用于治療過敏反應的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物組合物，其由一種或多種制備物組成并包含生理學有效劑量的至少一種IL-4和/或IL-13抑制劑和至少一種過敏原，以及基質(zhì)，其中至少所述抑制劑是溶解或包埋于所述基質(zhì)上，或者至少所述抑制劑是包被的或吸附于所述基質(zhì)上，其中選擇所述基質(zhì)以使得所述抑制劑能夠延長性釋放。
【專利說明】用于治療過敏反應的藥物組合物
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及在體內(nèi)阻斷IL-4-和IL-13-介導途徑，和同時對T細胞進行過敏原刺激以增加對過敏原臨床耐受的誘導的方法。
[0002]發(fā)明背景和現(xiàn)有技術
包括速發(fā)型(I型)超敏反應在內(nèi)的過敏性疾病是由特定免疫系統(tǒng)的不平衡應答導致的。在I型超敏反應中，Th2細胞與過敏原呈遞細胞接觸后上調(diào)其表面上的⑶40配體。⑶40配體與B細胞上的⑶40的相互作用伴隨著Th2相關細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生，而且隨后免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換導致介導多種臨床癥狀的IgE抗體的產(chǎn)生。
[0003]但是，過敏原特異的Th2細胞的存在不足以使過敏反應發(fā)生，因為這些細胞在健康個體中也存在。對于過敏反應的發(fā)病機理來說，重要的是能夠抑制Thl和Th2細胞的增殖和細胞因子表達，并能夠作用于抗原呈遞細胞(APC)的過敏原特異的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的數(shù)量。
[0004]調(diào)節(jié)性T細胞被寬泛地分類為自然T調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)和誘導的或適應性調(diào)節(jié)性T細胞(iTreg)。自然調(diào)節(jié)性T細胞是自體抗原特異性的CD4+T細胞，其表達F0XP3轉(zhuǎn)錄因子和大量的CD24。它們在胸腺中被選擇并在外周成為調(diào)節(jié)性T細胞。外周中的幼稚⑶4+Th細胞能夠發(fā)育成調(diào)節(jié)性T細胞并因此而被稱為誘導的或適應性調(diào)節(jié)T細胞。F0XP3轉(zhuǎn)錄因子的表達被認為是調(diào)節(jié)性T細胞誘導的關鍵因素。包括I型調(diào)節(jié)性T細胞(Trl)和Th3細胞的這些細胞能夠產(chǎn) 生IL-10或TGF-β或這二者，這些細胞通過它們行使其大部分抑制作用(其綜述參見 Schmidt-Weber, 2005; Nandakumar 等，2009)。
[0005]調(diào)節(jié)性T細胞對免疫應答的抑制通過多種途徑發(fā)生(其綜述參見Schmidt-Weber,2005; Rouse, 2007; Nandakumar等，2009)。IL-10直接和間接地抑制肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的活性。它還使IgG4升高。TGF-β是B細胞向IgA同種型的轉(zhuǎn)換和促進因子，并因此控制外周耐受。最重要的是，TGF-β已被證明促進F0XP3表達，并抑制Thl-驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄因子T-BET和Th2-驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3。IL-10也被證明在體外促進F0XP3表達，但是只有IL-4和IL-12被中和。這兩個細胞因子代表了 T-細胞分化的決定信號，且分別誘導轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-BET。
[0006]通常，Treg-介導的抑制似乎是抗原特異性的，雖然負責的細胞因子被分泌并因此可能對于多種T細胞都是可用的。但是，最近的研究表明細胞因子和細胞因子受體可能成為APCs和T細胞之間形成的免疫突觸的一部分(其綜述參見Schmidt-Weber，2005)。因此，可溶性細胞因子可以以抗原特異性的方式穿梭到鄰近的細胞中，并且Tregs可以將特定的靶細胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o應答、無凋亡的狀態(tài)(無細胞免疫應答)。
[0007]在促成過敏性炎癥發(fā)生的細胞因子中，IL-4和IL-13在哮喘和其它過敏性疾病的發(fā)病機理中起著關鍵作用。這兩個細胞因子代表著多效性細胞因子，并與IgE同種型轉(zhuǎn)換的誘導、通過B淋巴細胞的IgE的分泌，和通過上調(diào)B淋巴細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE受體的IgE-介導應答的增加相關。但是IL-4和IL-13還具有一些不同的不重疊的功能。例如，IL-4能夠驅(qū)動幼稚Th細胞向Th2淋巴細胞分化，導致產(chǎn)生效應物細胞因子例如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。IL-13對于上皮細胞的成熟、粘液的產(chǎn)生、細胞外基質(zhì)蛋白的生成、呼吸道平滑肌細胞收縮性的增加和嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和T細胞的募集具有重要的作用。
[0008]IL-4通過與細胞表面特定的I型和II型受體相互作用行使其活性(其綜述參見Gessner 等，2000)。I 型受體包含 140 kDa 的結合鏈(Swiss Prot 登錄號 P24394)、IL-4R α(也被稱為⑶124)和由多個細胞因子受體共享的IL-2R的共用Y-鏈(Y。)。在沒有共用Y-鏈的情況下，IL-4可以使用II型IL-4受體，所述受體包含IL-4Rci和IL-13結合鏈，IL-13RQ I。這種受體復合物也是IL-13的功能性受體，并且這解釋了 IL-4和IL-13的大部分生物學效果的重疊，雖然這兩個細胞因子僅顯示出25%的同源性。I型受體復合物可以僅由IL-4形成，并似乎負責介導不表達IL-13Ra I的T細胞中的IL-4應答。II型受體復合物可以由IL-4或IL-13形成并激活。I型受體復合物在造血細胞中占主導地位，而II型受體復合物在造血細胞和非造血細胞二者上表達。IL-4和IL-13與II型受體復合物的結合序列的不同之處在于，IL-4在結合第二亞基之前首先以高親和力與IL_4Ra結合，而IL-13首先以低親和力與IL-13Ra I結合，然后該復合物募集IL-4Ra形成高親和力的結合位點。
[0009]第二 IL-13結合蛋白，IL-13受體a 2 (IL-13Ra 2)，以高親和力結合IL-13，但不結合IL-4。但是，據(jù)信IL-13Ra 2是非信號傳導的，因此充當誘餌受體。已證明用IFN-Y對上皮細胞的處理通過從胞內(nèi)儲存的轉(zhuǎn)移增加IL-13Ra 2的表面表達，表明IL_13Ra 2通過與IL-4Ra / IL-13Ra I復合物競爭IL-13在應答和調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡中起著關鍵作用。
[0010]缺乏跨膜域和胞內(nèi)域的可溶性IL-4受體(sIL-4Ra )存在于生物流體中。然而sIL-4Ra的確切功能還有待闡明，它甚至可通過與細胞表面上的IL-13Ra I形成復合物來增強IL-13應答，由此使IL-13和IL-13Ra I的弱相互作用穩(wěn)定。當在支氣管成纖維細胞中進行試驗時，在對次優(yōu)劑量的IL-13的應答中，sIL-4Ra的存在增加IL-13-刺激的嗜酸性粒細胞趨化因子的產(chǎn)生。此外，sIL_4Ra可以作為載體蛋白，IL-4可以從其上隨時間解離。因此，sIL-4Ra可以為IL-4抵抗蛋白質(zhì)降解提供某種保護。
[0011]特異性免疫治療
特異性過敏原免疫治療(IT)是僅有的廣泛使用的療法，其能夠重建對于過敏原的臨床耐受，并與過敏原特異性Treg細胞的再誘導相關。對在健康個體對過敏原暴露的正常免疫應答中的和在特異性免疫治療中的過敏原的外周耐受主要是足夠的Treg數(shù)量的結果。因此，在特應性患者中，特異性免疫治療的主要原則是增加能夠控制過敏原特異性效應物T細胞的Tregs的數(shù)量。
[0012]成功的IT伴隨著T細胞記憶由促過敏Th2表型向外周的產(chǎn)生IL-10的T細胞表型和除了 IL-10陽性細胞之外也表現(xiàn)出F0XP3表達的局部表型的轉(zhuǎn)變。先前已證明免疫治療可以導致長期受益，并且中斷后疾病緩解持續(xù)3年。然而，考慮到影響特異性免疫治療方法效果的各種因素，臨床結果在很大程度上有所不同并不令人驚訝。當患者是針對季節(jié)性過敏原單獨致敏的，免疫治療有效，但是如果患者是特應性的或者患者對長期過敏原應答，免疫治療則功效較低或無效。
[0013]一個問題似乎是衍生自天然來源的過敏原提取物中的個別過敏原的量，這是因為在一些提取物中，重要的過敏原存在的量不夠。但是，成功的特異性免疫治療要求應用高過敏原劑量以促進已知作為IgE依賴性應答的負反饋調(diào)節(jié)劑的低親和性的Fe ε RII (CD23)的結合。如果以足夠的量存在，則被施用的過敏原不僅被特異性IgE結合，還被其它免疫球蛋白類別結合。在調(diào)節(jié)免疫應答和預防IgE-介導的應答中，IgG與過敏原的復合物是重要的。已知存在三種類型的Fe Y-受體。Fe YRI和Fe Y RIII，主要在髓系的細胞上表達，可以介導促炎性功能例如吞噬作用、抗體依賴性的細胞毒性和炎性介質(zhì)的釋放。Fe Y RII在髓細胞和淋巴細胞上表達，將抑制信號傳遞到細胞內(nèi)?；罨臉渫患毎菑娏Φ腡-細胞刺激物，并表達抑制的和活化的Fe Y Rs 二者。鑒于這些事實，近來的進展或用于特異性免疫治療的重組過敏原似乎是一種有前景的方法，因為它們允許設計包含最適濃度的所有重要過敏原的過敏原組合物。此外，重組過敏原允許對它們的表面結構進行定點修飾以減少B細胞表位的密度。這種過敏原修飾的目的是減少過敏原性，同時保留其免疫原性。對具有大大降低的IgE反應性的修飾的重組過敏原(其顯示線性T細胞表位的全譜，但與相應的天然過敏原相比其表面結構不同)的評價，證明這種分子能夠減少對天然過敏原的特異性的IgE發(fā)展(Niederberger 等，2004; Karamloo 等，2005)。
