于在此公開(kāi)的材料和方法的細(xì)胞還包括產(chǎn)生內(nèi)皮樣細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞；非內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的但使用在此列出的參數(shù)又功能上表現(xiàn)像內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞；任何來(lái)源的、被工程化或以其他方式修飾以具有使用在此列出的參數(shù)的內(nèi)皮樣功能的細(xì)胞。一般地，當(dāng)以匯合、近匯合或后匯合群體存在并與例如在此其他地方描述的優(yōu)選的生物相容性基質(zhì)結(jié)合時(shí)，本發(fā)明的細(xì)胞展現(xiàn)一種或多種上述表型。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，細(xì)胞的匯合、近匯合或后匯合群體可以通過(guò)各種技術(shù)容易地鑒定，最常見(jiàn)和廣泛承認(rèn)的是直接顯微鏡檢查·。其他計(jì)數(shù)包括使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)評(píng)估每份表面積的細(xì)胞數(shù)量，例如但不限于血球計(jì)數(shù)器或庫(kù)爾特粒度儀。另外，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，內(nèi)皮樣細(xì)胞包括但不限于功能上和表型上模仿或模擬匯合的、近匯合的或后匯合內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞，如在此所列的參數(shù)所測(cè)量的。因而，使用以下闡述的詳細(xì)說(shuō)明和指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)師將理解如何生產(chǎn)、使用、測(cè)試和鑒定在此公開(kāi)的可植入材料的操作性實(shí)施方式。也就是說(shuō)，在此提供的教導(dǎo)公開(kāi)了生產(chǎn)和使用本發(fā)明的可植入材料所需的所有內(nèi)容。進(jìn)一步的，在此提供的教導(dǎo)公開(kāi)了鑒定、生產(chǎn)和使用含有操作上等效的細(xì)胞的組合物所必需的所有內(nèi)容。實(shí)際上，所有需要的是，含等效細(xì)胞的組合物對(duì)于根據(jù)在此公開(kāi)的方法治療、控制、調(diào)節(jié)和/或改善受影響位點(diǎn)是有效的。熟練醫(yī)師將理解的是，當(dāng)前組合物的等效實(shí)施方式可以僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)和在此提供的教導(dǎo)來(lái)鑒定。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的可植入材料中使用的內(nèi)皮細(xì)胞從人類(lèi)尸體供體的主動(dòng)脈分離。每一批細(xì)胞來(lái)自單個(gè)供體或來(lái)自多個(gè)供體,廣泛地測(cè)試內(nèi)皮細(xì)胞純度,生物學(xué)功能，細(xì)菌、真菌、已知的人類(lèi)病原體和其他外來(lái)試劑的存在。細(xì)胞使用公知的技術(shù)低溫保存并入庫(kù)，用于稍后在培養(yǎng)中擴(kuò)增用于隨后配制在生物相容性可植入材料中。細(xì)胞制備:如上所述，適合的細(xì)胞可以從各種組織類(lèi)型和細(xì)胞類(lèi)型獲得。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，可植入材料中使用的人類(lèi)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離自尸體供體的主動(dòng)脈。在其他實(shí)施方式中，豬的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)用于分離人類(lèi)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的相似操作分離自正常的豬主動(dòng)脈。每一批細(xì)胞可以來(lái)自單個(gè)供體或來(lái)自多個(gè)供體，廣泛地測(cè)試內(nèi)皮細(xì)胞生存力，純度，生物學(xué)功能，支原體、細(xì)菌、真菌、酵母、已知的人類(lèi)病原體和其他外來(lái)試劑的存在。細(xì)胞使用公知的技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)增、表征和低溫保存，來(lái)形成處于第三到第六次傳代的工作細(xì)胞庫(kù)，用于稍后在培養(yǎng)中擴(kuò)展，并用于隨后配制到生物相容性可植入材料中。人類(lèi)或豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在通過(guò)添加每燒瓶約15ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基而預(yù)處理的T-75燒瓶中制備。人類(lèi)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EGM-2，Lonza, Basel,Switzerland)中制備。EGM-2由補(bǔ)充有含2%FBS的EGM-2單等分量的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2，Lonza)構(gòu)成。豬細(xì)胞在補(bǔ)充有5%FBS和50 μ g/ml慶大霉素的EBM-2中制備。燒瓶置于維持在大約37°C和5%C02/95%空氣、90%濕度的孵化器中至少30分鐘。細(xì)胞的一個(gè)或兩個(gè)小瓶從_160°C移動(dòng)到_140°C冷凍器，在大約37°C解凍。每個(gè)解凍細(xì)胞的小瓶以大約3 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2的密度、優(yōu)選不低于1.0X IO3和不超過(guò)7.0X IO3的密度播種到兩個(gè)T-75燒瓶中；將含有細(xì)胞的燒瓶放回孵化器中。在約8-24小時(shí)之后，除去消耗了的培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基替換。此后，每?jī)傻饺旄淖兣囵B(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到優(yōu)選的約85-100%匯合，但不低于60%和不超過(guò)100%。當(dāng)所述可植入材料預(yù)計(jì)用于臨床應(yīng)用時(shí)，在人類(lèi)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的解凍后培養(yǎng)中和本發(fā)明的可植入材料制造中僅使用無(wú)抗生素培養(yǎng)基。然后除去內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用IOml HEPES緩沖鹽水(HEPES)沖洗單細(xì)胞層。除去HEPESj^W 2ml胰蛋白酶來(lái)從T-75燒瓶表面剝離細(xì)胞。一旦發(fā)生剝離，添加3mL胰蛋白酶中和溶液(TNS)來(lái)終止酶反應(yīng)。添加另外5mL HEPES，使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。離心細(xì)胞懸浮液，對(duì)于人類(lèi)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，使用無(wú)抗生素的EGM-2調(diào)節(jié)到密度大約2.0-1.75 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，或?qū)τ谪i細(xì)胞來(lái)說(shuō)，使用補(bǔ)充有5%FBS和50 μ g/ml慶大霉素的EBM-2調(diào)節(jié)到密度大約 2.0-1.50 X IO6 個(gè)細(xì)胞 /ml。生物相容性基質(zhì):根據(jù)本發(fā)明，所述可植入材料包含生物相容性基質(zhì)。所述基質(zhì)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和附著到基質(zhì)之上或之內(nèi)是容許的。所述基質(zhì)是柔性的和貼合的(conformable)ο所述基質(zhì)可以是固體、半固體或可流動(dòng)的多孔組合物。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，可流動(dòng)組合物是指能夠利用注射或注`射型遞送裝置，例如但不限于，針、注射器或?qū)Ч芏┯玫慕M合物。采用擠壓、噴出或排出的其他遞送裝置也是在此預(yù)期的。多孔基質(zhì)是優(yōu)選的。所述基質(zhì)也可以是處于柔性平面形式。所述基質(zhì)也可以是凝膠、泡沫、懸浮液、顆粒、微載體、微囊或纖維結(jié)構(gòu)的形式。優(yōu)選的可流動(dòng)組合物是保持形狀的。當(dāng)前優(yōu)選的基質(zhì)具有顆粒形狀。所述生物相容性基質(zhì)可以包含顆粒和/或微載體，所述顆粒和/或微載體可以進(jìn)一步包含明膠、膠原蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白或附著肽。一種示范性的附著肽是序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸鹽(RGD)的肽。所述基質(zhì)，當(dāng)植入到受影響結(jié)構(gòu)的外或內(nèi)表面上時(shí)，在它生物侵蝕之前可以存留在植入位置至少約7-90天，優(yōu)選的約至少7-14天，更優(yōu)選約至少14-28天，最優(yōu)選約至少28-90 天。一種優(yōu)選的基質(zhì)是Gelfoam. (Pfizer, Inc., New York, NY), 一種可吸收的明膠海綿(以下稱(chēng)“Gelfoam基質(zhì)”)。另一種優(yōu)選的基質(zhì)是Surgifoam.⑩〔Johnson & Johnson,New Brunswick, NJ),其也是一種可吸收的明膠海綿。Gelfoam和Surgifoam基質(zhì)是從特別處理的、純化的豬皮明膠溶液制備的多孔的和柔性的外科用海綿。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述生物相容性基質(zhì)材料可以是修飾的基質(zhì)材料。當(dāng)細(xì)胞與基質(zhì)相連時(shí)，可以選擇對(duì)基質(zhì)材料進(jìn)行修飾，來(lái)優(yōu)化和/或控制細(xì)胞的功能，包括如上所述的細(xì)胞的表型(例如，抑制性表型)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，對(duì)基質(zhì)材料的修飾包括用增強(qiáng)細(xì)胞能力的附著因子或粘附肽來(lái)包被所述基質(zhì)，以降低細(xì)胞外基質(zhì)降解、減少病理性血管生成、減少異常新血管形成、提聞TIMP廣生、減少炎癥、提聞硫酸乙酸肝素廣生、提聞如列環(huán)素產(chǎn)生、和/或提高TGF- ^ !和氧化氮(NO)產(chǎn)生。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述基質(zhì)是Gelfoam以外的基質(zhì)。其他示范性的基質(zhì)材料包括，例如，血纖蛋白凝膠、藻酸鹽、聚苯乙烯磺酸鈉微載體、膠原包被的葡聚糖微載體、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物(每種共聚物的聚合物比例為1_100%)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，合成的基質(zhì)材料，例如PLA/PGA用NaOH處理來(lái)提高材料的親水性，從而，提高細(xì)胞附著到所述材料的能力。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，這些其他的基質(zhì)被修飾以包括附著因子或粘附肽，如以上敘述和描述的。示范性的附著因子包括，例如，明膠、膠原蛋白、纖連蛋白、血纖蛋白凝膠、和利用標(biāo)準(zhǔn)的含水碳二亞胺化學(xué)作用(aqueous carbodiimide chemistry)共價(jià)連接的細(xì)胞粘附配體(包括例如RGD)。其他細(xì)胞粘附配體包括具有細(xì)胞粘附識(shí)別序列的肽，所述細(xì)胞粘附識(shí)別序列包括但不限于:RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR、GRGDY和REDV?？芍踩氩牧系膶?shí)施方式:如前所述，本發(fā)明的可植入材料可以是柔性的平面形式或可流動(dòng)組合物。當(dāng)處于柔性的平面形式時(shí)，它可以采取多種形狀和大小，優(yōu)選的，當(dāng)置于受影響或被切除位點(diǎn)之處、鄰近或附近時(shí)，符合受影響結(jié)構(gòu)或被切除結(jié)構(gòu)的輪廓內(nèi)表面或外表面的形狀和大小。適合于照這樣使用的優(yōu)選的構(gòu)型的實(shí)例在共同擁有的、在2005年12月6日提交的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US05/43967 (代理人編號(hào)N0.ELV-002PC)中公開(kāi)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用合并在此。可流動(dòng)組合物:在此預(yù)期的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的可植入材料是可流動(dòng)組合物，其包含顆粒的生物相容性基質(zhì)，所述基質(zhì)可以處于凝膠、泡沫、懸浮液、顆粒、微載體、微囊、大孔的珠子或其他可流動(dòng)材料的形式。本發(fā)明預(yù)期提供可以用注射型遞送裝置施用的任何可流動(dòng)組合物。例如，可以 在受影響或被切除結(jié)構(gòu)的內(nèi)部穿過(guò)的遞送裝置，或透皮注射型遞送裝置，適合于這種目的，如下文所描述的?？闪鲃?dòng)組合物優(yōu)選的是保持形狀的組合物。因而，在此處預(yù)期的可流動(dòng)型顆?；|(zhì)之中、之上或之內(nèi)包含細(xì)胞的可植入材料，可以被配制用于任何可注射遞送裝置，所述遞送裝置內(nèi)徑范圍從約18規(guī)格(gauge)到約26規(guī)格，并能夠遞送約50mg包含顆粒材料的可流動(dòng)組合物，在約I到3ml的所述可流動(dòng)組合物中含有約I百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。根據(jù)當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式，所述可流動(dòng)組合物包括生物相容的顆粒基質(zhì)，例如Gelfoam 顆粒、Gelfoam 粉劑、或粉碎的 Gelfoam ⑧(Pfizer Inc.,New York,NY)(在下