[0014]然而，盡管近來有所改進，特異性免疫治療的效果還需要進一步優(yōu)化。用于增加能夠控制過敏原特異性效應物T細胞的Tregs的數(shù)量的合適方法還有待確定。因此本領域中需要確定影響Tregs誘導的關鍵因素，并需要設計更有效的過敏原耐受性治療。
[0015]本發(fā)明的技術問題
因此，本發(fā)明的技術問題是要提供用于治療過敏性反應的方法，其中對過敏原的臨床耐受的誘導得到改善，特別是其中IL-3和/或IL-13抑制劑施用的系統(tǒng)性副作用被減少，并且與之結合，用于平衡特異性免疫系統(tǒng)應答的T-細胞刺激被增強。特別是，該技術問題是要提供藥物組合物，及其用途，制造這種組合物的方法以及實現(xiàn)這些目的的治療方法。 [0016]發(fā)明簡述
為了解決這些技術問題，本發(fā)明提供了權利要求中所定義的主題。本發(fā)明在下面進行詳細說明。
[0017]在暴露于過敏原的健康個體的正常免疫應答中以及在特異性免疫治療中，對過敏原的外周耐受主要由足夠的Treg數(shù)量導致。因此，特應性患者中特異性免疫治療的主要原則是增加能夠控制過敏原特異性效應物T細胞的Tregs的數(shù)量。在體外條件下，過敏原和缺乏Thl-或Th2-驅(qū)動因子已被證明對于Tregs的誘導是必需的。由于IL-4和IL-13在過敏性炎癥的發(fā)展中具有重要的作用，本發(fā)明提供了在體內(nèi)同時抑制IL-4-和IL-13-介導效果，同時對T細胞進行過敏原刺激以增加對過敏原的臨床耐受的誘導的方法。
[0018]優(yōu)選的適合于本發(fā)明方法的IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑包括但不限于a)拮抗性IL-4和IL-13衍生物，b)可溶性11-4和IL-13受體構建體，c)對IL-4和IL-13具有特異性能夠阻斷它們的生物學活性的單克隆抗體、其片段或其它蛋白質(zhì)構建體，d)對IL-4和IL-13受體復合物具有特異性，能夠阻斷IL-4和IL-13與它們的受體亞基相互作用的單克隆抗體、其片段或其它蛋白質(zhì)構建體，e)對IL-4和IL-13具有特異性能夠阻斷它們的生物學活性的適配體，和f)對IL-4和IL-13受體復合物具有特異性，能夠阻斷IL-4和IL-13與它們的受體亞基相互作用的適配體。
[0019]在一個實施方案中,本發(fā)明公開了用于在過敏原呈遞部位對IL-4-和IL-13-介導效果進行延長性抑制并對過敏原進行延長性呈遞的方法。為了獲得在過敏原呈遞部位對IL-4-和IL-13-介導效果的有效的和延長的抑制，本發(fā)明公開了用于從位于過敏原呈遞部位的儲存庫持續(xù)釋放這種抑制劑或這種抑制劑的組合的方法。
[0020]在具體實施方案中，本發(fā)明公開了用于延長性遞送T-細胞分化決定信號的抑制劑的基質(zhì)。優(yōu)選的基質(zhì)包括但不限于適合作為大量的這種抑制劑或抑制劑組合的儲存庫的生物可降解聚合物，其允許釋放足夠量的所述抑制劑或抑制劑組合以在延長的一段時間中有效局部抑制IL-4-和IL-13-介導途徑，并且其與用于根據(jù)本發(fā)明方法的耐受性誘導的佐劑和一種或多種過敏原是化學和物理相容的。
[0021]在優(yōu)選的具體實施方案中，生物可降解的可注射原位成型凝膠系統(tǒng)被用于IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的控制釋放。這種原位成型凝膠系統(tǒng)(水凝膠)經(jīng)過溶膠-凝膠-溶膠的轉(zhuǎn)變，其在室溫下是是自由流動的溶膠，并在體溫下是不流動的凝膠。與其它生物可降解聚合物相比，可注射的熱膠凝聚合物具有幾個優(yōu)點，包括易于制備、對生物活性分子例如IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的高封裝效率以及在制備過程中無有害的有機溶劑。
[0022]在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于將IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑的高局部濃度主要限制在過敏原呈遞部位以減少由于該抑制劑與遠離過敏原呈遞部位的靶標相互作用而引起的副作用。在一個具體實施方案中，使用提供相對短的血清半衰期的IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑，該血清半衰期足以使得該抑制劑在從位于過敏原呈遞部位的儲存庫釋放后有局部活性，且允許在從過敏原呈遞部位擴散開和運送走的時候快速地從循環(huán)中被除去。提供這種特性的優(yōu)選的抑制劑包括但不限于a)具有< 15 kDa的分子量的拮抗性IL-4和IL-13衍生物，b)能夠抑制IL-4-和IL-13-介導效果的小抗體片段或其它蛋白質(zhì)構建體，和c)能夠抑制IL-4-和IL-13-介導效果的小分子量適配體。在另一個具體實施方案中，使用的IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑在它們從位于過敏原呈遞部位的儲存庫釋放后易于被內(nèi)源酶滅活，并且其可以根據(jù)本發(fā)明方法的需要被衍生化以調(diào)節(jié)它們對于酶失活的敏感性。提供這種特性的優(yōu)選的抑制劑包括但不限于適配體，其對于受內(nèi)源核酸酶降解的敏感性可以通過對堿基和骨架序列進行化學修飾來調(diào)節(jié)。
[0023]在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了適用于本發(fā)明方法的佐劑。在優(yōu)選的實施方案中，所使用的佐劑為要被施用的過敏原提供了儲存庫效果，且引發(fā)Th2-型免疫應答。雖然主要引發(fā)Th2-型免疫應答的佐劑可能干擾Tregs的誘導，在存在IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的條件下，這種佐劑比那些主要引發(fā)Thl-型免疫應答的佐劑更適合于本發(fā)明的治療目的。優(yōu)選的引發(fā)Th2-型免疫應答的佐劑包括但不限于鋁鹽、Montanide乳劑(基于角鯊烯的油包水乳劑)和聚磷腈。引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應答的佐劑也可用于本發(fā)明的方法，如果這些佐劑為包含一種或多種過敏原、佐劑、IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑和介導這些抑制劑的延長性釋放的基質(zhì)的組合物提供了有利的性質(zhì)的話。引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應答的佐劑包括但不限于基于角鯊烯的水包油乳劑、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和基于菊粉和病毒顆粒的佐劑。
[0024] 在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了可用于本發(fā)明方法的疫苗組合物。在一個具體實施方案中，疫苗組合物包含生物可降解的熱膠凝聚合物溶液，其含有一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑。這種液體制劑在注射后，隨著制劑溫度上升至體溫，會自發(fā)地形成凝膠。因此，注射的凝膠形成不流動的儲存庫，使一種或多種可溶的IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑從其中緩慢且持續(xù)地釋放幾天。組合物中IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的量以這樣的方式平衡，在聚合物復合體(composit)在體溫下膠凝后，所釋放的抑制劑的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。對于膠凝的聚合物復合體部位處的延長性過敏原呈遞來說，一種或多種過敏原或過敏原提取物被吸附到鋁鹽上或被乳化以形成基于角S烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)，并被注射到膠凝的聚合物復合體附近。
[0025]在另一個具體實施方案中，疫苗組合物包含生物可降解的熱膠凝聚合物溶液，該溶液含有一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑和一種或多種過敏原(或過敏原提取物)，該過敏原(或過敏原提取物)被吸附到鋁鹽上、或被乳化以形成基于角鯊烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)或與水溶性的聚磷腈聚合物佐劑預先混合。組合物中的每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射到體內(nèi)后，該生物可降解的熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0026]在又一個特定的技術方案中，疫苗組合物包含生物可降解的熱膠凝聚合物溶液，該溶液含有一種或多種過敏原(或過敏原提取物)、一種或多種可溶性佐劑(例如GM-CSF)和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑。組合物中的每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射到體內(nèi)后，該生物可降解的熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0027]在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于將疫苗組合物摻入到適合于施用的藥物組合物中的方法。 [0028]在再一個實施方案中，本發(fā)明公開了使用本發(fā)明的疫苗組合物誘導過敏原耐受的治療方法。