文中稱(chēng)為"Gelfoam顆?！?，其是來(lái)自豬皮明膠的產(chǎn)品。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述顆?；|(zhì)是 Surgifoam (Johnson & Johnson,New Brunswick,NJ)顆粒，包括可吸收的明膠粉末。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述顆?；|(zhì)是Cytodex-3 (Amersham Biosciences, Piscataway,NJ)微載體，包含與交聯(lián)的葡聚糖基質(zhì)結(jié)合的變性的膠原蛋白。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方式，顆粒基質(zhì)是 CultiSpher-G (Percell Biolytica AB, Astorp, Sweden)微載體,包含豬明膠。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，顆?；|(zhì)是大孔材料。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述大孔顆?；|(zhì)是CytoPore (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)微載體，包含被帶正電的 N，N, -二乙氨基乙基基團(tuán)取代的交聯(lián)的纖維素。根據(jù)可選擇的實(shí)施方式，所述生物相容的可植入顆?；|(zhì)是修飾的生物相容性基質(zhì)。修飾包括以上對(duì)于可植入基質(zhì)材料描述的那些。適合根據(jù)本發(fā)明用來(lái)控制受影響位點(diǎn)中痊愈的發(fā)生和/或發(fā)展的相關(guān)可流動(dòng)組合物在共同擁有的、2005年12月6日提交的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US05/43844 (代理人編號(hào)N0.ELV-009PC)中公開(kāi)了，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)弓I用合并在此?？芍踩氩牧系闹苽?在細(xì)胞播種之前，生物相容性基質(zhì)通過(guò)添加沒(méi)有抗生素的EGM-2在大約37°C和5%C02/95%空氣中再水化12到24小時(shí)。然后從它們的再水化容器中移出可植入材料，放置到各個(gè)組織培養(yǎng)平皿中。以大約1.5-2.0X IO5個(gè)細(xì)胞(1.25-1.66X IO5個(gè)細(xì)胞/cm3基質(zhì))的優(yōu)選的密度播種生物相容性基質(zhì)，置于維持在大約37°C和5%C02/95%空氣、90%濕度中的孵化器中3-4小時(shí)以便于細(xì)胞附著。播種的基質(zhì)然后放置到各個(gè)容器(Evergreen, Los Angeles, CA)中，這些容器各自裝有帶0.2 μ m過(guò)濾器的帽子并含有EGM-2，在大約37°C和5%C02/95%空氣下溫育。做為選擇，三件播種的基質(zhì)可以置于150mL瓶子中。此后，每?jī)傻饺旄淖兣囵B(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到匯合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中的細(xì)胞優(yōu)選的傳代6次，但是 可以使用更少或更多次傳代的細(xì)胞。細(xì)朐牛長(zhǎng)曲線和匯合:在或大約第3或4、6或7、9或10、和12或13天移出可植入材料的樣品，計(jì)數(shù)細(xì)胞并評(píng)定生存力，構(gòu)建和評(píng)估生長(zhǎng)曲線以評(píng)估生長(zhǎng)特點(diǎn)，和確定是否達(dá)到匯合、近匯合或后匯合。在附圖1A和IB中呈現(xiàn)了來(lái)自包含豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞植入批次的可植入材料的兩個(gè)制品的代表性生長(zhǎng)曲線。在這些實(shí)例中，所述可植入材料處在柔性平面形式。一般地，普通技術(shù)人員將理解早期、中期和晚期時(shí)點(diǎn)的可接受的細(xì)胞生長(zhǎng)的特征，例如在早期時(shí)點(diǎn)時(shí)觀察到細(xì)胞數(shù)量增加(當(dāng)參考附圖1A時(shí)，約2-6天之間)，隨后是近匯合階段(參考附圖1A時(shí)，在約6-8天之間)，隨后是如相對(duì)恒定的細(xì)胞數(shù)量所指示的，一旦細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)細(xì)胞數(shù)量的平臺(tái)期(參考附圖1A時(shí)，在約8-10天之間)，和當(dāng)細(xì)胞是后匯合時(shí)細(xì)胞數(shù)量的維持(參考附圖1A時(shí)，在約10-14天之間)。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，處于平臺(tái)期至少72小時(shí)的細(xì)胞群體是優(yōu)選的。通過(guò)使用CaCl2溶液中的0.5mg/mL膠原酶的溶液完全消化可植入材料的等分量，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)。在測(cè)量消化的可植入材料的體積之后，用0.4%錐石藍(lán)稀釋已知體積的細(xì)胞懸液(細(xì)胞與錐石藍(lán)的比例為4:1 )，通過(guò)錐石藍(lán)排阻評(píng)定生存力。使用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞、非存活細(xì)胞和總細(xì)胞。通過(guò)將活細(xì)胞數(shù)目相對(duì)于培養(yǎng)天數(shù)作圖來(lái)構(gòu)建生長(zhǎng)曲線。在達(dá)到匯合之后將細(xì)胞裝運(yùn)和移植。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，匯合被定義為當(dāng)可植入材料是柔性平面形式(1.0X4.0X0.3cm)時(shí)存在至少約4X IO5個(gè)細(xì)胞/cm3，當(dāng)可植入材料是柔性組合物時(shí)優(yōu)選的每等分量(50-70mg)約7X105到IXlO6個(gè)總細(xì)胞。對(duì)這兩者，細(xì)胞生存力是至少約90%，但優(yōu)選不低于80%。如果到第12或13天細(xì)胞不匯合，改變培養(yǎng)基，繼續(xù)溫育額外一天。繼續(xù)這個(gè)過(guò)程直到達(dá)到匯合或直到播種后14天。在第14天，如果細(xì)胞沒(méi)有匯合，全部丟棄該批次。如果在進(jìn)行過(guò)程中檢查之后確定細(xì)胞是匯合的，進(jìn)行最后的培養(yǎng)基改變。這種最后的培養(yǎng)基改變使用沒(méi)有酚紅和沒(méi)有抗生素的EGM-2進(jìn)行。在培養(yǎng)基改變之后立刻地，給試管裝上無(wú)菌栓塞密封帽用于裝運(yùn)。功能和表型的評(píng)估:對(duì)于在此描述的發(fā)明來(lái)說(shuō)，在植入之前進(jìn)一步測(cè)試可植入材料的功能和表型的指標(biāo)。例如，在培養(yǎng)期間收集條件培養(yǎng)基來(lái)確定培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸乙酰肝素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子I1 (TGF-^)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制物(TMP)和氧化氮(NO)的水平。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)總細(xì)胞數(shù)量是至少約2、優(yōu)選至少約4X IO5個(gè)細(xì)胞/cm3可植入材料；活細(xì)胞的百分比是至少約80-90%，優(yōu)選彡90%，最優(yōu)選至少約90% ;條件培養(yǎng)基中的硫酸乙酰肝素是至少約0.23-1.0，優(yōu)選至少約0.5微克/mL/天；條件培養(yǎng)基中的TGF- ^ I是至少約200-300皮克/mL/天，優(yōu)選至少約300皮克/ml/天；條件培養(yǎng)基中的b-FGF低于約200皮克/ml，優(yōu)選不超過(guò)約400皮克/ml ;條件培養(yǎng)基中的TIMP-2是至少約5.0-10.0ng/mL/天,優(yōu)選至少約8.0ng/mL/天；條件培養(yǎng)基中的NO是至少約0.5-3.0 u mol/L/天，優(yōu)選至少約2.0 y mol/L/天時(shí),所述可植入材料可以用于在此描述的目的。硫酸乙酰肝素水平可以使用常規(guī)的二甲基亞甲藍(lán)-軟骨素酶ABC消化分光光度分析來(lái)定量?？偭蛩峄前肪厶?GAG)水平使用二甲基亞甲藍(lán)(DMB)染料結(jié)合分析來(lái)測(cè)定，其中未知樣品與使用在搜集培養(yǎng)基中稀釋的已知數(shù)量的純化硫酸軟骨素產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。在添加DMB顯色試劑之前將其他的條件培養(yǎng)基樣品與軟骨素酶ABC混合來(lái)消化軟骨素和硫酸皮膚素。在與GAG標(biāo)準(zhǔn)物混合的DMB染料的最大波長(zhǎng)吸光度下，一般在約515-525nm下測(cè)定所有的吸光度。通過(guò)條件培養(yǎng)基樣品中總硫酸化糖胺聚糖濃度乘以通過(guò)酶消化所計(jì)算的硫酸乙酰肝素百分比，來(lái)計(jì)算每天的硫酸乙酰肝素濃度。軟骨素酶ABC活性通過(guò)消化純化的100%硫酸軟骨素的樣品以及純化的硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素的50/50混合物來(lái)確定。如果低于100%的純化的硫酸軟骨素被消化，適當(dāng)?shù)匦Ｕ龡l件培養(yǎng)基樣品。硫酸乙酰肝素水平也可以使用采用單克隆抗體的ELISA分析來(lái)定量。TGF-e 1、TIMP和b-FGF水平可以使用采用單克隆或多克隆抗體、優(yōu)選多克隆抗體的ELISA分析來(lái)測(cè) 定。對(duì)照搜集培養(yǎng)基也可以使用ELISA分析來(lái)定量，根據(jù)對(duì)照培養(yǎng)基中存在的TGF-P UTIMP和b-FGF水平適當(dāng)?shù)匦Ｕ龢悠?。氧化?NO)水平可以使用標(biāo)準(zhǔn)的格里斯反應(yīng)分析來(lái)定量。氧化氮的短暫和揮發(fā)性特性使它不適合大多數(shù)檢測(cè)方法。然而，氧化氮的兩種穩(wěn)定的分解產(chǎn)物，硝酸(NO3)和亞硝酸(NO2)可以使用常規(guī)光度方法來(lái)檢測(cè)。在存在硝酸還原酶的情況下，格里斯反應(yīng)分析酶學(xué)地轉(zhuǎn)化硝酸鹽為亞硝酸鹽。使用比色法檢測(cè)作為有色偶氮染料產(chǎn)物的亞硝酸鹽，其在約540nm的范圍內(nèi)吸收可見(jiàn)光。系統(tǒng)中存在的氧化氮的水平通過(guò)以下方法測(cè)定:轉(zhuǎn)化所有的硝酸鹽為亞硝酸鹽、測(cè)定未知樣品中亞硝酸鹽的總濃度、然后比較產(chǎn)生的亞硝酸鹽濃度與使用轉(zhuǎn)變成亞硝酸鹽的已知數(shù)量的硝酸鹽產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用如上所述的定量性硫酸乙酰肝素、TGF-@ UTIMP.N0和/或b_FGF分析，以及下文的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)、血栓形成抑制的定量體外分析，來(lái)評(píng)估早先描述的優(yōu)選的抑制性表型。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，當(dāng)一種或多種這些可選擇的體外分析證實(shí)可植入材料展現(xiàn)優(yōu)選的抑制性表型時(shí)，可植入材料準(zhǔn)備好用于植入。為了評(píng)估體外的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，測(cè)定與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的抑制作用的大小。豬或人類(lèi)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞稀疏地播種到24孔組織培養(yǎng)平板中的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(SmGM-2，Lonza)中。容許細(xì)胞附著24小時(shí)。然后使用含有0.2%FBS的平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SmBM)替換培養(yǎng)基48-72小時(shí)來(lái)延滯細(xì)胞生長(zhǎng)。從后匯合內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物制備條件培養(yǎng)基，用2X SMC生長(zhǎng)培養(yǎng)基1:1稀釋?zhuān)⑻砑拥脚囵B(yǎng)物中。平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的陽(yáng)性對(duì)照被包括在每個(gè)分析中。在三到四天之后，每個(gè)樣品中的細(xì)胞數(shù)量在添加染料之后利用庫(kù)爾特粒度儀或利用比色分析來(lái)計(jì)數(shù)。通過(guò)比較即將添加條件培養(yǎng)基之前每反應(yīng)孔的平滑肌細(xì)胞數(shù)目和暴露于條件培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基(有和沒(méi)有添加生長(zhǎng)因子的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基)之后三到四天的數(shù)目，測(cè)定條件培養(yǎng)基對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響。將與條件培養(yǎng)基樣品相關(guān)的抑制作用的大小同與陽(yáng)性對(duì)照相關(guān)的抑制作用的大小相比較。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，如果條件培養(yǎng)基抑制了肝素對(duì)照物所能抑制的大小的約20%，所述可植入材料被考慮為抑制性的。為了評(píng)估體外的血栓形成抑制作用，測(cè)定與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的硫酸乙酰肝素水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓性質(zhì)。使用上文詳述的常規(guī)的二甲基亞甲藍(lán)-軟骨素酶ABC消化分光光度法分析或ELISA分析，計(jì)算出硫酸乙酰肝素的濃度。當(dāng)條件培養(yǎng)基中的硫酸乙酰肝素是至少約0.23-1.0、優(yōu)選至少約0.5微克/mL/天時(shí)，所述可植入材料可以用于在此描述的目的。評(píng)估血栓形成的抑制作用的另一種方法涉及體外測(cè)定與富含血小板的血漿或血小板濃縮物相關(guān)的血小板聚集的抑制作用的大小(Research Blood Components,Brighton, MA)。從后匯合內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物制備條件培養(yǎng)基，并添加到血小板濃縮物的等分量中。將血小板聚集劑(激動(dòng)劑)添加到播種在96孔平板中的血小板作為對(duì)照。血小板激動(dòng)劑通常包括花生四烯酸、ADP> I型膠原蛋白、腎上腺素、凝血酶(Sigma-Aldrich C0.,St.Louis, MO)或瑞期托菌素(可從 Sigma-Aldrich C0.，St.Louis, MO 獲得)。