[0029]本發(fā)明的具體優(yōu)選實施方案隨著下面的更詳細描述和權利要求將會變得顯而易見。
[0030]發(fā)明詳述
基于現(xiàn)有的知識，過敏原耐受由外周誘導的調(diào)節(jié)性T細胞介導，如通過過敏患者外周血中產(chǎn)生過敏原特異性IL-1O的T細胞的不足所證明(其綜述參見Schmidt-Weber等，2005; Schmidt-Weber等，2006)。特應性患者中特異性免疫治療的主要原則是增加能控制過敏原特異性效應物T細胞的Tregs的數(shù)量。F0XP3轉(zhuǎn)錄因子的表達被認為是誘導調(diào)節(jié)性T細胞的關鍵因素。我們和其它人已證明在人中TCR受體的觸發(fā)對于誘導F0XP3表達和抑制性T細胞是必需的(Schubert等，2001; Mantel等，2006)。我們證明由IL-4誘導的GATA3抑制F0XP3的表達，而F0XP3是誘導型Treg (iTreg)分化所需要的(Mantel等，2007)。我們已在體內(nèi)和體外證明了這種功能性拮抗作用，并且已確定了對此的機制基礎是GATA3以IL-4-依賴性的方式結合F0XP3啟動子并隨后抑制F0XP3的轉(zhuǎn)錄。其結果是在產(chǎn)生過量IL-4的相關條件下，這種拮抗作用破壞對Tregs和耐受的誘導。
[0031]在體外條件下，抗原和Thl-或Th2_驅(qū)動因子的缺乏已被證明對于Tregs的誘導是必需的。根據(jù)該觀察結果，已假設Tregs的產(chǎn)生代表了一種默認途徑，其需要T-細胞受體活化，正如任何其它T-細胞分化那樣，但是需要缺少效應物T細胞的決定信號。但是，已知在過敏原注射后，由于Th2記憶T細胞的活化，IL-4局部釋放，并且IL-4在接種過程中還會持續(xù)釋放。因此，在本發(fā)明中，所設計的方法在體內(nèi)阻斷IL-4-介導途徑和同時對T細胞進行過敏原刺激，以增加對過敏原臨床耐受的誘導。
[0032]由于已知IL-13也與IgE同種型轉(zhuǎn)換的誘導、通過B淋巴細胞的IgE的分泌和IgE介導應答的增強有關，本發(fā)明的方法還包括在體內(nèi)阻斷IL-13-介導途徑和同時對T細胞進行過敏原刺激。雖然T細胞缺少IL-13結合受體成分且對IL-13不應答，幾項研究表明IL-13的阻斷能進一步增加對過敏原臨床耐受的誘導。
[0033]最重要的是，本發(fā)明公開了用于延長性抑制IL-4-和IL-13-介導效果并同時延長過敏原呈遞的方法。由于T細胞分化以及由此的免疫記憶的發(fā)展需要T細胞受體(TCR)結合經(jīng)過12-48 h，并且長期持續(xù)記憶可能甚至需要重復的暴露，因此過程的延長是必要的。相應地，對IL-4-和IL-13-介導效果的抑制需要至少在與過敏原從注射的過敏原-佐劑復合物中被釋放的時間相同的時間階段中，最有可能是與其一樣長的時間中有效。否則，所釋放的過敏原分子可能誘導Th2-驅(qū)動因子，從而抑制Tregs的誘導。本發(fā)明公開了用于從位于過敏原呈遞部位的儲存庫中穩(wěn)定釋放IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑的方法。
[0034]本發(fā)明還公開了用于在過敏原呈遞部位建立高局部濃度的IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑的方法，這與抑制劑的延長的存在同樣重要。由于IL-4可以抗原特異性的方式穿梭到抗原呈遞細胞和T細胞之間形成的免疫突觸中，在免疫突觸微環(huán)境中對IL-4-介導效果的有效抑制需要高的局部抑制劑濃度。雖然T細胞不表達IL-13Ra 1，介導IL-13-誘導效果的II型受體復合物在與抗原呈遞細胞和T細胞之間形成的免疫突觸緊鄰的造血細胞和非造血細胞二者上表達。因此，可以假設對IL-13-介導效果的有效抑制也需要高的局部抑制劑濃度。
[0035]然而，抑制 劑的高局部濃度通過全身施用非常難以實現(xiàn)，而且大劑量的治療常常伴隨著增強的副作用。例如，IL-4突變蛋白IL-4/Y124D (位點124的酪氨酸替換為天冬氨酸)以與野生型IL-4同樣的親和力與IL-4Ra結合，但是僅有0.5%的激動活性(Letzelter等，1998)。這種IL-4突變蛋白是IL-4-介導效果的強有力的抑制劑，但是在體內(nèi)實驗中已證明IL-4/Y124D在全身施用后顯示出急性毒性，與野生型IL-4在猴中類似。與野生型IL-4-和IL-4/Y124D-介導的毒性相關的細胞事件包括VCAM-1 (血管細胞黏附分子I)的上調(diào)、血清中MCP-1 (單核細胞趨化蛋白I)的上調(diào)、循環(huán)單核細胞的增加連同循環(huán)淋巴細胞的同時減少，和紅細胞壓積的增加(W0 97/47744)。在人中使用IL-4的臨床試驗中已觀察到在全身施用后有類似的細胞運輸(Wong等，1992)。這些結果表明IL-4/Y124D的這些毒性是由除了 T細胞之外的細胞介導的激動劑活性造成的。根據(jù)已知的IL-4對于內(nèi)皮細胞的效果，所觀察到的IL-4/Y124D的毒性表明這種IL-4突變蛋白與內(nèi)皮細胞上表達的新的IL-4受體復合物之間有相互作用(W0 97/47744)。這個實例證明有必要將IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑的高局部濃度主要限制在過敏原呈遞部位。
[0036]本發(fā)明的方法通過公開使用具有相對短的半衰期的IL-4-和IL-13-介導效果抑制劑的方法解決該問題。這種抑制劑在從過敏原呈遞部位的儲存庫釋放后具有局部活性，并在其從過敏原呈遞部位被擴散開和運送走的時候從循環(huán)中被快速除去。例如，美國專利6，028，176和6，313，272公開了具有強拮抗活性但是在體內(nèi)具有大約3_6小時的相對短的血漿半衰期的IL-4突變蛋白。
[0037]因此，本發(fā)明公開的方法提供了在過敏原呈遞部位的延長時間階段的高局部濃度的抑制劑，而且由于其快速清除，其伴隨從過敏原呈遞部位向外的有限半徑的抑制活性。因此，抑制劑介導的可能的副作用被顯著減少。
[0038]1.T-細胞分化決定信號的抑制劑
對于本發(fā)明來說，用于IL-4和IL-13的效果的局部抑制的幾個方法(principles)是合適的(其綜述參見Long，2009)。優(yōu)選的方法包括但不限于拮抗性細胞因子衍生物、可溶性細胞因子受體構建體、單克隆抗體、其片段或者對IL-4和IL-13或它們各自的受體具有特異性的其它蛋白質(zhì)構建體、以及抗細胞因子和抗細胞因子受體的適配體的施用?？梢允褂萌魏巫鳛镮L-4、IL-13或IL-4/IL-13拮抗劑發(fā)揮作用并適合于根據(jù)本發(fā)明方法施用的化合物。拮抗劑不需要完全破壞IL-4-或IL-13-誘導的生物學活性才是有用的。更確切地說，所給出的拮抗劑可以降低IL-4和/或IL-13的生物學活性。在本發(fā)明的方法和組合物中可以使用兩種或更多種拮抗劑的組合。
[0039]最優(yōu)選的IL-4和IL-13抑制劑是那些a)提供小到中等分子大小并在水性環(huán)境中具有高溶解性以快速擴散到免疫突觸中的，b)可以大量包埋在適合于在延長的時間中持續(xù)釋放抑制劑的基質(zhì)中的，c)可以從形成儲存庫的基質(zhì)中足量釋放以在過敏原呈遞部位提供高局部濃度的，和d)具有相對短的血漿半衰期以減少由于抑制劑和遠離過敏原呈遞位點的靶標的相互作用而導致的可能的副作用的抑制劑。
[0040]可用于本發(fā)明的治療目的的絕大部分抗IL-4和抗IL-13的方法(principles)已被公開并在用于治 療哮喘的動物模型和臨床試驗中進行評價(其綜述參見Long，2009)。但是，根據(jù)本發(fā)明方法的這些抑制劑的應用還未被公開。
[0041]許多IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑，包括拮抗性細胞因子衍生物、可溶性細胞因子受體構建體、抗細胞因子和抗細胞因子受體的抗體，已被開發(fā)以在哮喘患者中中斷或減少Th2依賴性的過敏性炎癥。治療的目的是使患者的免疫應答向細胞毒性T-細胞-介導的免疫應答，例如以Thl-型免疫表型為特征的免疫應答轉(zhuǎn)變。相反，本發(fā)明的治療目的不是由Th2-型免疫表型向Thl-型免疫表型轉(zhuǎn)變，而是在不含Thl-或Th2-驅(qū)動因子的局部微環(huán)境中誘導Tregs，盡管存在引發(fā)Th2-型免疫應答的過敏原和佐劑。
[0042]除了用于治療哮喘的應用外，專利WO 2009/081 201 A2公開了 IL_4Ra抑制劑的臨床應用，其用于a)過敏反應的治療以抑制IgE合成(包括例如特應性皮炎和食物過敏)，
b)移植的治療以防止移植排斥，和c)抑制遲發(fā)型超敏反應或接觸性超敏反應。但是，所提出的臨床應用的細節(jié)尚未被公開。
[0043]通常，已公開的IL-4抑制的應用中的基本原理是患者的Th2_型免疫應答向Thl-型免疫應答的轉(zhuǎn)變。例如，IL-4-介導途徑抑制劑用于癌癥治療的應用是基于這樣的設想，促進Thl-型免疫應答有時對于患者是有利的(W0 02/04009 A2)。而且，美國專利No2011/0002013 Al公開了 IL-4拮抗劑可用作過敏反應免疫治療的佐劑和疫苗的佐劑，特別是當引導指向Thl應答的免疫應答對所討論的疾病的治療或預防將會有益時。所建議的IL-4拮抗劑作為過敏反應免疫治療的佐劑的應用的細節(jié)也未被公開。
[0044]I1.白介素變體對T-細胞分化決定信號的抑制
在本發(fā)明的一個實施方案中，能拮抗IL-4和IL-13活性的白介素變體被用作抑制劑?？梢允褂萌魏巫鳛镮L-4、IL-13或IL-4/IL-13拮抗劑發(fā)揮作用并適合用于根據(jù)本發(fā)明方法施用的白介素變體?；诎捉樗氐霓卓箘┎恍枰耆茐腎L-4-或IL-13-誘導的生物學活性才是有用的。更確切地說，所給出的拮抗劑可以降低IL-4和/或IL-13的生物學活性。
[0045]拮抗性IL-4突變體已有描述(Kruse等，1992; Muller等，1994;美國專利6，028，176;美國專利5，723，118)。在人IL-4的四個螺旋束中，D螺旋上的酪氨酸(Y124)形成與共用Y-鏈(Y。)的重要接觸。當Y124突變?yōu)樘於彼?Y124D)時，得到的分子以與野生型IL-4相同的親和性與IL-4Ra結合，但是僅具有0.5%的激動活性(Letzelter等，1998)。類似地，人IL-4的121位點的精氨酸與IL_13Ra I相互作用。R121突變產(chǎn)生的突變體可以結合IL-4Ra，但是是IL-4-和IL-13-誘導應答二者的拮抗劑(Kruse等，1993)。但是，也可以考慮通過IL-4的其它突變或者額外突變產(chǎn)生適用于本發(fā)明方法的IL-4變體。例如，通過IL-4的125位點的絲氨酸的突變，產(chǎn)生能夠結合IL-4Ra的突變體，但是是IL-4-和IL-13-誘導應答二者的拮抗劑(Kruse等，1993)。適用于本發(fā)明方法的是具有單突變、雙突變和三突變的拮抗性白介素-4變體，單突變包括但不限于氨基酸位點R121、Y124和S125 ;雙突變和三突變包括但不限于上列氨基酸位點的組合。優(yōu)選的是具有相對短的半衰期的拮抗性IL-4變體，以限制遠離過敏原呈遞部位的副作用。
[0046]已證明當皮下施用或通過霧化吸入施用時，人IL-4的雙突變體(R121D/Y124D)保護過敏性食蟹猴免于遭受過敏原誘導的呼吸道高反應性。進一步，將這種雙突變體在猴中皮下施用6周或更長時間減少皮膚風疫(wheal)反應和過敏原特異性IgE的循環(huán)濃度。最近在臨床研究中已經(jīng)評價了 IL-4的雙突變體(R121D/Y124D)對于哮喘患者中對過敏原激發(fā)的晚期哮喘反應的效果(Wenzel等，2007)。該研究證明對IL-4和IL-13的雙重抑制可以積極影響實驗性過敏原激發(fā)之后的晚期哮喘反應進程。在患有特應性哮喘或特應性濕疹的參與者中，使用雙突變體進行的治療幾乎不伴有不良事件，無論是通過皮下注射(至多30mg，進行至多13周)還是通過吸入(至多60mg，進行至多4周)施用。但是，應當強調(diào)，根據(jù)本發(fā)明方法的這種雙突變體在過敏反應免疫治療中的應用還未被公開。
[0047]超過10年前，動物實驗已經(jīng)證明在體內(nèi)IL-4/I1-13受體系統(tǒng)的抑制可以完全消除對過敏原的體液免疫應答和過敏癥狀的發(fā)生(Grunewald等，1999)。在用卵清蛋白(OVA)免疫小鼠之前和之后用小鼠IL-4突變體Q116D/Y119D (人IL-4雙突變體R121D/Y124D的小鼠等價物)處理BALB/c小鼠完全抑制OVA-特異性IgE和IgGl的合成。此外，特異性IgG2a、IgG2b和IgG3的合成被抑制，這可以指示對OVA的耐受的發(fā)生。通過在存在Alum作為佐劑的條件下腹腔注射10 μ g OVA進行免疫。在第O天，在OVA免疫前和免疫后2小時通過腹腔注射施用小鼠IL-4突變體，每次劑量50 μ go從第I至8天，繼續(xù)每天兩次腹腔注射30 μ g突變體進行處理。作者推斷小鼠IL-4突變體Q116D/Y119D在體內(nèi)抑制抗原特異性體液免疫應答和由IgE或IgGl介導的過敏性癥狀，并且因此對于特應性病癥和其它Th2-主導的疾病的治療應當是有利的。雖然該研究的結果接近于本發(fā)明的方法和治療目的，Grunewald等(1999)的研究沒有公開如何在在過敏原呈遞部位在延長時間階段內(nèi)提供高局部濃度的抑制劑，同時由于其快速清除，具有離開過敏原呈遞部位的有限半徑的抑制活性。Grunewald等(1999)報道了通過在用OVA免疫之前開始應用小鼠IL-4突變體Q116D/Y119D從而對OVA過敏原耐受的明顯誘導,這與對于已存在過敏反應的患者的免疫治療不能相比。對于在具有Th2-型免疫表型的個體中對過敏原耐受的誘導來說，僅有本發(fā)明的方法能提供了合適的方法，以確保在不含Thl-或Thr-驅(qū)動因子的局部微環(huán)境中充分誘導Tregs ，盡管存在過敏原。[0048]可用于本發(fā)明方法的IL-13突變體包括但不限于IL-13突變體E13K，它是人IL-13的強有力的拮抗劑，并且還能部分抑制人IL-4的應答(K1i等，2004)。IL-13第13位的谷氨酸與IL-4Ra結合，且將其突變?yōu)橘嚢彼峤档推渑cIL_4Ra的結合。雖然IL-13E13K防止IL-4Ra與IL_13Ra I結合，但由于可利用可選的IL-4R復合物，IL-4Ra: Y。，無法實現(xiàn)對IL-4應答的完全抑制。
[0049]在優(yōu)選的實施方案中，人IL-4雙突變體R121D/Y124D被用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行對IL-4-和IL-13-介導途徑的抑制。人IL-4雙突變體能夠拮抗IL-4的活性以及IL-13的活性(Grunewald 等，1998; Tony 等，1994)。
[0050]II1.可溶性細胞因子受體構建體對T-細胞分化決定信號的抑制
在本發(fā)明的一個實施方案中，可溶性細胞因子受體構建體被用于本發(fā)明的方法，以抑制IL-4-和IL-13-介導途徑。優(yōu)選的構建體包括但不限于IL-4Rci的可溶性胞外域，及其保留有IL-4結合能力的變體、片段和衍生物。人以及小鼠IL-4受體和它們的核苷酸序列已有描述(美國專利 5，599，905; Idzerda 等，1990 (人 IL-4 受體);Mosley 等，1989 (小鼠IL-4受體))。編碼的人IL-4受體包含N-末端信號肽，后面接著是胞外域、相應于氨基酸208-381的跨膜區(qū)域和相應于氨基酸232-800的胞質(zhì)區(qū)。由可變mRNA構建體，例如可以是由于轉(zhuǎn)錄后的不同mRNA剪接事件產(chǎn)生的構建體，和產(chǎn)生能結合IL-4的多肽的構建體，產(chǎn)生的IL-4受體多肽屬于本文所公開的IL-4受體多肽。IL-4受體變體包括那些具有通過一個或多個取代、缺失或插入而不同于天然序列，但保留了 IL-4受體蛋白的生物學活性的氨基酸或核苷酸序列的變體。本發(fā)明還包括具有或不具有相關的天然糖基化模式的IL-4受體蛋白。糖基化模式可以根據(jù)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主細胞的類型而有所不同。另一種選擇是通過定點突變使N-糖基化位點失活。IL-4受體蛋白的衍生物包括那些與天然蛋白相比顯示出不同結構，具有衍生化氨基酸(例如通過交聯(lián)試劑，或聚乙二醇)的衍生物。
[0051]在另一個實施方案中，IL-4Ra的可溶性胞外域、其保留有結合IL_4能力的其變體、片段和衍生物與其它蛋白質(zhì)或多肽的N-末端或C-末端化學綴合或融合。優(yōu)選的IL-4受體融合蛋白或多肽包括但不限于利于純化(例如His-標簽)或識別(例如Flag肽)的肽，和具有促進寡聚化的性質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽(例如亮氨酸拉鏈)。在優(yōu)選的具體實施方案中，IL-4Ra的可溶性胞外域與任何同種型的人免疫球蛋白的Fe部分或選定的恒定域，或它們的能夠二聚化的片段融合。如果融合蛋白由抗體的重鏈和輕鏈二者組成，則可能形成IL-4受體的多達四個胞外域的寡聚物。優(yōu)選的構建體還包括異源寡聚物，其中IL-4Ra的可溶性胞外域和IL_13Ra I的可溶性胞外域與能夠寡聚化的人蛋白或多肽融合。
[0052]在適用于本發(fā)明方法的基于細胞因子受體的抑制劑中，包含IL-4Rci的可溶性胞外域和IL-13Ra I的可溶性胞外域二者的異二聚體是最優(yōu)選的。競爭性抑制IL-4與其受體結合的由人IL-4R-a鏈(shIL-4R)的胞外部分組成的可溶性IL-4受體片段在早期人的研究中似乎很有前景(Borish等，2001)。但是，隨后的大規(guī)模臨床試驗表明這種試劑在哮喘中沒有臨床效果。這種欠佳的應答可以是由于shIL-4R和IL-13Ra I在細胞表面形成復合物，由此使IL-13和IL-13Ra I的弱相互作用穩(wěn)定，導致增強的IL-13應答所造成的。為了抑制IL-4-和IL-13-介導應答二者，已產(chǎn)生了可溶的異二聚受體構建體，其包含IL-4R a和IL-13Ra I的胞外域，二者與人IgGl的Fe部分融合(Economides等，2003)。這種異二聚構建體以高親和力與IL-4和IL-13結合。IL-13以低親和力與未復合的IL_13Ra I結合，但IL-13Ra I和IL_4Ra的復合物形成對IL-13的高親和力結合位點，且IL-4甚至以高親和力與未復合的IL-4Ra結合(Andrews等，2006)。根據(jù)本發(fā)明方法的為IL-13和IL-4提供結合位點的異二聚構建體在過敏反應免疫治療中的應用還未公開。
[0053]IV.抗體對T-細胞分化決定信號的抑制
在另一個實施方案中，作為IL-4或IL-13拮抗劑的抗體被用于本發(fā)明的方法。抗體優(yōu)選是單克隆抗體或其抗原結合片段。有利地，使用人源化或嵌合單克隆抗體。最優(yōu)選的是人單克隆抗體。合適的抗體的實例是與IL-4或IL-13分別和IL-4受體或IL-13受體的結合相互作用的那些抗體。這些抗體，本文中稱為阻斷抗體，可以針對細胞因子IL-4和IL-13或細胞因子受體IL-4Rci和IL-13Rci I產(chǎn)生，并且可以在常規(guī)測定中篩選其干擾IL-4和IL-13與它們各自的受體亞基結合的能力。這些抗體的抗原結合片段，包括Fab和F (ab’)2或人工抗體構建體例如scFv或其它蛋白質(zhì)構建體例如anticalins也適用于本發(fā)明的方法。其它實施方案包括嵌合抗體和其抗原結合片段，例如小鼠單克隆抗體的人源化形式，和人單克隆抗體及其抗原結合片段。
[0054]在優(yōu)選的實施方案中，具有對IL-4和IL-13的特異性能夠阻斷這兩種細胞因子的生物活性的兩種或更多種人源化或人單克隆抗體的組合被用于本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，這兩個細胞因子的生物活性需要被阻斷，以在過敏原呈遞部位創(chuàng)造不含Th1-或Th2-驅(qū)動因子的局部微環(huán)境。