其他的血小板的孔不添加血小板激動(dòng)劑或·條件培養(yǎng)基，來(lái)評(píng)定基線的自發(fā)血小板凝聚。用于血小板凝聚抑制作用的陽(yáng)性對(duì)照還被包括在每個(gè)分析中。示范性的陽(yáng)性對(duì)照包括阿斯匹林、肝素、卩引哚氯甲酰(Sigma-Aldrich C0., St.Louis, MO)、阿昔單抗(ReoPro ⑩，Eli Lilly,Indianapolis, IN)、替羅非班(Aggrastat κ Merck & C0.,Inc.,Whitehouse Station,NJ)5 eptifibatide (Integrilin κ Millennium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MAX然后利用平板讀取器和405nm處的吸光度讀取來(lái)測(cè)量所有測(cè)試條件的產(chǎn)生的血小板聚集。血小板讀取器通過(guò)監(jiān)視光密度來(lái)測(cè)量血小板聚集。血小板聚集時(shí)，更多的光線可以通過(guò)樣本。血小板讀取器以“吸光度”報(bào)告結(jié)果，這是血小板聚集速度的函數(shù)。作為在添加激動(dòng)劑之后6-12分鐘間的最大聚集來(lái)評(píng)定聚集。通過(guò)比較添加條件培養(yǎng)基之前的最大激動(dòng)劑聚集與血小板濃縮物對(duì)條件培養(yǎng)基和陽(yáng)性對(duì)照的暴露之后的最大激動(dòng)劑聚集，來(lái)測(cè)定條件培養(yǎng)基對(duì)血小板聚集的影響。結(jié)果表示為基線的百分比。將與條件培養(yǎng)基樣品相關(guān)的抑制作用的大小同與陽(yáng)性對(duì)照相關(guān)的抑制作用的大小相比較。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，如果條件培養(yǎng)基對(duì)血栓形成的抑制達(dá)到對(duì)照的至少約20%，更優(yōu)選達(dá)到對(duì)照的至少約40%、以及最優(yōu)選達(dá)到對(duì)照的至少約60%，則所述可植入材料被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性的。為了體外評(píng)估對(duì)血管生成的調(diào)節(jié)，Javaherian等人的血管形成Matrigel栓塞分析被用于評(píng)估Matrigel剖面的血管形成密度。Javaherian et al.J.Bi0.Chem.277:45211-45218 (2002).在 4 °C 多孔平皿(24 孔)用 250 μ I Matrigel 包被，Matrigel 是一種來(lái)自 Engelbreth-Holm-Swarm 腫瘤的 ECM 制品(BD PharMingen),在 37°C溫育30-60分鐘以形成栓塞。將人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC, Lonza BioSciences, Basel,Switzerland)以 50，000-100，000 個(gè)細(xì)胞 /mL 播種到 0.5mL EGM-2-MV 培養(yǎng)基(LonzaBioSciences)中。從可植入材料的樣品或共培養(yǎng)系統(tǒng)中的可植入材料收集的條件培養(yǎng)基作為可植入材料摻入物(insert)，在標(biāo)繪的時(shí)點(diǎn)(t=0)或在37°C下在各個(gè)HUVEC溫育時(shí)間之后(t=2、4、8、12 或 16 小時(shí))施加于 Matrigel0在Matrigel內(nèi)形成的內(nèi)皮細(xì)胞管的密度通過(guò)在低倍視野(40X )下的三次人工計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定。沒(méi)有細(xì)胞的生物相容性基質(zhì)的樣品(或不向Matrigel施加任何物質(zhì))被用作陰性對(duì)照。任何已知的抗血管生成藥物可以用作陽(yáng)性對(duì)照(例如，凝血栓蛋白-1、內(nèi)皮抑制素或阿伐他汀)。附圖2A描繪了在有和沒(méi)有用本發(fā)明的可植入材料處理的Matrigel中HUVEC管形成的照片。附圖2B是在施用條件培養(yǎng)基或可植入材料之后的管形成密度的圖形表示。參考附圖2A和2B，根據(jù)這種方法，與對(duì)照相比，所述可植入材料引起了 Matrigel中管形成密度的降低。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，容許Matrigel-HUVEC用來(lái)自可植入材料的條件培養(yǎng)基溫育72小時(shí)。在施用條件培養(yǎng)基后16和72小時(shí)，顯著的管形成保留在未處理的Matrigel樣品中。另一方面，在可植入材料樣品中，管形成的密度被顯著降低。因此，相對(duì)于對(duì)照，可植入材料能夠抑制Matrigel中的血管生成。

當(dāng)準(zhǔn)備植入時(shí)，在最終產(chǎn)物容器中提供平面形式的可植入材料，所述容器各自優(yōu)選含有1X4X0.3cm (1.2cm3)的無(wú)菌可植入材料，具有優(yōu)選大約5_8X 105、優(yōu)選至少約4X IO5個(gè)細(xì)胞/cm3，和至少約90%的活細(xì)胞(例如，來(lái)自單一尸體供體的人類(lèi)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)每立方厘米的在大約45-60ml、優(yōu)選的約50ml內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，不包含酚紅和抗生素的內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EGM-2))中的可植入材料。當(dāng)使用豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基也是不包含酚紅的EBM-2，但補(bǔ)充有5%FBS和50 u g/ml慶大霉素。在其他優(yōu)選的實(shí)施方式，在最終產(chǎn)物容器中提供可流動(dòng)組合物(例如，顆粒形狀的生物相容性基質(zhì))，所述容器包括例如，用過(guò)濾器蓋子修飾的密封的組織培養(yǎng)容器或預(yù)先加載的注射器，優(yōu)選各含有約50-60mg的可流動(dòng)組合物，所述可流動(dòng)組合物在約45-60mL、優(yōu)選約50mL的每等分量生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包含約7X IO5到約IX IO6個(gè)總內(nèi)皮細(xì)胞?？芍踩氩牧系馁A藏期限:包含匯合、近匯合或后匯合細(xì)胞群體的本發(fā)明的可植入材料可以在室溫下以穩(wěn)定和存活狀況維持至少兩周。優(yōu)選的，這種可植入材料以約45-60ml、更優(yōu)選約50ml每份可植入材料的量，維持在有或沒(méi)有額外的FBS或VEGF的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含沒(méi)有酚紅的EGM-2培養(yǎng)基。FBS可以添加到轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中，直至約10%FBS，或約12%FBS的總濃度。然而，由于FBS必需在植入之前從可植入材料中除去，優(yōu)選的是限制轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中使用的FBS的數(shù)量來(lái)降低植入前所需的清洗時(shí)長(zhǎng)。VEGF可以添加到轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中直到約3-4ng/ml的濃度。可植入材料的低溫保存:本發(fā)明的可植入材料可以被低溫保存，用于貯存和/或轉(zhuǎn)運(yùn)到臨床位置，而在最后解凍時(shí)不降低它的臨床效力或完整性。優(yōu)選的，可植入材料低溫保存在 15ml 冷凍瓶(Nalgene , Nalge Nunc Int' I, Rochester, NY)中含有約 10%DMS0、約2-8%葡聚糖和約20-75%FBS或人類(lèi)血清的約5ml CiyoStor CS-1O溶液(BioLifeSolutions,Oswego,NY)中。冷凍瓶置于冷的異丙醇水浴中，轉(zhuǎn)移到_80°C冷凍器中4小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移到液氮中(_150°C到-165°C)?？芍踩氩牧系牡蜏乇?存的等分量然后在室溫下慢慢解凍約15分鐘，隨后在室溫水浴中額外解凍大約15分鐘。然后所述材料在約200-250mL鹽水、乳酸化的ringers或EBM中洗滌約3次。三次清洗操作在室溫下進(jìn)行約5分鐘。然后植入所述材料。