[0055]能阻斷IL-4和IL-13的生物學活性的合適的單克隆抗體最近已有綜述(Holgate等，2008; Long, 2009)。例如,抗IL-4人源化單克隆抗體pascolizumab已被證明在體外有效阻斷IL-4應答(Hart等，2002)。雖然這種抗體在對哮喘的治療中僅產(chǎn)生平常的結果，但它對于本 發(fā)明的方法來說可能是一種有發(fā)展前景的候選物。IL-13與IL-4Ra的結合可以被完全人源化的單克隆IgGl抗體IMA-638有效阻斷，并且IL-13和IL_13Ra I的相互作用可以被完全人源化的單克隆IgGl抗體IMA-026抑制(Gauvreau等，2010)。這兩種抗體在食蟹猴的哮喘的治療中都表現(xiàn)出效果，但是只有IMA-638能夠在II期臨床研究中減少早期和晚期兩者的哮喘反應(Gauvreau等，2010)。根據(jù)本發(fā)明方法的這些抗體，其片段和人工構建體，以及其它抗細胞因子的蛋白質(zhì)構建體在過敏反應免疫治療中的應用未曾被公開。
[0056]在本發(fā)明的另一個實施方案中，能夠使細胞因子受體失活的抗體被用于抑制IL-4-和IL-13-介導途徑。優(yōu)選的是對IL-4Ra具有特異性能夠阻斷IL-4和IL-13 二者的生物學活性的人源化或人單克隆抗體。例如，完全人的單克隆IgG2抗體AMG317以高親和力(Kd = 1.8 X 1^10 M)與IL-4Ra結合，且有力地阻斷IL-4和IL-13 二者的生物學活性(Corren等，2010)。而且，AMG317已被證明在體外對炎癥具有重要作用。雖然在II期研究中，在患有哮喘的患者中，AMG317未證明對于整個群體的患者具有臨床效果(Corren等，2010)，但對于本發(fā)明的方法來說，該抗體提供了優(yōu)選的性質(zhì)。但是，應當強調(diào)，根據(jù)本發(fā)明方法的該抗體和其它抗細胞因子受體的抗體，其片段和人工構建體，以及其它抗細胞因子受體的蛋白質(zhì)構建體在過敏反應免疫治療中的應用未曾被公開。
[0057]V.適配體對T-細胞分化決定信號的抑制
在本發(fā)明的另一個實施方案中，適配體被用于抑制IL-4-和IL-13-介導途徑。適配體是通過多輪體外選擇產(chǎn)生的核酸結合體(其綜述參見Famulok等，1999; Yan等，2005)。典型地，所選擇的適配體與其靶標非常緊密地(通常是在低的納摩爾的范圍)和特異地結合。適配體還可以區(qū)別緊密相關的蛋白質(zhì)靶標。適配體具有幾個關鍵特征，其使得它們非常適合作為本發(fā)明方法的試劑。首先，適配體相對較小并易于接近大分子難以靶向的位點，例如在抗原呈遞細胞和T細胞之間形成的免疫突觸。本發(fā)明的另一個優(yōu)點是有可能改造適配體對于降解核酸酶的穩(wěn)定性，由此確定它們的抑制活性的時間階段。未修飾的基于RNA-和DNA-的適配體在血清中可以在數(shù)分鐘內(nèi)開始降解，然而包含修飾的堿基和硫代磷酸酯鍵的適配體對于降解核酸酶顯示出顯著增強的穩(wěn)定性。例如，2’ -氨基密啶-修飾的RNA已被證明在數(shù)天內(nèi)保持穩(wěn)定。而且，修飾還可以被應用于適配體末端以使其具有更強的穩(wěn)定性。例如，可以加入3’-3’鍵以防止3’ -核酸外切酶降解?？梢酝ㄟ^Spiegelmer-技術(其綜述參見Famulok等，1999)或通過使用肽核酸(EP I 785 490 BI)產(chǎn)生穩(wěn)定的適配體。肽核酸(PM)代表了一類核酸類似物，其中帶電荷的脫氧核糖-磷酸二酯骨架被替換為含有N-(2-胺乙基)甘氨酸單體的肽鏈，具有核酸堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶鏈接到所述單體的α-碳上。由于它的人工特性，PNA提供對核酸酶和蛋白酶的完全抵抗力。
[0058]在優(yōu)選的實施方案中，兩個或更多個對IL-4和IL-13具有特異性能夠阻斷這兩個細胞因子的生物學活性的適配體 的組合被用于本發(fā)明的方法。
[0059]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，能夠使細胞因子受體失活的適配體被用于抑制IL-4-和IL-13-介導途徑。優(yōu)選的是對IL-4Ra具有特異性能夠阻斷IL-4和IL-13 二者的生物學活性的適配體。
[0060]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，所使用的適配體提供對酶促降解的有限的抵抗，其足以在過敏原呈遞部位及其附近有效抑制IL-4-和IL-12-介導途徑，但是確保適配體從該部位擴散開的時候快速降解。在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法的需要通過修飾其結構調(diào)整抑制性適配體的穩(wěn)定性，所述修飾包括但不限于硫代磷酸酯鍵的引入，堿基修飾(例如通過2’ -氨基嘧啶的修飾)，以及向適配體末端添加3’ -3’鍵。
[0061]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法的需要調(diào)整抑制性適配體的生理清除。在非常快速清除的情況下，抑制性適配體的血漿半衰期可以通過與脂類或高分子量化合物例如40 kD聚乙二醇部分連接而被延長。
[0062]V1.用于T-細胞分化決定信號抑制劑的延長遞送的基質(zhì)
在優(yōu)選的實施方案中，用于IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的局部遞送的基質(zhì)a)可以作為大量抑制劑或抑制劑組合的儲存庫，b)允許釋放足夠量的抑制劑或抑制劑組合，以在延長的時間階段內(nèi)(最佳地是幾天)有效局部抑制IL-4-和IL-13-介導途徑，c)是生物可降解的，以及d)與用于根據(jù)本發(fā)明方法進行的耐受誘導的佐劑和一種或多種過敏原是化學和物理相容的。
[0063]在本發(fā)明的一個實施方案中，生物可降解聚合物被用于IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的控制遞送。優(yōu)選的被FDA批準的并用于臨床試驗中的生物可降解聚合物包括但不限于聚(D，L-乳酸)、聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)和L-丙交酯和D，L-丙交酯的共聚物。這些聚合物的重要特性是它們能夠被局部應用，其允許維持抑制劑在病灶內(nèi)的濃度，而系統(tǒng)性毒副作用減到最小。所有被FDA批準的聚合物都已被廣泛研究過其生物相容性、毒理學和降解動力學。而且，這些聚合物已被證明在體外釋放包埋藥物幾小時至多40周，且在體內(nèi)幾周有效。例如，包含抗-VEGF RNA適配體EYE001的PLGA微球已被證明在20天的時間期間以持續(xù)的方式釋放適配體，具有平均速度為每天2 μ g(CarrasquiI1等，2003)。
[0064]在更優(yōu)選的實施方案中，生物可降解的可注射的原位成型凝膠系統(tǒng)被用于IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的控制遞送。優(yōu)選的原位成型凝膠系統(tǒng)(水凝膠)經(jīng)過溶膠-凝膠-溶膠的轉(zhuǎn)變，其在室溫下是自由流動的溶膠，在體溫下是不流動的凝膠。與其它生物可降解聚合物相比，可注射的熱膠凝聚合物具有幾個優(yōu)點，包括易于制備，對生物活性分子例如IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的高封裝效率，以及在制備過程中不含有害的有機溶劑(Qiao等2005)。
[0065]在一個具體實施方案中，所使用的生物可降解熱膠凝嵌段聚合物是基于單甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)的，包括但不限于a)由MPEG和聚(ε -己內(nèi)酯)(PCL)組成的二嵌段共聚物(Hyun 等，2007)，b) MPEG4-(PCL-ra/?-PLLA) 二嵌段共聚物(Kang 等，2010)，和
c)由MPEG和PLGA組成的二嵌段共聚物(Peng等，2010)。包含PCL的MPEG共聚物提供的優(yōu)點是，與包含PLLA和PLGA的MPEG共聚物相反，它們在生物降解后不形成酸性環(huán)境(Hyun等，2007)。
[0066]在另一個具體實施方案中，所使用的生物可降解的熱膠凝三嵌段聚合物包括但不限于 a) PLGA-PEG-PLGA (Qiao 等，2005)，b) PEG-PLGA-PEG (Zhang 等，2006)，和 c)PEG-PCL-PEG (PECE) (Gong等，2009 a)。由PLGA和PEG制成的各種生物可降解熱膠凝三嵌段聚合物在專利申請WO 99/18142中公開。在較低的溫度，在水溶液中，共聚物鏈的親水PEG段和水分子之間的氫鍵占主導地位，導致這些共聚物在水中溶解。隨著溫度升高，氫鍵連接變得較弱，而疏水段例如PLGA段的疏水作用力變得較強，導致溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)變。PEG、PLGA和PCL是熟知的被FDA批準的生物可降解的和生物相容的材料，其在生物醫(yī)學領域已被廣泛使用。 [0067]在另一個具體實施方案中，使用生物可降解熱膠凝二嵌段和三嵌段共聚物，其由聚環(huán)氧乙烷(PEO)和生物可降解的聚酯例如聚-L-乳酸(PLLA)組成(Jeong等，1997)。但是，這些嵌段共聚物在較高溫度是自由流動的溶膠，而在較低溫度形成凝膠。例如，PE0-PLLA-PE0 (Mr 5，000-2, 040-5，000)的 23% 水溶液在 45°C是溶膠，而在 37°C變?yōu)槟z。通過改變生物可降解嵌段長度，可以操縱溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，例如，增加PLLA嵌段長度使嵌段共聚物在水中聚集的傾向增加，導致凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變曲線的斜率變得陡峭，并且在較低的濃度就開始膠凝化。溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度是嵌段聚合物濃度以及組成的函數(shù)。
[0068]在又一個具體實施方案中，使用泊洛沙姆(商品名Pluronics)。泊洛沙姆是非離子三嵌段共聚物，其由中間的聚環(huán)氧丙烷(PPO)疏水鏈和兩側的兩個聚(氧化乙烯)(PEO)的親水鏈組成(Gilbert等，1987)。泊洛沙姆在水溶液中也顯示出溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，已被用于幾種治療劑的持續(xù)釋放。但是，泊洛沙姆不是生物可降解的，并可以在體內(nèi)積聚，其可導致毒副作用。因此，泊洛沙姆在生物醫(yī)學領域的應用受到很大限制。在最近的研究中，Pluronic F127 (100-單位的PEO鏈圍繞著一個65-單位的ΡΡ0)已被用于與PECE形成復合熱敏水凝膠(Gong等，2009-b)。根據(jù)該研究的結果,Pluronic F127/PECE復合水凝膠是生物相容的，具有低的細胞毒性，并且因此可以也適用于本發(fā)明的方法。
[0069]不同的生物可降解熱膠凝聚合物提供了不同的穩(wěn)定性特性。例如，泊洛沙姆三嵌段聚合物提供優(yōu)良的熱敏性，但是由于PPO嵌段的弱疏水性，這種共聚物形成快速溶蝕的凝膠，已有報道其在體內(nèi)最多堅持幾個小時。在體外條件下將泊洛沙姆凝膠暴露于磷酸鹽緩沖液證明在2天之內(nèi)發(fā)生凝膠溶蝕(Hyun等，2007)。當聚合物溶液被皮下注射到大鼠中的時候觀察到類似的結果。2天后不能觀察到泊洛沙姆凝膠(Hyun等，2007)。用MPEG-PCL凝膠獲得了不同的結果。在體外條件下，MPEG-PCL凝膠保持其結構完整性大于28天，且在皮下注射到大鼠中后，MPEG-PCL凝膠保持其結構完整性大于30天。但是，MPEG-PCL凝膠的穩(wěn)定性也可產(chǎn)生問題，這是由于與PLA、PGA或PLGA的降解速度相比，PCL在體內(nèi)的降解速度相當?shù)?2-3年)(其綜述參見Sinha等，2004)。因此，在體內(nèi)在行使遞送IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的功能之后，MPEG-PCL共聚物在生理條件下在體內(nèi)可保留不確定時間階段。因此，用于本發(fā)明方法的最優(yōu)選的生物可降解熱膠凝聚合物是其結構完整性保持幾天但在體內(nèi)保留不超過一周的那些聚合物。
[0070]在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，使用生物可降解熱膠凝聚合物，其允許改變它們的降解動力學。例如，PLLA段可以被摻入到MPEG-PCL共聚物的PCL段中，由于PLLA提供更好的水對PLLA的酯鍵的可接近性，由此增強了共聚物的水解降解(Kang等，2010)。得到的MPEG4- (PCL-ra/7-PLLA) 二嵌段共聚物通過改變PCL段中PLLA的量，提供從幾周到幾個月的可調(diào)節(jié)的治療窗(Kang等，2010)。在另一個實例中，PLGA-PEG-PLGA水凝膠溶蝕的速度可以通過改變PLGA段中DL-丙交酯/乙交酯的摩爾比來改變。DL-丙交酯分子比乙交酯分子更疏水。因此，通過增加PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的PLGA段中DL-丙交酯/乙交酯的摩爾比，由于共聚物分子中更強的疏水作用而形成更穩(wěn)定的水凝膠(Qiao等2005)。
[0071]已經(jīng)分析了幾種生物可降解熱膠凝聚合物介導蛋白質(zhì)持續(xù)釋放的能力。雖然不同的蛋白質(zhì)例如細胞因子突變體、可溶性細胞因子受體構建體和抗體有可能以各自的方式影響每種共聚物的釋放行為，對模式蛋白例如牛血清清蛋白(BSA)的釋放的表征提供了重要的信息。使用包含不同百分比的PECE和Pluronic F127的復合水凝膠，BSA的體外釋放行為證明是依賴于水凝膠組合物、初始BSA加樣量和水凝膠濃度的(Gong等，2009-b)。使用包含60% PECE和40% Pluronic F127的復合水凝膠，在存在30wt°/c^K凝膠的條件下加入4 mgBSA,實現(xiàn)了大于15天的BSA的持續(xù)釋放。使用MPEG-PCL共聚物，BSA的體外持續(xù)釋放結果是大于20天，且在體內(nèi)條件下(皮下注射到大鼠中后)，持續(xù)釋放持續(xù)了大于30天(Hyung等，2007)。
[0072] 雖然對于大部分臨床應用來說，治療藥物在幾周的時期中從生物可降解熱膠凝聚合物中的持續(xù)釋放是令人期望的，本發(fā)明的方法不需要IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑有這種延長的持續(xù)釋放，因為免疫記憶的發(fā)生需要T細胞受體(TCR)結合僅1-2天的時間階段。而且，IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑經(jīng)過幾周時間階段的延長的持續(xù)釋放可產(chǎn)生局部副作用。因此，優(yōu)選的是在不超過一周的有限時間內(nèi)遞送IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的生物可降解熱膠凝聚合物。
[0073]PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物代表了為本發(fā)明方法提供有利的降解和釋放動力學的水凝膠的一個實例。如近期的研究中所證明的，胰島素從PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物中的釋放持續(xù)大約4天，在第一天中有最初的突釋效果(Choi等，2003)。最初的突釋效果在過敏原呈遞的初始階段對于IL-4-和IL-13-介導途徑的完全抑制可以是有利的。但是，可以通過與鋅的絡合降低IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的溶解性從而改變釋放動力學，如鋅-胰島素復合物所顯示的那樣(Choi等，2003)。
[0074]雖然泊洛沙姆凝膠不是生物可降解的，泊洛沙姆407 (商品名Pluronic F127)凝膠也代表了為本發(fā)明方法提供有利的降解和釋放動力學的熱膠凝水凝膠的一個實例。雖然在體外條件下，證明BSA從泊洛沙姆407凝膠中的釋放幾乎在I天內(nèi)完成，BSA在體內(nèi)條件下(皮下注射到大鼠中后)的持續(xù)釋放持續(xù)了 3天(Hyung等，2007)。
[0075]VI1.佐劑
由于T細胞分化以及由此的免疫記憶的發(fā)生要求T細胞受體(TCR)結合大于12-48h，而且長期持續(xù)記憶甚至可能需要反復暴露，因此抗原暴露的時間非常重要。佐劑例如油和alum提供了儲存效果，其延長抗原的壽命，并由此延長抗原對T細胞的刺激。但是，除了儲存效果，目前可用的佐劑觸發(fā)Thl-型或Th2-型免疫應答或二者(其綜述參見Leroux-Roels, 2010; Nicholls等，2010)?；谶@樣的假設:Tregs的產(chǎn)生代表了一種默認途徑，其需要T-細胞受體激活但需要缺乏效應物T細胞決定信號，目前可用的佐劑對于本發(fā)明的目的來說不是最佳的。為本發(fā)明的方法所需要的佐劑促進過敏原攝取和對T細胞的延長的刺激，而不提供決定信號，由此誘導Treg增加。遺憾的是，提供所有期望性質(zhì)的佐劑仍未可得。
[0076]脂質(zhì)體，由脂質(zhì)層組成的合成納米微球，代表了一種經(jīng)典的其本身沒有活性的佐劑。它們主要的作用方式是通過抗原呈遞。脂質(zhì)體可以將過敏原封裝在其中并作為過敏原遞送媒介物。但是，脂質(zhì)體不適合于過敏原的緩慢釋放，而緩慢釋放對于延長免疫刺激來說是必需的。
[0077]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，引發(fā)Th2_型免疫應答的佐劑，包括但不限于鋁鹽、Montanide乳劑(基于角鯊烯的油包水乳劑)和聚磷腈被用于本發(fā)明的方法。雖然主要引發(fā)Th2-型免疫應答的佐劑可能干擾Tregs的誘導，在存在IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的條件下，這種佐劑比那些主要引發(fā)Thl-型免疫應答的佐劑更適用于本發(fā)明的治療目的。在存在IL-4-和IL-13-介 導途徑抑制劑的條件下，引發(fā)Th2-型免疫應答的佐劑的反作用活性(contra-productive activity)顯著減少或甚至被破壞,而Thl-型促進佐劑的活性可以不受影響。因此，Thl-型細胞因子會干擾Tregs的誘導。
[0078]在一個優(yōu)選的具體實施方案中，含鋁佐劑，典型地是磷酸鋁或氫氧化鋁凝膠(通常被稱為alum)被用于本發(fā)明的方法。一種作用機理是由于它使免疫分子在體內(nèi)停留在特定部位，允許它們可以緩慢釋放并因此有延長的免疫應答，即所謂的儲存效果。alum也似乎是通過將抗原保持為顆粒(而不是溶解)形式行使其佐劑活性，從而增強APCs對抗原的吞噬作用。樹突細胞(DC)能夠攝取溶解的抗原和吸附在含鋁佐劑上的抗原。而且，已經(jīng)清楚alum能夠直接激活免疫細胞。Alum可以誘導單核細胞/巨噬細胞成熟化為DC-樣細胞。這個過程依賴于NLRP3 (N0D-樣受體家族，含熱蛋白結構域的蛋白3)的激活，NLRP3是引起促炎性細胞因子例如IL-1 β和IL-18產(chǎn)生的炎性體的一部分。首先，alum引發(fā)Th2應答，包括IL-4和IL-5的產(chǎn)生以及B細胞產(chǎn)生IgGl和IgE (其綜述參見Nicolls等，2010)。