為了測(cè)定解凍的材料的生物活性，在解凍和清洗操作之后，容許低溫保存的材料在約IOml的恢復(fù)溶液中靜息約48小時(shí)。對(duì)于豬的內(nèi)皮細(xì)胞，恢復(fù)溶液是補(bǔ)充有5%FBS和50 μ g/ml慶大霉素的EBM-2，在37°C下且在5%C02中；對(duì)于人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞，恢復(fù)溶液是有或者沒(méi)有抗生素的EGM-2。進(jìn)一步的解凍后調(diào)節(jié)可以在使用和/或包裝用于貯存或轉(zhuǎn)運(yùn)之前進(jìn)行另外的至少24小時(shí)。在即將植入之前，倒出轉(zhuǎn)運(yùn)或低溫保存的培養(yǎng)基，在約250_500ml無(wú)菌鹽水(USP)中清洗可植入材料。如有必要，最終產(chǎn)品中的培養(yǎng)基含有少量的FBS來(lái)在轉(zhuǎn)運(yùn)到臨床位置期間維持細(xì)胞生存力。FBS已經(jīng)根據(jù)Title 9 CFR:Animal and Animal Products廣泛地測(cè)試了細(xì)菌、真菌和其他病毒劑的存在。僅在植入之前采取清洗操作，其減少轉(zhuǎn)運(yùn)的FBS的數(shù)量，優(yōu)選減少至每個(gè)植入物0_60ng之間,但優(yōu)選的不超過(guò)每個(gè)植入物1-2 μ g。每個(gè)人類(lèi)患者的總細(xì)胞載荷優(yōu)選的是大約1.6-2.6X IO4個(gè)細(xì)胞每kg體重,但是不低于約2 X IO3以及不超過(guò)約2 X IO6個(gè)細(xì)胞每kg體重?？芍踩氩牧系氖┯?本發(fā)明的可植入材料當(dāng)處于可流動(dòng)組合物中時(shí)包含顆粒狀生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞，所述細(xì)胞是約90%存活的，優(yōu)選的密度為約0.8 X IO4個(gè)細(xì)胞/mg，更優(yōu)選約1.5 X IO4個(gè)細(xì)胞/mg，最優(yōu)選約2 X IO4個(gè)細(xì)胞/mg，所述細(xì)胞可以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有硫酸乙酰肝素至少0.23-1.0、優(yōu)選至少約0.5微克/mL/天 ，含有TGF- β I至少約200-300皮克/mL/天、優(yōu)選至少約300皮克/mL/天，以及含有b-FGF低于約200皮克/ml和優(yōu)選不超過(guò)約400皮克/ml ;條件培養(yǎng)基中的TIMP-2是至少約5.0-10.0ng/mL/天,優(yōu)選至少約8.0ng/ml/天；條件培養(yǎng)基中的NO是至少約0.5-3.0 μ mol/L/天,優(yōu)選至少約2.0 μ mol/L/天，以及,所述細(xì)胞顯示早前描述的抑制性表型。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，一般地，可植入顆粒材料的施用被定位到受影響位點(diǎn)之處、鄰近或附近的位置。可植入材料的沉積的位點(diǎn)是受影響結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面或外表面，或在鄰近或周?chē)慕M織處。如在此預(yù)期的，局部的沉積可以如下實(shí)現(xiàn)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，可流動(dòng)組合物首先利用適合的針、導(dǎo)管或其他適合的透皮膚遞送裝置透皮地施用，進(jìn)入患者的身體靠近受影響結(jié)構(gòu)，然后沉積在受影響關(guān)節(jié)、切除位置或其他空腔的內(nèi)表面、受影響結(jié)構(gòu)的外表面，直接接觸鄰近于或圍繞受影響或受治療位點(diǎn)的基質(zhì)或間隙位置。做為選擇，所述可流動(dòng)組合物使用針、導(dǎo)管或其他適合的遞送裝置透皮地遞送，結(jié)合識(shí)別步驟來(lái)促進(jìn)對(duì)期望位點(diǎn)的遞送。識(shí)別步驟可以在透皮膚遞送之前或同時(shí)發(fā)生。識(shí)別步驟可以利用身體檢查、超聲和/或CT掃描來(lái)實(shí)現(xiàn)，略舉數(shù)例。任選地進(jìn)行所述識(shí)別步驟，而不是實(shí)踐本發(fā)明的方法必需的?？闪鲃?dòng)組合物也可以通過(guò)鄰近于或連接到受影響結(jié)構(gòu)的管狀結(jié)構(gòu)腔內(nèi)地施用。例如，所述組合物可以通過(guò)能插入到管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的任何設(shè)備來(lái)遞送。在這種情況下，這種管腔內(nèi)的遞送裝置裝配有導(dǎo)向或穿透設(shè)備，其導(dǎo)向或穿透管狀結(jié)構(gòu)的腔壁來(lái)到達(dá)受影響結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面或外表面。可流動(dòng)組合物然后沉積在受影響結(jié)構(gòu)或鄰近或周?chē)M織的表面。在此預(yù)期的導(dǎo)向或穿透設(shè)備可以利用，例如，單個(gè)遞送點(diǎn)或以期望的幾何構(gòu)型布置的多個(gè)遞送點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)可流動(dòng)組合物向受影響結(jié)構(gòu)的表面的遞送，而不破壞所述位點(diǎn)?？梢圆贾枚鄠€(gè)遞送點(diǎn)，例如，單環(huán)形、同心圓形、或平面陣列排列，略舉數(shù)例。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述穿透設(shè)備在治療位點(diǎn)的近端或遠(yuǎn)端經(jīng)由結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面插入。在某些臨床受試者中，在治療位點(diǎn)之處或附近插入穿透設(shè)備會(huì)破壞或引起受影響結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步損傷。因而，在這些受試者中，應(yīng)當(dāng)小心地在離受影響結(jié)構(gòu)一定距離的位置插入所述穿透設(shè)備，優(yōu)選的是由臨床醫(yī)師取決于手頭的特定環(huán)境所確定的距離。優(yōu)選的，在待治療位點(diǎn)之處或所述位點(diǎn)的鄰近或附近，可流動(dòng)組合物沉積在受影響結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面或外表面。