[0079]過敏原與含鋁佐劑溫育后，過敏原通過靜電相互作用以及磷酸基團和羥基基團之間的交換被部分或完全吸附到佐劑上。幾項研究已證明吸附到含鋁佐劑上可防止過敏原的快速酶促降解，但是吸附過程也可能誘導結構變化，導致熱穩(wěn)定性降低(其綜述參見Clapp等，2011)。一種提高疫苗熱穩(wěn)定性的方法是使用緩沖液的組合來改變含鋁佐劑的表面化學和控制過敏原氨基酸側鏈的離子化狀態(tài)。另一個方法是鑒別使溶液狀態(tài)的一種或多種過敏原穩(wěn)定的條件，并使用該條件作為使一種或多種過敏原的吸附誘導的熱不穩(wěn)定作用的程度最小化的指導。但是，實際上穩(wěn)定方法可以被忽略，這是因為抗原(包括過敏原)向含鋁佐劑的吸附對于免疫應答的重要性在近期的研究中受到質(zhì)疑(其綜述參見Clapp等，2011)。例如，針對母雞卵清溶菌酶在兔中引發(fā)的免疫應答與吸附在含鋁佐劑上的抗原級分無關(Chang等，2001)。但是，為了使免疫應答達到最大，某種程度的吸附或者至少抗原和佐劑的接近似乎是重要的。
[0080]在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，聚磷腈(水溶聚合物)被用于本發(fā)明的方法。聚[二(羧酸苯氧基)磷腈](PCPP)已被證明增強抗體應答，同時具有可忽略不計的反應原性(Nicolls 等，2010)。
[0081]在又一個具體實施方案中，基于角鯊烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)被用于本發(fā)明的方法。Montanide乳劑與不完全弗氏佐劑類似，但它們是生物可降解的，并因此具有顯著較小的毒性，并且已被用在幾項臨床試驗中(Nicolls等，2010)。
[0082]在另一個實施方案中，引發(fā)組合的Thl-和Th2_型免疫應答的佐劑被用于本發(fā)明的方法。雖然引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應答的佐劑有可能在一定程度上干擾Tregs的誘導，但這種佐劑可以為組合物提供有利的性質(zhì)，其可能對本發(fā)明的方法是有益的。引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應答的佐劑包括但不限于基于角鯊烯的水包油乳劑、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和基于菊粉和病毒顆粒的佐劑(其綜述參見Nicholls 等,2010)。
[0083]VII1.包含IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑、介導這種抑制劑的延長性遞送的基質(zhì)、過敏原和佐劑的疫苗組合物。
[0084]為了實現(xiàn)一種或多種過敏原的延長的呈遞以及在過敏原呈遞部位對IL-4-和IL-13-介導效果的延長的抑制，一種或多種過敏原和一種或多種抑制劑二者以限制這些組分從過敏原呈遞部位擴散開的方式共同施用。可用于本發(fā)明的有用的擴散限制技術包括但不限于將組分吸附到含鋁材料上，用組分制備油包水或水包油乳劑，以及將組分摻入到生物可降解聚合物包括生物可降解熱膠凝聚合物中。
[0085]對于某些組分來說，為實現(xiàn)本發(fā)明的治療目的組合兩種或更多種擴散限制技術是有用的。本發(fā)明方法的一個重要方面是治療組合物中組分的相容性。例如，將過敏原和IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑吸附到含鋁材料上提供了過敏原的延長的呈遞連同Th2-型佐劑的效果，但是問題是一種或多種抑制劑的延遲釋放是否足以在過敏原呈遞期間有效抑制IL-4-和IL-13-介導途徑。將抑制劑摻入到快速降解聚合物中提供了更好的機會以實現(xiàn)在過敏原呈遞期間對IL-4-和IL-13-介導途徑的有效抑制。因此，這兩種技術的組合比任一種單獨的技術更有可能保證較好的治療效果。類似的考慮適用于油包水或水包油乳劑作為IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的擴散限制技術的使用，因為抑制劑從這種乳劑釋放的動力學可能不足以滿足本發(fā)明方法的需要。但是，生物可降解聚合物具有潛力以提供足以滿足本發(fā)明方法需要的延長的過敏原呈遞和IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的持續(xù)釋放。近期的研究已證明與抗原一同包埋在生物可降解水凝膠中的可溶性佐劑是引發(fā)免疫應答的強有力的組合物。使用由MPEG-PLGA組成的二嵌段共聚物進行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和GM-SCF的水凝膠共遞送，可能引發(fā)高HBsAg-特異性抗體和T-輔助細胞應答，甚至是在由于其H-2單體型對現(xiàn)有的HBsAg疫苗不應答的小鼠品系中(Chou等，2010)。
[0086]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，疫苗組合物包含生物可降解熱膠凝聚合物，所述生物可降解熱膠凝聚合物含有一種或多種部分或完全吸附到含鋁佐劑上的過敏原或者過敏原提取物，以及一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑。通過在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合制備該組合物。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0087]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑和alum-吸附的過敏原(或過敏原提取物)在同一部位，但作為單獨的制備物注射。聚合物復合體在注射部位膠凝化之后，將alum-吸附的過敏原(或過敏原提取物)注射到凝膠的聚合物復合體附近。所述聚合物復合體包含生物可降解的熱膠凝聚合物和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑，并且通過在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合來制備。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)聚合物復合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0088]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，疫苗組合物包含生物可降解熱膠凝聚合物，該生物可降解熱膠凝聚合物含有一種或多種與由基于角鯊烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)組成的佐劑或水溶性聚磷腈聚合物預混的過敏原或過敏原提取物，和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑。通過在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合制備該組合物。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復 合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0089]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑和包埋在Montanide乳劑中或與水溶性聚磷腈聚合物混合的過敏原(或過敏原提取物)在同一部位，但以單獨的制備物注射。聚合物復合體在注射部位膠凝化之后，將包埋在Montanide乳劑中或與水溶性聚磷腈聚合物混合的過敏原(或過敏原提取物)注射到膠凝化的聚合物復合體附近。所述聚合物復合體包含生物可降解的熱膠凝聚合物和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑，并且通過在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合來制備。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0090]在本發(fā)明的又一優(yōu)選的實施方案中，疫苗組合物包含生物可降解熱膠凝聚合物，所述生物可降解熱膠凝聚合物含有一種或多種過敏原或過敏原提取物、一種或多種引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應答的可溶性佐劑(例如GM-CSF)、和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑。通過在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合制備該組合物。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0091]IX.治療方法
如本文所使用的，對蛋白質(zhì)過敏原敏感的個體的T細胞應答的降低或改變被定義為在個體中對蛋白質(zhì)過敏原的癥狀的減少，如通過標準臨床操作確定(參見例如Brit.Med.J.1990; 302: 265)。如本文中所提及的，對過敏原癥狀的減少包括在使用如本文所述的多肽進行的治療方案之后，個體對于過敏原的過敏反應的任何減少。這種癥狀上的減少可以主觀確定(例如患者在暴露于過敏原時感覺更舒適)，或者臨床確定，例如進行標準皮膚測試。
[0092]為進行免疫治療，包含一種或多種過敏原、一種或多種佐劑、一種或多種IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑和介導這種抑制劑的延長性遞送的基質(zhì)的本發(fā)明的疫苗組合物，以多個公開的免疫治療方案中所定義的時間間隔重復施用。疫苗組合物中一種或多種過敏原的劑量逐漸增加到有效減少個體對一種或多種過敏原的過敏反應的程度。在具體實施方案中，未包埋的IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑可以和疫苗組合物共同施用以增強施用部位的抑制效果。施用途徑的優(yōu)選實施例包括但不限于皮膚內(nèi)和皮下施用?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最佳的治療反應。例如，可以每天進行幾次分次劑量的施用。