所述組合物可以沉積在相對(duì)于受影響位點(diǎn)的多種位置，例如，在所述位點(diǎn)處、接觸間質(zhì)、環(huán)繞所述位點(diǎn)或鄰近于所述位點(diǎn)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，鄰近的位點(diǎn)處在受影響位點(diǎn)的約Ocm到2cm內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,位點(diǎn)在約2cm到4cm之內(nèi)；在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，位點(diǎn)在約4cm到6cm之內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，位點(diǎn)處在約6cm到IOcm之內(nèi)。做為選擇,鄰近的位點(diǎn)是任何其他的、臨床醫(yī)師確定的鄰近位點(diǎn)，在此沉積的組合物能夠展現(xiàn)對(duì)于要治療的位點(diǎn)附近的受影響位點(diǎn)的期望效果。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述可流動(dòng)組合物直接遞送到受影響結(jié)構(gòu)之處、鄰近或附近的手術(shù)暴露的內(nèi)表面或外表面。在這種情況下，通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的直接觀察來(lái)引導(dǎo)和指導(dǎo)遞送。還是在這種情況下，通過(guò)同時(shí)使用如上所述的識(shí)別步驟，可以幫助遞送。同樣，識(shí)別步驟是任選的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，柔性的平面形式的可植入材料被局部地遞送到受影響位點(diǎn)之處、鄰近或附近的手術(shù)暴露的外表面或內(nèi)表面或腔。在一個(gè)實(shí)例中，至少一片可植入材料被應(yīng)用于腔的內(nèi)部；它僅需要貼合并接觸位點(diǎn)的表面，并以治療所述位點(diǎn)的有效量植入。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，單獨(dú)地或任選的在外科的腫瘤切除術(shù)之后，切除位點(diǎn)被施用放射治療來(lái)照射所述切除位點(diǎn)之處或附近的腫瘤和/或剩余癌細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，單獨(dú)地或任選的在外科的腫瘤切除術(shù)之后，患者被施用化學(xué)治療來(lái)殺死所述切除位點(diǎn)之處或附近的腫瘤和/或剩余癌細(xì)胞。根據(jù)這些實(shí)施方式的任一個(gè)，在放射治療和/或化學(xué)治療完成之后，可植入材料被遞送到切除術(shù)的空腔中。根據(jù)這種方法，可植入材料被用于治療、改善、控制和/或降低腫瘤切除術(shù)、放射治療和/或化學(xué)治療對(duì)切除術(shù)空腔和/或周?chē)M織的影響。
實(shí)施例1.豬中的血管損傷這項(xiàng)研究例示了本發(fā)明的材料和方法來(lái)調(diào)節(jié)病理性血管生成和異常新血管形成的用途。選擇用于這種范例的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪峭饪剖中g(shù)誘導(dǎo)的血管損傷和外傷之后的新血管形成。此外，這個(gè)實(shí)施例提供了實(shí)驗(yàn)性方案，用于在動(dòng)物測(cè)試受試者中對(duì)血管結(jié)構(gòu)的介入，例如，AV移植物的引入之后測(cè)試和利用本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式來(lái)降低或調(diào)節(jié)異常新血管形成的征候，包括新血管形成、血管密度和MMP的表達(dá)水平。使用標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)操作，在頸動(dòng)脈和頸靜脈之間創(chuàng)建AV移植物。然后將可植入材料放置在每個(gè)手術(shù)創(chuàng)建的AV移植物接合點(diǎn)鄰近的血管周?chē)g隙中；以下列出了一個(gè)示范性操作的細(xì)節(jié)。如較早描述的，可植入材料的放置和結(jié)構(gòu)可以改變。在這項(xiàng)研究中，所述可植入材料處于柔性平面形式。特別地，該研究包括經(jīng)歷了 AV移植物手術(shù)的20個(gè)豬測(cè)試受試者。常規(guī)的AV移植物手術(shù)操作將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作技術(shù)進(jìn)行。在移植手術(shù)完成以及通過(guò)移植物的流通被建立之后，可植入材料被應(yīng)用到AV移植物接合點(diǎn)并如以下描述的環(huán)繞。
對(duì)于經(jīng)歷了 AV移植手術(shù)的每個(gè)測(cè)試受試者，將一個(gè)六毫米內(nèi)徑的PTFE移植物置于測(cè)試受試者的左側(cè)頸總動(dòng)脈和右側(cè)外頸靜脈之間。使用連續(xù)6-0普羅綸(prolene)縫合線，在移植物的每個(gè)末端創(chuàng)建傾斜的端對(duì)面接合點(diǎn)。在手術(shù)之后，所有測(cè)試受試者接受內(nèi)部起作用的肝素和每天施用的阿斯匹林。十位測(cè)試受試者在手術(shù)當(dāng)天接受包含主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的可植入材料。五個(gè)這樣的植入物被應(yīng)用給每個(gè)測(cè)試受試者。兩個(gè)植入物卷繞到兩個(gè)接合位點(diǎn)的每一個(gè)上。在這種環(huán)境下，將可植入材料的第一片的一端穿過(guò)接合段下方，直到植入物的中部處在血管和移植物會(huì)合的點(diǎn)上。第二片可植入材料然后以與第一片相反的方向卷繞，置于接合段的上部，末端塞入接合點(diǎn)下方。然后將兩端卷繞縫合線，保持植入物中心在縫合線上。末端最低限度地疊蓋來(lái)固定材料就位。對(duì)于每個(gè)測(cè)試受試者，另外一個(gè)植入物沿著近端靜脈段的長(zhǎng)度縱向地放置，在接合點(diǎn)處開(kāi)始。植入物不完全地卷繞靜脈的圓周。十名測(cè)試受試者接受沒(méi)有細(xì)胞的對(duì)照植入物，在手術(shù)當(dāng)天卷繞接合點(diǎn)位置并置于移植物的近端靜脈段上。根據(jù)體重的總細(xì)胞載荷是大約2.5X IO5個(gè)細(xì)胞每kg。手術(shù)操作。在頸部的每一側(cè)在胸鎖乳突肌肉上創(chuàng)津雙側(cè)的8-cm頸部切口。利用這些切口，在分離左側(cè)頸總動(dòng)脈之后，分離右側(cè)外頸靜脈。從周?chē)M織剝離大約4-8cm靜脈和動(dòng)脈段，靜脈外的所有分支用3-0絲縫線連接。6-mm內(nèi)徑PTFE移植物(Atrium MedicalCorp., Hudson, NH)在兩個(gè)切口之間的皮下管道中穿過(guò)。鉗住分離的頸靜脈,產(chǎn)生IOmm靜脈切開(kāi)口。用肝素化的鹽水溶液沖洗靜脈，利用連續(xù)6-0普羅綸縫合線在靜脈移植物之間創(chuàng)建傾斜的端對(duì)面接合點(diǎn)。平均移植物長(zhǎng)度是18.6±0.9cm。一旦形成，除去靜脈的夾具，用肝素-鹽水溶液沖洗移植物并重新鉗住。然后夾住左側(cè)頸動(dòng)脈，進(jìn)行8mm的動(dòng)脈切開(kāi)術(shù)。用肝素化的鹽水溶液沖洗動(dòng)脈，利用連續(xù)6-0普羅綸縫合線在動(dòng)脈和移植物之間創(chuàng)建傾斜的端對(duì)面接合點(diǎn)。除去血管夾,通過(guò)移植物中震顫的物理觸診確認(rèn)移植物的流通。確認(rèn)每個(gè)血管接合點(diǎn)的血液靜態(tài)，在個(gè)別情況下額外的6-0普羅綸縫合線以阻斷方式置于接合的出血點(diǎn)處。在完成接合之后，放置PTFE動(dòng)靜脈移植物以防止扭結(jié)。PTFE動(dòng)靜脈移植物使用23-規(guī)格蝴蝶針就在頸動(dòng)脈移植物接合點(diǎn)遠(yuǎn)端透皮地插管。為了確認(rèn)位置，將血液吸出到帶有IOcc注射器的系統(tǒng)中。然后用IOcc鹽水沖洗該系統(tǒng)。然后在研究的動(dòng)物的頸部上放置C-臂熒光鏡，從而可以顯現(xiàn)靜脈移植物接合點(diǎn)和靜脈流出道。在連續(xù)的熒光檢查之下，注射10-15cc的碘化了的對(duì)比物(Renograffin,全強(qiáng)度)。在血管造影完成之后，將接合位點(diǎn)包在濕潤(rùn)的4" X4"紗布海綿中。維持接合位點(diǎn)的壓力持續(xù)大約5分鐘的時(shí)間，之后除去紗布海綿，檢查接合位點(diǎn)。如滲血所證明的，如果還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)止血，再次纏 繞該位點(diǎn)另外5分鐘。如果從該位點(diǎn)的出血是嚴(yán)重的，在外科醫(yī)生的判斷下放置其他縫合線。一旦實(shí)現(xiàn)止血，用無(wú)菌鹽水填充頸部傷口，使用6mm跨音速流動(dòng)探針在遠(yuǎn)端靜脈流出道處進(jìn)行流動(dòng)探針?lè)治?。如有必要，除去鹽水，使接合點(diǎn)盡可能干燥，用包含主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的可植入材料或?qū)φ罩踩胛飦?lái)處理。一些位點(diǎn)不用任一種植入物處理，直到已經(jīng)控制了所有的出血，確認(rèn)了移植物的流通且使該區(qū)域盡可能干燥。完成時(shí)，按層閉合傷口，容許動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)。在手術(shù)前作為100U/kg的彈丸注射加上35U/kg/hr的連續(xù)輸注來(lái)施用肝素，維持直到手術(shù)結(jié)束。根據(jù)需要施用另外的彈丸劑量(100U/kg)，以維持ACT ^ 200秒。
移棺物開(kāi)放。在手術(shù)之后立即地、手術(shù)后3-7天以及此后每周一次地，使用彩色流動(dòng)多普勒超聲和跨音速流動(dòng)探針(Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY)通過(guò)通路流量測(cè)定來(lái)確認(rèn)AV移植物開(kāi)放。嚴(yán)密監(jiān)視移植物的血流。病變過(guò)稈。動(dòng)物試驗(yàn)受試者使用戊巴比妥鈉麻痹(65mg/kg, IV)。在通過(guò)如上所述的全息血管造影的尸檢之前確定移植物開(kāi)放。在完成血管造影之后，移植物/接合點(diǎn)用PBS、隨后是福爾馬林來(lái)灌注。組織學(xué)。一半的動(dòng)物測(cè)試受試者(5例細(xì)胞移植的植入物受試者；5例對(duì)照植入物受試者)在手術(shù)后3天安樂(lè)死。其余的動(dòng)物測(cè)試受試者(5例細(xì)胞移植的植入物受試者；5例對(duì)照植入物受試者)在手術(shù)后一月安樂(lè)死。在所有測(cè)試受試者上進(jìn)行有限的尸檢，其被定義為施用位點(diǎn)的宏觀檢查，包括所有接合點(diǎn)和近端靜脈位點(diǎn)和周?chē)M織，包括導(dǎo)液淋巴結(jié)。對(duì)于在手術(shù)后一個(gè)月安樂(lè)死的所有測(cè)試受試者，收集并保存來(lái)自主要器官，包括腦、肺、腎臟、肝臟、心臟和脾臟的組織。僅當(dāng)從身體外表面的宏觀檢查、或從施用位點(diǎn)和周?chē)M織的顯微鏡檢查產(chǎn)生異常發(fā)現(xiàn)時(shí)，器官才被分析。沒(méi)有出現(xiàn)異常的發(fā)現(xiàn)，這保證了對(duì)被編入這項(xiàng)研究中的任何動(dòng)物中主要器官進(jìn)行進(jìn)一步檢查。所有的AV移植物接合位點(diǎn)和周?chē)M織，包括每個(gè)接合的靜脈和動(dòng)脈的5cm段，被修整、固定在10%福爾馬林(或等效物)中，并包埋在乙二醇甲基丙烯酸酯(或等效物)中。使用C-形不銹鋼刀(或等效物)切下的大約3 u M厚的切片，從至少三個(gè)區(qū)域制備切片:靜脈移植物接合點(diǎn)、移植物-動(dòng)脈接合點(diǎn)和靜脈流出道。橫斷通過(guò)靜脈移植物接合點(diǎn)地制備三個(gè)切片。在靜脈流出道上制備五個(gè)切片(因而覆蓋1.5cm的流出靜脈)。以Imm的間隔在移植物-動(dòng)脈接合點(diǎn)制備三個(gè)切片。這些切片放置在明膠包被的(或等效物)玻璃載片上，用蘇木素和曙紅或Verhoeff ’ s彈性蛋白染料來(lái)染色。評(píng)估每個(gè)切片的新血管形成的存在和/或程度。為每個(gè)變量按0到4的標(biāo)度分配分值(0=沒(méi)有顯著的變化；1=最小的；2=輕微的；3=中度的；4=嚴(yán)重的)。新血管形成發(fā)現(xiàn)的代表性的分級(jí)指標(biāo)在以下的表I中示出。
表I
權(quán)利要求
1.一種組合物在制備適合于對(duì)病理性血管生成的位點(diǎn)進(jìn)行治療或控制的藥物中的應(yīng)用，所述組合物包含生物相容性基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞，其中所述組合物的量是治療或控制所述病理性血管生成的位點(diǎn)的有效量，并且其中所述生物相容性基質(zhì)是柔性平面材料或可流動(dòng)組合物。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述可流動(dòng)組合物進(jìn)一步包含附著肽，并且所述細(xì)胞移接在所述附著肽上。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述組合物調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)處的細(xì)胞外基質(zhì)降解。
4.權(quán)利要求1的應(yīng)用,其中所述組合物調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)處的MMP的表達(dá)。
5.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述組合物調(diào)節(jié)所述病理性血管生成的位點(diǎn)處的炎癥征候。
6.權(quán)利要求 1的應(yīng)用，其中所述病理性血管生成的位點(diǎn)是腫瘤切除或放射治療的位點(diǎn)。
全文摘要
在此公開(kāi)的是適合于治療病理性血管生成和異常新血管形成的位點(diǎn)的材料和方法。病理性血管生成或異常新血管形成的位點(diǎn)可以通過(guò)用可植入材料接觸病理性血管生成或異常新血管形成的區(qū)域之處或鄰近或附近的表面來(lái)治療?？芍踩氩牧习锵嗳菪曰|(zhì)和細(xì)胞，并且其用量是治療所述受影響位點(diǎn)的有效量。所述組合物可以是柔性平面材料或可流動(dòng)組合物。本發(fā)明能夠治療的疾病包括，例如，黃斑變性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、全身性炎癥性疾病，以及通過(guò)外科切除術(shù)、放射治療或化學(xué)治療的腫瘤治療。
文檔編號(hào)A61K35/44GK103230414SQ201310109409
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2007年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月7日
發(fā)明者海倫·瑪麗·紐金特, 埃拉扎爾·R·埃德?tīng)柭? 羅伯特·M·特金·薩姆·斯金, 伍燕山 申請(qǐng)人:夏爾再生醫(yī)學(xué)公司