[0093]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，應用聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑和alum-吸附的過敏原以用于免疫治療。首先，皮下注射含有一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導途徑抑制劑的生物可降解熱膠凝聚合物溶液。聚合物包埋的抑制劑的量取決于生物可降解熱膠凝聚合物的釋放動力學，且被調(diào)整為確保在3-5天的時間階段中進行治療有效劑量的連續(xù)釋放的水平。在第二步中，在膠凝化的聚合物復合體的部位皮下注射alum-吸附的過 敏原。alum-吸附的過敏原的量將根據(jù)例如個體對一種或多種過敏原的敏感度、個體年齡、性別和體重、組合物在個體中誘導對一種或多種過敏原的耐受的能力這些因素的不同而不同。在隨后的步驟中，首先注射聚合物包埋的抑制劑，然后在膠凝化的聚合物復合體部位注射alum-吸附的過敏原。雖然聚合物包埋的抑制劑的量保持不變，alum-吸附的過敏原的量逐漸增加到有效減少個體對過敏原的過敏反應的程度。聚合物包埋的抑制劑和alum-吸附的過敏原以多個公開的免疫治療方案中定義的時間間隔重復施用，直到實現(xiàn)過敏原耐受。
[0094]治療有效劑量的確定在本領域技術人員的能力范圍之內(nèi)。治療有效劑量可以最初在動物模型，通常是小鼠、大鼠、兔、狗、豬或非人靈長動物中進行估計。動物模型還可以用于確定合適的施用濃度范圍和施用途徑。這些信息然后可以用于確定人中的施用有效劑量和施用途徑。
[0095]Z藥物制劑
在一個實施方案中，疫苗組合物被摻入到適合于施用的藥物組合物中。這種組合物典型地包含疫苗組合物和藥學可接受的載體。如本文所使用的，“藥學可接受的載體”意在包括任何的和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌試劑、等滲系統(tǒng)等，它們與疫苗組合物和藥物施用(pharmaceutical administrat1n)的組分相容。這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領域是熟知的。補充的活性化合物也可以摻入到所述組合物中。
[0096]用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸液可以包括下述組分:無菌稀釋劑例如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙烯醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶劑，抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑例如乙二胺四乙酸，緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)毒性的試劑例如氯化鈉或右旋葡萄糖。可以用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲試劑，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。組合物應當是易于注射的流體?？梢岳缤ㄟ^使用包衣例如卵磷脂，通過在分散的情況下保持所需的粒徑以及通過使用表面活性劑保持適當?shù)牧鲃有?。組合物在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且其保存必須能抵抗微生物例如細菌和真菌的污染作用。可以通過各種抗細菌和抗真菌試劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酹、抗壞血酸、thimoseral等實現(xiàn)對微生物作用的預防。在所有的情況下，組合物必須是無菌的。無菌注射液可以通過過濾滅菌制備。制備物可以封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是由其之前的無菌過濾溶液通過真空干燥和凍干產(chǎn)生活性成分加任何其它所需成分的粉末。實際上，應當記住鋁吸附疫苗對冷凍敏感，因此不能凍干。
[0097]引用的并且通過引用的方式合并入本文的參考文獻
【權利要求】
1.藥物組合物，其由一種或多種制備物組成，且包含生理學有效劑量的至少一種IL-4和/或IL-13抑制劑和至少一種過敏原，以及基質(zhì)，其中至少所述抑制劑是溶解的或包埋于所述基質(zhì)中，或者至少所述抑制劑包被或吸附于所述基質(zhì)上，其中選擇所述基質(zhì)以使得所述抑制劑能夠延長性釋放。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述抑制劑選自拮抗性IL-4和/或IL-13衍生物、對IL-4和/或IL-13和/或它們的前體具有特異性的可溶性細胞因子受體構建體、對IL-4和/或IL-13和/或它們的前體和/或它們的受體具有特異性的單克隆抗體、這些抗體的結合片段、對IL-4和/或IL-13和/或它們的前體和/或它們的受體具有特異性的蛋白質(zhì)構建體以及對IL-4和/或IL-13和/或它們的前體和/或它們的受體具有特異性的適配體組成的組。
3.根據(jù)權利要求1或2的組合物，其中包含至少兩種不同的抑制劑，其中至少一種抑制劑抑制IL-4且至少一種其它抑制劑抑制IL-13，或者其中包含至少一種抑制IL-4和IL-13二者的抑制劑。
4.根據(jù)權利要求1-3之一的組合物，其中所述抑制劑具有小于7天的血漿半衰期，優(yōu)選小于I天，最優(yōu)選小于6或5個小時。
5.根據(jù)權利要求1-4之一的組合物，其中所述抑制劑是具有一至三個突變的人IL-4突變體，優(yōu)選在位置R121、Y124和S125的至少一個。
6.根據(jù)權利要求1-5之一的組合物，其中所述基質(zhì)是生物可降解的或非生物降解的有機聚合物，優(yōu)選生物可降解的，更優(yōu)選熱膠凝的，特別是選自基于苯乙烯-異丁烯的嵌段共聚物、烯烴聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚環(huán)氧丙烷(PPO)、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙烯丙 烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯(poly(ethylene teraphthalate))、聚氨酯、聚脲、娃橡膠、聚酰胺、聚碳酸酯、聚醒、天然橡膠、聚酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物乙烯乙酸乙烯酯、聚原酸酯、聚亞胺基碳酸酯、脂肪族聚碳酸酯、聚己酸內(nèi)酯(PCL)、聚-D，L-乳酸(PDLLA)、聚-L-乳酸(PLLA)、所述乳酸的丙交酯、聚磷腈聚環(huán)氧乙燒、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET) (polyethylene teraphtholate)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、PEBAX、Nylon、聚原酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、白蛋白、單甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)或上述任一種的共聚物或混合物，包括聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)、L-丙交酯和D, L-丙交酯的共聚物、由MPEG和PCL，MPEG和(PCL_ran_PLLA)，MPEG和PLGA組成的二嵌段共聚物、由PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA-PEG，PEG-PCL-PEG組成的三嵌段共聚物、由PEO和PLLA組成的二嵌段和三嵌段共聚物、泊洛沙姆。
7.根據(jù)權利要求6的組合物，其中所述聚合物是熱膠凝的，且其中高于其開始膠凝的膠凝溫度在20°C和40°C之間，優(yōu)選在25°C和30°C之間。
8.根據(jù)權利要求6或7之一的組合物，其中在體內(nèi)環(huán)境中聚合物90重量-%的降解和/或抑制劑從聚合物中90重量-%的釋放在1-10天內(nèi)完成，優(yōu)選在1-2天內(nèi)完成。
9.根據(jù)權利要求1-8之一的組合物，其中另外包含佐劑，其中所述佐劑優(yōu)選選自脂質(zhì)體、鋁鹽、Montanide乳劑、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、基于胰島素的佐劑、病毒顆粒和聚磷腈，最優(yōu)選選自磷酸鋁或氫氧化鋁凝膠。
10.根據(jù)權利要求1-5之一的組合物，其中所述基質(zhì)是根據(jù)權利要求9的佐劑。
11.根據(jù)權利要求1-10之一的組合物，其中:所有組分混合作為單一的制備物，或者 所述基質(zhì)和所述抑制劑混合作為第一制備物，且所述過敏原和佐劑混合作為第二制備物。
12.根據(jù)權利要求1-11之一的組合物，其中所述組合物制備為適合于用于通過皮下注射施用的蓋倫制劑。
13.根據(jù)權利要求1-12之一的組合物在制備用于治療免疫病癥，特別是過敏反應的藥物中的用 途，優(yōu)選其中所述藥物以治療有效劑量施用給需要治療免疫病癥的人。
14.制造根據(jù)權利要求1-12之一的藥物組合物的方法，其中所述組分以生理有效量彼此混合，以獲得根據(jù)權利要求11的組合物，其中任選地蓋侖化合物與所述制劑另外混合。
15.用于治療免疫病癥，特別是過敏反應的方法，其中根據(jù)權利要求1-12之一的組合物以治療有效劑量施用給需要治療的人。
【文檔編號】A61K9/00GK104039349SQ201280057730
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年11月23日 優(yōu)先權日:2011年11月23日
【發(fā)明者】T.格倫瓦爾德, C.B.施密特-韋伯 申請人:Pls設計有限責任公司, 慕尼黑赫姆霍茲環(huán)境和健康研究中心有限責任公司